MHC kompleksi sınıf II dextramers ile direkt boyama ile beyin ve kalp kendinden reaktif CD4 T hücreleri algılamak için protokol bu raporda tarif edilmiştir. Kapsamlı bir analiz için in situ antijene özgü CD4 + T hücrelerinin frekansları numaralandırmak için güvenilir bir yöntem de planlanmaktadır.
This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-α (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the ‘Z’ serial images.
Majör histokompatibilite kompleksinin kullanımı antijene özgü CD4 T hücrelerinin saptanması için (MHC) sınıf II tetramerler bir sorun 1-7 olmuştur. MHC sınıf II tetramerler algılama hassasiyetini artırmak için, araştırma ekibi belirlenen nesil tetramers, "dextramers" 8 yarattı. Dextramers örneğin birkaç peptide gergin, biyotinile edilmiş monomerler, bir MHC molekülüne dekstran 9 bağlı olabilir birden fazla streptavidin-fluorofor kısımları konjüge edildiği dekstran omurgalar içerir. Böylece, birkaç MHC-peptid komplekslerini içeren MHC dextramers büyük agrega çok T hücre reseptörleri (TCRler) ile etkileşime girebilir.
Bu grup, son zamanlarda çeşitli self-antijenlerine dextramers üretilir ve dextramers algılama hassasiyeti tetramerleri, yaklaşık 8 den fazla beş kat olduğu gösterilmiştir. Deney Sistemleri deneysel otoimmün ensefalomiyelit içerir (EAE) proteolipid protein (PLP) SJL farelerinde 139-151 ile indüklenen; EAE miyelin oligodendrosit glikoprotein (MOG) C57BL / 6 farelerinde 35-55 ile indüklenen; ve deneysel otoimmün miyokardit (EAM), kardiyak miyosin ağır zincir-α (Myhc) A / J farelerinde 334-352 ile neden oldu. Bu çalışma, PLP 139-151 kullanımını gösterir – ve Myhc 334-352 böylece florofor antikorlar kullanılarak gelen sinyalleri yükseltmek için ihtiyacı ortadan kaldırarak, direkt bir boyama protokolü geliştirerek özgüllük ile in situ olarak antijene spesifik CD4 T hücrelerini tespit etmek için bir dextramers Yaygın bir yaklaşım tetramerleri kullanımı ile kullanılabilir. Buna ek olarak, doku değerlendirilmesi kapsamlı bir yöntem de güvenilir bir şekilde yerinde 10 antijene spesifik CD4 T hücrelerinin frekansları numaralandırmak için tasarlanmış edilmiştir. In situ olarak antijen-spesifik T hücrelerinin aktivasyonunun tespiti seyirci neden olduğu belirli antijenik uyarıcılarla neden olduğu olaylar çizimi izin verir. Benzer şekilde, in situ tekniği de providhedef organ içinde antijen-spesifik T hücresi sızıntılar kinetiğini takip etmek için fırsatlar es.
MHC sınıf I tetramerleri farklı olarak, rutin uygulamalar için MHC sınıf II tetramerleri kullanımı özellikle aktivasyon bağımlılık 6,15-17 kısmen nedeniyle düşük-yakınlık oto-reaktif CD4 T hücrelerinin, bir ön-madde frekansları numaralandırmak için, zor olmaya devam etmektedir. Son zamanlarda, bu sorun, PLP'ye 139-151, MOG 35-55 ve Myhc 334 gibi Otoantijenler, bir dizi için antijen-spesifik CD4 T hücreleri algılamak için bize izin ", dextramers" denilen tetramerler ne…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği ve Çocuk Kardiyomiyopati Vakfı (SDG2462390204001) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (HL114669) tarafından desteklenmiştir. CM Miyokardit Vakfı, NJ tarafından verilen doktora sonrası araştırma bursu hibe bir alıcı.
CFA | Sigma Aldrich, St Louis, MO | 5881 | Store at 4οC |
MTB H37Rv extract | Difco Laboratories, Detroit, MI | 231141 | Store at 4οC |
PT | List Biologicals Laboratories, Campbell, CA | 181 | Store at 4οC |
1x PBS | Corning, Manassas, VA | 21-040-CV | Store at 4οC |
Female A/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 646 | |
Female SJL/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 686 | |
Leur-lok sterile 1 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
Leur-lok sterile 3 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309657 | |
Sterile needle, 18 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305195 | |
Sterile needle, 27 1/2 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305109 | |
3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH | MX5311L | |
Kerlix gauze bandage rolls | Covidien, Mansfield, MA | 6720 | |
Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34155 | |
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega corporation, Madison, WI | V2111 | |
Immunopure normal goat serum | Thermo Scientific, Waltham, MA | 31873 | Store at -20 οC |
Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye | eBioscience, San Diego, CA | 12004185 | Store at 4οC |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 19202 | Store at 4οC |
Faramount Aqueous Mounting Medium | Dako, Carpinteria, CA | 10073021 | |
Conical tube (15ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352099 | |
Conical tube (50 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352070 | |
24-well flat bottomed tissue culture plates | BD Biosciences, San Jose, CA | 356775 | |
Water color #2 brushes | Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY | 73502 | |
Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 1255010 | |
Premium Cover glass, 22 x 22-1 | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12548B | |
Disposable deep base mold histology cassettes | Laboratory prodcust, Rochester, NY | M-475-10 | |
Loctite Super glue | Henkel Corporation, Westlake, OH | 1471879 | |
Razor blades | Gillette SuperSilver | ||
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4οC | |
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4οC | |
MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4οC | ||
MHC class II/IAk Myhc 334-352 or or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4οC | ||
Dextran conjugated SA-APC | Immundex, Copenhagen, Demark | Store at 4οC | |
Sterile surgical scissors and forceps | INOX tool Corporation | ||
Micro oven | GE Healthcare, Pittsuburgh, PA | ||
Leica VT 1200 Vibratome | Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL | ||
Olympus BX 60 Laser scanning confocal microscope | Olympus America, Inc. Center Valley, PA | ||
Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope | Nikon Inc. Melville, NY |