Summary

В Ситу обнаружения Аутореактивных CD4 Т-клеток в мозг и сердце Использование главного комплекса гистосовместимости Dextramers комплекс класса II

Published: August 01, 2014
doi:

Summary

Протокол обнаружить самореактивные лимфоциты CD4 в мозг и сердце путем прямого окрашивания главного комплекса гистосовместимости dextramers класс II был описан в настоящем докладе. Для всестороннего анализа, надежный способ перечислить частоты антиген-специфических CD4 + Т-клеток в месте также предназначен.

Abstract

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-α (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the ‘Z’ serial images.

Introduction

Использование главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса II тетрамерами обнаружения антиген-специфических CD4 Т-клеток был вызов 1-7. Для повышения чувствительности обнаружения тетрамеров МНС класса II, исследовательская группа создала тетрамеров нового поколения, предназначенные "dextramers" 8. Dextramers содержать декстран магистралей, в которой множество стрептавидином флуорофор фрагменты конъюгируют таким образом, что несколько пептидов привязи, биотинилированные мономеры МНС могут быть присоединены к одной молекуле декстрана 9. Таким образом, крупные агрегаты МНС dextramers, которые содержат несколько комплексов МНС-пептид может взаимодействовать с несколькими рецепторами Т-клеток (TCR).

Эта группа недавно генерируется dextramers для различных аутоантигены и показали, что чувствительность обнаружения dextramers был примерно в пять раз больше, чем тетрамеры 8. Экспериментальные системы включают экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAЕ) индуцируют протеолипидного белка (PLP) 139-151 у мышей SJL; EAE индуцировали миелина олигодендроцитов (MOG гликопротеина) 35-55 в C57BL / 6 мышей; и экспериментальный аутоиммунный миокардит (EAM), индуцированный с сердечной миозина тяжелой цепи-α (MyHC) 334-352 в / J мышей. Это исследование демонстрирует использование PLP 139-151 – и MyHC 334-352 dextramers обнаружить антиген-специфических CD4 Т-клеток в месте со спецификой путем разработки прямое протокол окрашивания, тем самым устраняя необходимость усиливать сигналы от использования флуорофорные антитела, подход обычно используют с использованием тетрамеров. Кроме того, комплексный метод оценки тканей также был разработан, чтобы надежно перечислить частоты антиген-специфических Т-клеток CD4 на месте 10. Обнаружение антиген-специфических Т-клеток в месте допускает разграничение событий, вызванных конкретных антигенных стимулов от тех, которые вызваны активацией наблюдателем. Аналогичным образом, в технику Ситу также ProvidES возможности отслеживать кинетику антиген-специфических Т-клеток инфильтратов в целевых органах.

Protocol

Заявление по этике: Все животные процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами для уходу и использованию лабораторных животных и одобрены Университета Небраска-Линкольн, Lincoln, NE. 1. Индукция EAE Для индукции ЕАЕ, подготовить пептид…

Representative Results

В этом докладе, в обнаружении месте антигенспецифических, аутореактивных лимфоцитов CD4 путем прямого окрашивания dextramers МНС класса II описан. Свежесрезанных мозговые участки были получены от мышей EAE и окрашивали коктейлей, содержащих PLP 139-151 (специфические) или TMEV 70-86 (управлен?…

Discussion

В отличие от I тетрамеров МНС класса, использование тетрамеров МНС класса II для обычных приложений продолжает оставаться сложной, особенно для перечисления частоты предшественники низкоаффинных аутореактивных лимфоцитов CD4, отчасти из-за их активации зависимости 6,15-17. В последн…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Американской ассоциации сердца и Детского кардиомиопатии Foundation (SDG2462390204001) и Национальных Институтов Здоровья (HL114669). CM является получателем докторской исследования стипендий гранта, предоставленного Миокардит фонда, Нью-Джерси.

Materials

CFA Sigma Aldrich, St Louis, MO 5881 Store at 4οC
MTB  H37Rv extract  Difco Laboratories, Detroit, MI 231141 Store at 4οC
PT List Biologicals Laboratories, Campbell, CA 181 Store at 4οC
1x PBS  Corning, Manassas, VA 21-040-CV Store at 4οC
Female A/J mice  Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 646
Female SJL/J mice Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 686
Leur-lok sterile 1 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309628
Leur-lok sterile 3 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309657
Sterile needle, 18 G BD, Franklin Lakes, NJ 305195
Sterile needle, 27 1/2 G BD, Franklin Lakes, NJ 305109
3-way stopcock  Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH MX5311L
Kerlix gauze bandage rolls  Covidien, Mansfield, MA 6720
Kimwipes Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 34155
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade Promega corporation, Madison, WI V2111
Immunopure normal goat serum Thermo Scientific, Waltham, MA 31873 Store at -20 οC
Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye eBioscience, San Diego, CA  12004185 Store at 4οC
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 19202 Store at 4οC
Faramount Aqueous Mounting Medium Dako, Carpinteria, CA 10073021
Conical tube (15ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352099
Conical tube (50 ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352070
24-well flat bottomed tissue culture plates BD Biosciences, San Jose, CA 356775
Water color #2 brushes Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY 73502
Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 1255010
Premium Cover glass, 22 x 22-1 Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12548B
Disposable deep base mold histology cassettes Laboratory prodcust, Rochester, NY M-475-10
Loctite Super glue Henkel Corporation, Westlake, OH 1471879
Razor blades Gillette SuperSilver
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4οC
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4οC
MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye Store at 4οC
MHC class II/IAk Myhc 334-352 or  or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye Store at 4οC
Dextran conjugated SA-APC  Immundex, Copenhagen, Demark Store at 4οC
Sterile surgical scissors and forceps INOX tool Corporation
Micro oven GE Healthcare, Pittsuburgh, PA
Leica VT 1200 Vibratome Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL
Olympus BX 60  Laser scanning confocal microscope Olympus America, Inc. Center Valley, PA
Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope Nikon Inc. Melville, NY

References

  1. Cecconi, V., Moro, M., Del Mare, ., Dellabona, S., P, G., Casorati, Use of MHC class II tetramers to investigate CD4+ T cell responses: problems and solutions. Cytometry A. 73 (11), 1010-1018 (2008).
  2. Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E. Present difficulties and future promise of MHC multimers in autoimmune exploration. Curr Opin Immunol. 12, 670-675 (2000).
  3. Kwok, W. W., Ptacek, N. A., Liu, A. W., Buckner, J. H. Use of class II tetramers for identification of CD4+ T cells. J Immunol Methods. 268, 71-81 (2002).
  4. Landais, E., et al. New design of MHC class II tetramers to accommodate fundamental principles of antigen presentation. J Immunol. 183, 7949-7957 (2009).
  5. Nepom, G. T. MHC class II tetramers. J Immunol. 188, 2477-2482 (2012).
  6. Vollers, S. S., Stern, L. J. Class II major histocompatibility complex tetramer staining: progress, problems, and prospects. Immunology. 123, 305-313 (2008).
  7. Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
  8. Massilamany, C., Upadhyaya, B., Gangaplara, A., Kuszynski, C., Reddy, J. Detection of autoreactive CD4 T cells using major histocompatibility complex class II dextramers. BMC Immunol. 12, 1471-2172 (2011).
  9. Batard, P., et al. Dextramers: new generation of fluorescent MHC class I/peptide multimers for visualization of antigen-specific CD8+ T cells. J Immunol Methods. 310 (1-2), 136-148 (2006).
  10. Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS One. 9 (1), (2014).
  11. Massilamany, C., Khalilzad-Sharghi, V., Gangaplara, A., Steffen, D., Othman, S. F., Reddy, J. Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse. J Vis Exp. (88), e51654 (2014).
  12. Massilamany, C., Steffen, D., Reddy, J. An epitope from Acanthamoeba castellanii that cross-react with proteolipid protein 139-151-reactive T cells induces autoimmune encephalomyelitis in SJL mice. J Neuroimmunol. 219 (1-2), 17-24 (2010).
  13. Donermeyer, D. L., Beisel, K. W., Allen, P. M., Smith, S. C. Myocarditis-inducing epitope of myosin binds constitutively and stably to I-Ak on antigen-presenting cells in the heart. J Exp Med. 182 (5), 1291-1300 (1995).
  14. Liao, L., Sindhwani, R., Leinwand, L., Diamond, B., Factor, S. Cardiac alpha-myosin heavy chains differ in their induction of myocarditis. Identification of pathogenic epitopes. J Clin Invest. 92 (6), 2877-2882 (1993).
  15. Cameron, T. O., Cochran, J. R., Yassine-Diab, B., Sekaly, R. P., Stern, L. J. Cutting edge: detection of antigen-specific CD4+ T cells by HLA-DR1 oligomers is dependent on the T cell activation state. J Immunol. 166 (2), 741-745 (2001).
  16. Novak, E. J., et al. Activated human epitope-specific T cells identified by class II tetramers reside within a CD4high, proliferating subset. Int Immunol. 13 (6), 799-806 (2001).
  17. Reddy, J., et al. Detection of autoreactive myelin proteolipid protein 139-151-specific T cells by using MHC II (IAs) tetramers. J Immunol. 170 (2), 870-877 (2003).
  18. Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
  19. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
  20. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11 (2004).

Play Video

Cite This Article
Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., Elowsky, C., Li, Q., Zhou, Y., Reddy, J. In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers. J. Vis. Exp. (90), e51679, doi:10.3791/51679 (2014).

View Video