Summary

In-situ-Nachweis autoreaktiver CD4-T-Zellen in Gehirn und Herz Mit Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II Dextramers

Published: August 01, 2014
doi:

Summary

Das Protokoll zur selbst-reaktiven CD4-T-Zellen erkennen in Gehirn und Herz durch direkte Färbung mit Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II dextramers hat in diesem Bericht beschrieben. Für Analysen, ist eine zuverlässige Methode, um die Frequenzen von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen in situ aufzuzählen auch entwickelt.

Abstract

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-α (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the ‘Z’ serial images.

Introduction

Die Verwendung von Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Klasse II Tetramere zum Nachweis von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen war eine Herausforderung 1-7. Um die Nachweisempfindlichkeit von MHC-Klasse II Tetramere zu steigern, hat das Forschungsteam der nächsten Generation Tetramere, bezeichnet "dextramers" 8 erstellt. Dextramers enthalten Dextran-Backbones, in denen mehrere Streptavidin-Fluorophoreinheiten konjugiert sind, so dass mehrere Peptid-gebundenen, biotinylierten MHC-Monomere kann auf eine Dextranmolekül 9 befestigt werden. Somit können große Aggregate von MHC dextramers die mehrere MHC-Peptid-Komplexe enthalten, mit mehreren T-Zell-Rezeptoren (TCRs) interagieren.

Diese Gruppe zuletzt erzeugten dextramers für verschiedene Autoantigene und gezeigt, dass die Erfassungsempfindlichkeit der dextramers war ungefähr fünfmal mehr als 8 Tetramere. Die experimentellen Systemen gehören experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) mit Proteolipid-Protein (PLP) 139-151 in SJL-Mäusen induziert; EAE mit Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) 35-55 in C57BL / 6 Mäusen; und experimentellen autoimmunen Myokarditis (EAM) mit Herz Myosin-α (Myhc) 334-352 in A / J-Mäusen induziert. Diese Studie demonstriert die Verwendung von PLP 139-151 – 334-352 und Myhc dextramers um Antigen-spezifische CD4 + T-Zellen erkennen, in situ mit Spezifität durch die Entwicklung eines direkten Färbungsprotokoll, wodurch die Notwendigkeit, um die Signale unter Verwendung von Fluorophor-Antikörper verstärken eliminiert, eine Ansatz häufig mit der Verwendung von Tetrameren eingesetzt. Zusätzlich wurde ein umfassendes Verfahren zur Bewertung Gewebe auch entwickelt worden, um zuverlässig Aufzählung der Frequenzen von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen in situ 10. Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zellen in situ ermöglicht Abgrenzung von Ereignissen durch spezifische antigene Stimuli von den durch Bystander-Aktivierung verursacht. Ebenso ist die in situ-Technik auch provides Möglichkeiten, die Kinetik der Antigen-spezifischen T-Zell-Infiltration in den Zielorganen zu verfolgen.

Protocol

Ethikerklärung: Alle Tier Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und von der Universität von Nebraska-Lincoln, Lincoln, NE genehmigt. 1. Induktion von EAE Um EAE zu induzieren, bereiten das Peptid / komplettem Freund-Adjuvans (CFA) als Emulsion in 11 mit den folgenden Modifikationen: Schritt 1.1:. Vorbereitung PLP 139-151 in einer Konzentration von 1 mg /…

Representative Results

In diesem Bericht, in-situ-Detektion von Antigen-spezifischen, autoreaktive CD4-T-Zellen durch direkte Färbung mit MHC-Klasse-II dextramers beschrieben. Frisch geschnittene Hirnschnitte wurden von EAE-Mäusen gewonnen und mit Cocktails enthalten PLP 139-151 (spezifischen) oder TMEV 70-86 (Kontrolle) dextramers und anti-CD4 gefärbt. Die Top-Platten in Abbildung 1 zeigt LSCM Analyse von Hirnschnitten mit PLP 139-151 dextramers (rot) und CD4-Antikörper (grün), wobei die Doppel-positiven Zellen…

Discussion

Im Gegensatz zu MHC-Klasse-I-Tetrameren, die Verwendung von MHC-Klasse-II-Tetramere für Routine-Anwendungen weiterhin eine Herausforderung sein, vor allem um die Vorläuferfrequenzen niedriger Affinität autoreaktiven CD4-T-Zellen, was zum Teil auf ihre Aktivierung Abhängigkeit 6,15-17 aufzuzählen. Kürzlich wurde dieses Problem durch die nächste Generation von Tetrameren, genannt umgangen "dextramers" uns erlaubt, Antigen-spezifische CD4 + T-Zellen für eine Vielzahl von Autoantigenen, wie PLP …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der American Heart Association und der Kinder-Kardiomyopathie Foundation (SDG2462390204001) und den National Institutes of Health (HL114669) unterstützt. CM ist ein Empfänger eines Postdoc-Forschungsstipendium Stipendium der Stiftung Myokarditis, NJ ausgezeichnet.

Materials

CFA Sigma Aldrich, St Louis, MO 5881 Store at 4οC
MTB  H37Rv extract  Difco Laboratories, Detroit, MI 231141 Store at 4οC
PT List Biologicals Laboratories, Campbell, CA 181 Store at 4οC
1x PBS  Corning, Manassas, VA 21-040-CV Store at 4οC
Female A/J mice  Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 646
Female SJL/J mice Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME 686
Leur-lok sterile 1 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309628
Leur-lok sterile 3 ml syrringe BD, Franklin Lakes, NJ 309657
Sterile needle, 18 G BD, Franklin Lakes, NJ 305195
Sterile needle, 27 1/2 G BD, Franklin Lakes, NJ 305109
3-way stopcock  Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH MX5311L
Kerlix gauze bandage rolls  Covidien, Mansfield, MA 6720
Kimwipes Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA 34155
Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade Promega corporation, Madison, WI V2111
Immunopure normal goat serum Thermo Scientific, Waltham, MA 31873 Store at -20 οC
Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye eBioscience, San Diego, CA  12004185 Store at 4οC
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 19202 Store at 4οC
Faramount Aqueous Mounting Medium Dako, Carpinteria, CA 10073021
Conical tube (15ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352099
Conical tube (50 ml) BD Biosciences, San Jose, CA 352070
24-well flat bottomed tissue culture plates BD Biosciences, San Jose, CA 356775
Water color #2 brushes Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY 73502
Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 1255010
Premium Cover glass, 22 x 22-1 Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12548B
Disposable deep base mold histology cassettes Laboratory prodcust, Rochester, NY M-475-10
Loctite Super glue Henkel Corporation, Westlake, OH 1471879
Razor blades Gillette SuperSilver
Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4οC
PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) Neopeptide, Cambridge, MA Store at 4οC
MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye Store at 4οC
MHC class II/IAk Myhc 334-352 or  or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye Store at 4οC
Dextran conjugated SA-APC  Immundex, Copenhagen, Demark Store at 4οC
Sterile surgical scissors and forceps INOX tool Corporation
Micro oven GE Healthcare, Pittsuburgh, PA
Leica VT 1200 Vibratome Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL
Olympus BX 60  Laser scanning confocal microscope Olympus America, Inc. Center Valley, PA
Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope Nikon Inc. Melville, NY

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Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., Elowsky, C., Li, Q., Zhou, Y., Reddy, J. In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers. J. Vis. Exp. (90), e51679, doi:10.3791/51679 (2014).

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