В Ситу обнаружения Аутореактивных CD4 Т-клеток в мозг и сердце Использование главного комплекса гистосовместимости Dextramers комплекс класса II
Summary
Протокол обнаружить самореактивные лимфоциты CD4 в мозг и сердце путем прямого окрашивания главного комплекса гистосовместимости dextramers класс II был описан в настоящем докладе. Для всестороннего анализа, надежный способ перечислить частоты антиген-специфических CD4 + Т-клеток в месте также предназначен.
Abstract
This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-α (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the ‘Z’ serial images.
Introduction
Использование главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса II тетрамерами обнаружения антиген-специфических CD4 Т-клеток был вызов 1-7. Для повышения чувствительности обнаружения тетрамеров МНС класса II, исследовательская группа создала тетрамеров нового поколения, предназначенные "dextramers" 8. Dextramers содержать декстран магистралей, в которой множество стрептавидином флуорофор фрагменты конъюгируют таким образом, что несколько пептидов привязи, биотинилированные мономеры МНС могут быть присоединены к одной молекуле декстрана 9. Таким образом, крупные агрегаты МНС dextramers, которые содержат несколько комплексов МНС-пептид может взаимодействовать с несколькими рецепторами Т-клеток (TCR).
Эта группа недавно генерируется dextramers для различных аутоантигены и показали, что чувствительность обнаружения dextramers был примерно в пять раз больше, чем тетрамеры 8. Экспериментальные системы включают экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAЕ) индуцируют протеолипидного белка (PLP) 139-151 у мышей SJL; EAE индуцировали миелина олигодендроцитов (MOG гликопротеина) 35-55 в C57BL / 6 мышей; и экспериментальный аутоиммунный миокардит (EAM), индуцированный с сердечной миозина тяжелой цепи-α (MyHC) 334-352 в / J мышей. Это исследование демонстрирует использование PLP 139-151 – и MyHC 334-352 dextramers обнаружить антиген-специфических CD4 Т-клеток в месте со спецификой путем разработки прямое протокол окрашивания, тем самым устраняя необходимость усиливать сигналы от использования флуорофорные антитела, подход обычно используют с использованием тетрамеров. Кроме того, комплексный метод оценки тканей также был разработан, чтобы надежно перечислить частоты антиген-специфических Т-клеток CD4 на месте 10. Обнаружение антиген-специфических Т-клеток в месте допускает разграничение событий, вызванных конкретных антигенных стимулов от тех, которые вызваны активацией наблюдателем. Аналогичным образом, в технику Ситу также ProvidES возможности отслеживать кинетику антиген-специфических Т-клеток инфильтратов в целевых органах.
Protocol
Representative Results
Discussion
В отличие от I тетрамеров МНС класса, использование тетрамеров МНС класса II для обычных приложений продолжает оставаться сложной, особенно для перечисления частоты предшественники низкоаффинных аутореактивных лимфоцитов CD4, отчасти из-за их активации зависимости 6,15-17. В последн…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Американской ассоциации сердца и Детского кардиомиопатии Foundation (SDG2462390204001) и Национальных Институтов Здоровья (HL114669). CM является получателем докторской исследования стипендий гранта, предоставленного Миокардит фонда, Нью-Джерси.
Materials
| CFA | Sigma Aldrich, St Louis, MO | 5881 | Store at 4οC |
| MTB H37Rv extract | Difco Laboratories, Detroit, MI | 231141 | Store at 4οC |
| PT | List Biologicals Laboratories, Campbell, CA | 181 | Store at 4οC |
| 1x PBS | Corning, Manassas, VA | 21-040-CV | Store at 4οC |
| Female A/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 646 | |
| Female SJL/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 686 | |
| Leur-lok sterile 1 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Leur-lok sterile 3 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309657 | |
| Sterile needle, 18 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305195 | |
| Sterile needle, 27 1/2 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305109 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH | MX5311L | |
| Kerlix gauze bandage rolls | Covidien, Mansfield, MA | 6720 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34155 | |
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega corporation, Madison, WI | V2111 | |
| Immunopure normal goat serum | Thermo Scientific, Waltham, MA | 31873 | Store at -20 οC |
| Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye | eBioscience, San Diego, CA | 12004185 | Store at 4οC |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 19202 | Store at 4οC |
| Faramount Aqueous Mounting Medium | Dako, Carpinteria, CA | 10073021 | |
| Conical tube (15ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352099 | |
| Conical tube (50 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352070 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | BD Biosciences, San Jose, CA | 356775 | |
| Water color #2 brushes | Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY | 73502 | |
| Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 1255010 | |
| Premium Cover glass, 22 x 22-1 | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12548B | |
| Disposable deep base mold histology cassettes | Laboratory prodcust, Rochester, NY | M-475-10 | |
| Loctite Super glue | Henkel Corporation, Westlake, OH | 1471879 | |
| Razor blades | Gillette SuperSilver | ||
| Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4οC | |
| PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4οC | |
| MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4οC | ||
| MHC class II/IAk Myhc 334-352 or or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4οC | ||
| Dextran conjugated SA-APC | Immundex, Copenhagen, Demark | Store at 4οC | |
| Sterile surgical scissors and forceps | INOX tool Corporation | ||
| Micro oven | GE Healthcare, Pittsuburgh, PA | ||
| Leica VT 1200 Vibratome | Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL | ||
| Olympus BX 60 Laser scanning confocal microscope | Olympus America, Inc. Center Valley, PA | ||
| Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope | Nikon Inc. Melville, NY |
References
- Cecconi, V., Moro, M., Del Mare, ., Dellabona, S., P, G., Casorati, Use of MHC class II tetramers to investigate CD4+ T cell responses: problems and solutions. Cytometry A. 73 (11), 1010-1018 (2008).
- Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E. Present difficulties and future promise of MHC multimers in autoimmune exploration. Curr Opin Immunol. 12, 670-675 (2000).
- Kwok, W. W., Ptacek, N. A., Liu, A. W., Buckner, J. H. Use of class II tetramers for identification of CD4+ T cells. J Immunol Methods. 268, 71-81 (2002).
- Landais, E., et al. New design of MHC class II tetramers to accommodate fundamental principles of antigen presentation. J Immunol. 183, 7949-7957 (2009).
- Nepom, G. T. MHC class II tetramers. J Immunol. 188, 2477-2482 (2012).
- Vollers, S. S., Stern, L. J. Class II major histocompatibility complex tetramer staining: progress, problems, and prospects. Immunology. 123, 305-313 (2008).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
- Massilamany, C., Upadhyaya, B., Gangaplara, A., Kuszynski, C., Reddy, J. Detection of autoreactive CD4 T cells using major histocompatibility complex class II dextramers. BMC Immunol. 12, 1471-2172 (2011).
- Batard, P., et al. Dextramers: new generation of fluorescent MHC class I/peptide multimers for visualization of antigen-specific CD8+ T cells. J Immunol Methods. 310 (1-2), 136-148 (2006).
- Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS One. 9 (1), (2014).
- Massilamany, C., Khalilzad-Sharghi, V., Gangaplara, A., Steffen, D., Othman, S. F., Reddy, J. Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse. J Vis Exp. (88), e51654 (2014).
- Massilamany, C., Steffen, D., Reddy, J. An epitope from Acanthamoeba castellanii that cross-react with proteolipid protein 139-151-reactive T cells induces autoimmune encephalomyelitis in SJL mice. J Neuroimmunol. 219 (1-2), 17-24 (2010).
- Donermeyer, D. L., Beisel, K. W., Allen, P. M., Smith, S. C. Myocarditis-inducing epitope of myosin binds constitutively and stably to I-Ak on antigen-presenting cells in the heart. J Exp Med. 182 (5), 1291-1300 (1995).
- Liao, L., Sindhwani, R., Leinwand, L., Diamond, B., Factor, S. Cardiac alpha-myosin heavy chains differ in their induction of myocarditis. Identification of pathogenic epitopes. J Clin Invest. 92 (6), 2877-2882 (1993).
- Cameron, T. O., Cochran, J. R., Yassine-Diab, B., Sekaly, R. P., Stern, L. J. Cutting edge: detection of antigen-specific CD4+ T cells by HLA-DR1 oligomers is dependent on the T cell activation state. J Immunol. 166 (2), 741-745 (2001).
- Novak, E. J., et al. Activated human epitope-specific T cells identified by class II tetramers reside within a CD4high, proliferating subset. Int Immunol. 13 (6), 799-806 (2001).
- Reddy, J., et al. Detection of autoreactive myelin proteolipid protein 139-151-specific T cells by using MHC II (IAs) tetramers. J Immunol. 170 (2), 870-877 (2003).
- Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11 (2004).
