באתרו איתור של תאים אוטוריאקטיבים T מסוג CD4 במוח ולב באמצעות מחלקה מורכבת השני Dextramers סרן histocompatibility
Summary
הפרוטוקול כדי לזהות תאי T מסוג CD4 עצמי תגובתי במוח ולב על ידי צביעה ישירה עם הכיתה השנייה dextramers המורכב histocompatibility הגדול תואר בדוח זה. לניתוח מקיף, שיטה אמינה כדי למנות את התדרים של תאים מסוג CD4 + T אנטיגן הספציפי באתר היא גם המציאה.
Abstract
This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-α (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the ‘Z’ serial images.
Introduction
השימוש מורכב histocompatibility הגדול (MHC) בכיתה השנייה tetramers לזיהוי של תאי T מסוג CD4 אנטיגן ספציפי כבר אתגר 1-7. כדי לשפר את רגישות זיהוי של MHC הכיתה השני tetramers, צוות המחקר יצר tetramers של הדור הבא, המיועד "dextramers" 8. Dextramers להכיל עמוד השדרה dextran בי moieties streptavidin-fluorophore המרובים מצומדת, כך שיכולים להיות מצורפים כמה, מונומרים MHC biotinylated פפטיד קשור למולקולת dextran אחד 9. לפיכך, אגרגטים גדולים של dextramers MHC שמכיל כמה מתחמי MHC-פפטיד יכולים לקיים אינטראקציה עם קולטנים מרובים תא T (TCRs).
קבוצה זו נוצרה בזמן אחרון dextramers לאנטיגנים עצמיים שונים והוכיחה כי רגישות זיהוי של dextramers הייתה כ פי חמש יותר מאשר tetramers 8. המערכות הניסיוניות כוללות Encephalomyelitis אוטואימוניות ניסיוני (EAE) מושרה עם חלבון proteolipid (PLP) 139-151 בעכברי SJL; EAE מושרה עם גליקופרוטאין oligodendrocyte המיאלין (MOG) 35-55 בC57Bl / 6 עכברים; ודלקת שריר הלב ניסויי אוטואימוניות (EAM) מושרה עם שרשרת α שרירן לב הכבד (Myhc) 334-352 בעכברים / י. מחקר זה מדגים את השימוש בPLP 139-151 – וMyhc 334-352 dextramers כדי לזהות תאי T מסוג CD4 אנטיגן ספציפי באתר עם סגוליות ידי פיתוח פרוטוקול מכתים ישיר, ובכך מבטל את הצורך להגביר את האותות מבאמצעות נוגדני fluorophore, מתקרב מועסק בדרך כלל עם השימוש של tetramers. בנוסף, שיטה מקיפה של הערכת רקמות יש גם המציאה כדי למנות באופן מהימן את התדרים של תאי T מסוג CD4 אנטיגן ספציפי באתר 10. זיהוי של תאי T אנטיגן ספציפי באתר מאפשר תיחום של אירועים שנגרמו על ידי גירויי אנטיגני ספציפיים מאלה הנגרמים על ידי הפעלה עובר אורח. כמו כן, הטכניקה באתרו גם providהזדמנויות es כדי לעקוב אחר קינטיקה של חדירות תא T אנטיגן ספציפי באיברי המטרה.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלא כמוני tetramers כיתת MHC, השימוש בMHC הכיתה השני tetramers ליישומים שיגרתי ממשיך להיות מאתגר, במיוחד כדי למנות את תדרי המבשר של תאים בעלת זיקה נמוכה אוטוריאקטיבים T מסוג CD4, נובעים בחלקו תלות ההפעלה שלהם 6,15-17. לאחרונה, בעיה זו נעקפה על ידי יצירת הדור הבא של tetramers, שנקרא "…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקאי והקרן לילדים קרדיומיופתיה (SDG2462390204001), והמכון הלאומי לבריאות (HL114669). CM הוא נמען של מענק מלגת מחקר פוסט דוקטורט הוענק על ידי קרן דלקת שריר הלב, ניו ג'רזי.
Materials
| CFA | Sigma Aldrich, St Louis, MO | 5881 | Store at 4οC |
| MTB H37Rv extract | Difco Laboratories, Detroit, MI | 231141 | Store at 4οC |
| PT | List Biologicals Laboratories, Campbell, CA | 181 | Store at 4οC |
| 1x PBS | Corning, Manassas, VA | 21-040-CV | Store at 4οC |
| Female A/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 646 | |
| Female SJL/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 686 | |
| Leur-lok sterile 1 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Leur-lok sterile 3 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309657 | |
| Sterile needle, 18 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305195 | |
| Sterile needle, 27 1/2 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305109 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH | MX5311L | |
| Kerlix gauze bandage rolls | Covidien, Mansfield, MA | 6720 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34155 | |
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega corporation, Madison, WI | V2111 | |
| Immunopure normal goat serum | Thermo Scientific, Waltham, MA | 31873 | Store at -20 οC |
| Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye | eBioscience, San Diego, CA | 12004185 | Store at 4οC |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 19202 | Store at 4οC |
| Faramount Aqueous Mounting Medium | Dako, Carpinteria, CA | 10073021 | |
| Conical tube (15ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352099 | |
| Conical tube (50 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352070 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | BD Biosciences, San Jose, CA | 356775 | |
| Water color #2 brushes | Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY | 73502 | |
| Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 1255010 | |
| Premium Cover glass, 22 x 22-1 | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12548B | |
| Disposable deep base mold histology cassettes | Laboratory prodcust, Rochester, NY | M-475-10 | |
| Loctite Super glue | Henkel Corporation, Westlake, OH | 1471879 | |
| Razor blades | Gillette SuperSilver | ||
| Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4οC | |
| PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4οC | |
| MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4οC | ||
| MHC class II/IAk Myhc 334-352 or or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4οC | ||
| Dextran conjugated SA-APC | Immundex, Copenhagen, Demark | Store at 4οC | |
| Sterile surgical scissors and forceps | INOX tool Corporation | ||
| Micro oven | GE Healthcare, Pittsuburgh, PA | ||
| Leica VT 1200 Vibratome | Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL | ||
| Olympus BX 60 Laser scanning confocal microscope | Olympus America, Inc. Center Valley, PA | ||
| Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope | Nikon Inc. Melville, NY |
References
- Cecconi, V., Moro, M., Del Mare, ., Dellabona, S., P, G., Casorati, Use of MHC class II tetramers to investigate CD4+ T cell responses: problems and solutions. Cytometry A. 73 (11), 1010-1018 (2008).
- Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E. Present difficulties and future promise of MHC multimers in autoimmune exploration. Curr Opin Immunol. 12, 670-675 (2000).
- Kwok, W. W., Ptacek, N. A., Liu, A. W., Buckner, J. H. Use of class II tetramers for identification of CD4+ T cells. J Immunol Methods. 268, 71-81 (2002).
- Landais, E., et al. New design of MHC class II tetramers to accommodate fundamental principles of antigen presentation. J Immunol. 183, 7949-7957 (2009).
- Nepom, G. T. MHC class II tetramers. J Immunol. 188, 2477-2482 (2012).
- Vollers, S. S., Stern, L. J. Class II major histocompatibility complex tetramer staining: progress, problems, and prospects. Immunology. 123, 305-313 (2008).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
- Massilamany, C., Upadhyaya, B., Gangaplara, A., Kuszynski, C., Reddy, J. Detection of autoreactive CD4 T cells using major histocompatibility complex class II dextramers. BMC Immunol. 12, 1471-2172 (2011).
- Batard, P., et al. Dextramers: new generation of fluorescent MHC class I/peptide multimers for visualization of antigen-specific CD8+ T cells. J Immunol Methods. 310 (1-2), 136-148 (2006).
- Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS One. 9 (1), (2014).
- Massilamany, C., Khalilzad-Sharghi, V., Gangaplara, A., Steffen, D., Othman, S. F., Reddy, J. Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse. J Vis Exp. (88), e51654 (2014).
- Massilamany, C., Steffen, D., Reddy, J. An epitope from Acanthamoeba castellanii that cross-react with proteolipid protein 139-151-reactive T cells induces autoimmune encephalomyelitis in SJL mice. J Neuroimmunol. 219 (1-2), 17-24 (2010).
- Donermeyer, D. L., Beisel, K. W., Allen, P. M., Smith, S. C. Myocarditis-inducing epitope of myosin binds constitutively and stably to I-Ak on antigen-presenting cells in the heart. J Exp Med. 182 (5), 1291-1300 (1995).
- Liao, L., Sindhwani, R., Leinwand, L., Diamond, B., Factor, S. Cardiac alpha-myosin heavy chains differ in their induction of myocarditis. Identification of pathogenic epitopes. J Clin Invest. 92 (6), 2877-2882 (1993).
- Cameron, T. O., Cochran, J. R., Yassine-Diab, B., Sekaly, R. P., Stern, L. J. Cutting edge: detection of antigen-specific CD4+ T cells by HLA-DR1 oligomers is dependent on the T cell activation state. J Immunol. 166 (2), 741-745 (2001).
- Novak, E. J., et al. Activated human epitope-specific T cells identified by class II tetramers reside within a CD4high, proliferating subset. Int Immunol. 13 (6), 799-806 (2001).
- Reddy, J., et al. Detection of autoreactive myelin proteolipid protein 139-151-specific T cells by using MHC II (IAs) tetramers. J Immunol. 170 (2), 870-877 (2003).
- Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11 (2004).
