主要組織適合遺伝子複合体クラスII Dextramersを用いて脳および心臓において自己反応性CD4 T細胞のその場検出に
Summary
主要組織適合性複合体クラスII dextramersとの直接染色により脳及び心臓における自己反応性CD4 T細胞を検出するためのプロトコルは、このレポートに記載されている。総合的な分析のために、 その場での抗原特異的CD4 + T細胞の頻度を列挙するための信頼できる方法も考案されている。
Abstract
This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-α (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler’s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the ‘Z’ serial images.
Introduction
抗原特異的CD4 T細胞の検出のための主要組織適合性複合体（MHC）クラスII四量体を使用することは挑戦であった1-7。 MHCクラスII四量体の検出感度を高めるために、研究チームは、次世代のテトラマー、指定された「dextramers「8を作成した。 Dextramersは、複数のストレプトアビジン-フルオロフォア部分は、いくつかのペプチドテザー、ビオチン化MHCモノマー一つデキストラン分子9に取り付けることができるようにコンジュゲートしたデキストラン骨格を含有する。このように、いくつかのMHC-ペプチド複合体が含まれているのMHC dextramersの大きな集合体は、複数のT細胞受容体（TCR）と対話することができます。
このグループは、最近、様々な自己抗原に対するdextramersを生成し、dextramersの検出感度は、約8四量よりも5倍であることを示した。実験システムは、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAを含むE）、プロテオリピドタンパク質（PLP）SJLマウスにおける139-151で誘導し; C57BL / 6マウスにおいて、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）35-55を用いて誘導EAE;心臓ミオシン重鎖α（MyHCの）A / Jマウスにおける334から352で誘導し、実験的自己免疫性心筋炎（EAM）。この研究は、PLP 139-151の使用を示す- 、それによってフルオロフォア抗体を用いからの信号を増幅する必要がなくなり、直接染色プロトコルを開発することにより、特異性を有するその場で抗原特異的CD4 T細胞を検出するためのMyHCの334から352 dextramers、アプローチは、一般的に四量体の使用に採用。また、組織を包括的に評価する方法はまた、確実にその場 10 における抗原特異的CD4 T細胞の頻度を列挙するために考案されている。 その場での抗原特異的T細胞の検出は、バイスタンダー活性化によって引き起こされるものから、特定の抗原刺激によって引き起こされる事象の描写を可能にする。同様に、 その場での技術ではまた、提供します：標的器官における抗原特異的T細胞の浸潤の動態を追跡する機会エス。
Protocol
Representative Results
Discussion
MHCクラスIテトラマーとは違って、日常的なアプリケーションのためのMHCクラスII四量体の使用は、特にそれらの活性化の依存関係6,15-17に一部起因低親和性自己反応性CD4 T細胞の前駆体頻度を列挙するために、挑戦的であり続けている。最近では、この問題は、PLP 139-151、MOG 35〜55およびMyHCの334などの自己抗原の数の抗原特異的CD4 T細胞を検出するために、私達を許可する」、dextramers?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、アメリカ心臓協会と子供の心筋症財団（SDG2462390204001）、および国立衛生研究所（HL114669）によってサポートされていました。 CMは心筋炎財団、ニュージャージー州によって授与ポスドク研究フェローシップ助成金の受取人である。
Materials
| CFA | Sigma Aldrich, St Louis, MO | 5881 | Store at 4οC |
| MTB H37Rv extract | Difco Laboratories, Detroit, MI | 231141 | Store at 4οC |
| PT | List Biologicals Laboratories, Campbell, CA | 181 | Store at 4οC |
| 1x PBS | Corning, Manassas, VA | 21-040-CV | Store at 4οC |
| Female A/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 646 | |
| Female SJL/J mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME | 686 | |
| Leur-lok sterile 1 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Leur-lok sterile 3 ml syrringe | BD, Franklin Lakes, NJ | 309657 | |
| Sterile needle, 18 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305195 | |
| Sterile needle, 27 1/2 G | BD, Franklin Lakes, NJ | 305109 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH | MX5311L | |
| Kerlix gauze bandage rolls | Covidien, Mansfield, MA | 6720 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34155 | |
| Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade | Promega corporation, Madison, WI | V2111 | |
| Immunopure normal goat serum | Thermo Scientific, Waltham, MA | 31873 | Store at -20 οC |
| Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye | eBioscience, San Diego, CA | 12004185 | Store at 4οC |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 19202 | Store at 4οC |
| Faramount Aqueous Mounting Medium | Dako, Carpinteria, CA | 10073021 | |
| Conical tube (15ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352099 | |
| Conical tube (50 ml) | BD Biosciences, San Jose, CA | 352070 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | BD Biosciences, San Jose, CA | 356775 | |
| Water color #2 brushes | Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY | 73502 | |
| Plain Microscope slides, size: 3" x 1" x 1.2 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 1255010 | |
| Premium Cover glass, 22 x 22-1 | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12548B | |
| Disposable deep base mold histology cassettes | Laboratory prodcust, Rochester, NY | M-475-10 | |
| Loctite Super glue | Henkel Corporation, Westlake, OH | 1471879 | |
| Razor blades | Gillette SuperSilver | ||
| Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4οC | |
| PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF) | Neopeptide, Cambridge, MA | Store at 4οC | |
| MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4οC | ||
| MHC class II/IAk Myhc 334-352 or or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye | Store at 4οC | ||
| Dextran conjugated SA-APC | Immundex, Copenhagen, Demark | Store at 4οC | |
| Sterile surgical scissors and forceps | INOX tool Corporation | ||
| Micro oven | GE Healthcare, Pittsuburgh, PA | ||
| Leica VT 1200 Vibratome | Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL | ||
| Olympus BX 60 Laser scanning confocal microscope | Olympus America, Inc. Center Valley, PA | ||
| Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope | Nikon Inc. Melville, NY |
References
- Cecconi, V., Moro, M., Del Mare, ., Dellabona, S., P, G., Casorati, Use of MHC class II tetramers to investigate CD4+ T cell responses: problems and solutions. Cytometry A. 73 (11), 1010-1018 (2008).
- Ferlin, W., Glaichenhaus, N., Mougneau, E. Present difficulties and future promise of MHC multimers in autoimmune exploration. Curr Opin Immunol. 12, 670-675 (2000).
- Kwok, W. W., Ptacek, N. A., Liu, A. W., Buckner, J. H. Use of class II tetramers for identification of CD4+ T cells. J Immunol Methods. 268, 71-81 (2002).
- Landais, E., et al. New design of MHC class II tetramers to accommodate fundamental principles of antigen presentation. J Immunol. 183, 7949-7957 (2009).
- Nepom, G. T. MHC class II tetramers. J Immunol. 188, 2477-2482 (2012).
- Vollers, S. S., Stern, L. J. Class II major histocompatibility complex tetramer staining: progress, problems, and prospects. Immunology. 123, 305-313 (2008).
- Wooldridge, L., et al. Tricks with tetramers: how to get the most from multimeric peptide-MHC. Immunology. 126, 147-164 (2009).
- Massilamany, C., Upadhyaya, B., Gangaplara, A., Kuszynski, C., Reddy, J. Detection of autoreactive CD4 T cells using major histocompatibility complex class II dextramers. BMC Immunol. 12, 1471-2172 (2011).
- Batard, P., et al. Dextramers: new generation of fluorescent MHC class I/peptide multimers for visualization of antigen-specific CD8+ T cells. J Immunol Methods. 310 (1-2), 136-148 (2006).
- Massilamany, C., Gangaplara, A., Jia, T., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS One. 9 (1), (2014).
- Massilamany, C., Khalilzad-Sharghi, V., Gangaplara, A., Steffen, D., Othman, S. F., Reddy, J. Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse. J Vis Exp. (88), e51654 (2014).
- Massilamany, C., Steffen, D., Reddy, J. An epitope from Acanthamoeba castellanii that cross-react with proteolipid protein 139-151-reactive T cells induces autoimmune encephalomyelitis in SJL mice. J Neuroimmunol. 219 (1-2), 17-24 (2010).
- Donermeyer, D. L., Beisel, K. W., Allen, P. M., Smith, S. C. Myocarditis-inducing epitope of myosin binds constitutively and stably to I-Ak on antigen-presenting cells in the heart. J Exp Med. 182 (5), 1291-1300 (1995).
- Liao, L., Sindhwani, R., Leinwand, L., Diamond, B., Factor, S. Cardiac alpha-myosin heavy chains differ in their induction of myocarditis. Identification of pathogenic epitopes. J Clin Invest. 92 (6), 2877-2882 (1993).
- Cameron, T. O., Cochran, J. R., Yassine-Diab, B., Sekaly, R. P., Stern, L. J. Cutting edge: detection of antigen-specific CD4+ T cells by HLA-DR1 oligomers is dependent on the T cell activation state. J Immunol. 166 (2), 741-745 (2001).
- Novak, E. J., et al. Activated human epitope-specific T cells identified by class II tetramers reside within a CD4high, proliferating subset. Int Immunol. 13 (6), 799-806 (2001).
- Reddy, J., et al. Detection of autoreactive myelin proteolipid protein 139-151-specific T cells by using MHC II (IAs) tetramers. J Immunol. 170 (2), 870-877 (2003).
- Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11 (2004).
