感光性タンパク質中のプロトン移動とプロテイン立体配座ダイナミクスの時間分解ステップスキャンフーリエ変換赤外分光法により

1。一般的なサンプルの態様及び機器の準備時間分解ステップ走査測定のために装備商用FT-IR分光計を使用する。最良の結果を得るには、振動減結合テーブルの上にFT-IR分光計を配置。 数ミリバールに光学区画を避難。乾燥した空気または窒素で試料室をパージします。 FT-IR分光計のMCT検出器の前に可視光に対して不透明IR透明材料を配置します。この予防措置は、ステップ·スキャン実験中励起レーザパルスからのアーチファクトを防ぐために不可欠です。注：私たちは、直径25mmのゲルマニウム（Ge）ウィンドウを使用します。その高い屈折率は、望ましくない強度が大きく、反射防止コーティングでGeのフィルタを用いて回避し、失う原因となる。 液体窒素でMCT検出器デュワーをクールダウン。注：光起電MCT検出器を使用は、それらの線形応答のphotoconductivesよりも好ましい、したがって、優れたphotometrさICの精度と信頼性をベースライン31,53。 均質なタンパク質膜を形成するタンパク質懸濁液を乾燥しながら塩結晶の形成を防止するために低い（<20 mM）のイオン強度の緩衝液中に少なくとも2 mgのタンパク質/ mlの実験に用いたサンプルを予め濃縮する。沈降サンプルについては、（リポソームまたは細胞膜パッチにおいて、例えば 、膜タンパク質）超遠心分離を適用することにより、それらを濃縮する/洗浄する。堆積物（ 例えば 、洗剤可溶化した膜タンパク質）をしないタンパク質のための適切なカットオフのセントリコンを使用してください。 最適な結果を得るために使用します。可能な限り純粋でアクティブA）タンパク質製剤を、細胞膜パッチ内またはリポソーム中に再構成するタンパク質のための体重の3≤B）脂質/タンパク質比; C）洗剤可溶化したタンパク質のための体重の1≤洗剤/タンパク質比は。振動バンドタンパク質（ 例えば 、CHAPS）と重複洗剤や脂質の使用は避けてください。 </oL> 2。 バクテリオロドプシン上の全反射減衰実験の準備を FT-IR分光計の試料室にATRアクセサリーをマウントします。注：私たちは5アクティブ反射でのZnSe /ダイヤモンドATRを使用しています。その光学特性は、可視光を励起レーザによって影響されるように、このようなATRアクセサリの内部反射素子（IRE）のようなゲルマニウムまたはシリコン等の半導体材料を避ける。 4センチメートル-1従来のラピッドスキャンFT-IR分光法によるクリーンIRE表面の解像度で広い範囲（約4,000-800 cm -1）でエネルギースペクトルを測定します。後の段階で吸収スペクトルを計算するために基準スペクトルとして、このスペクトルを使用する。 試料（ 例えば 、pH7.4で4 NaClおよび100 mMののNaPi）を再水和するために後で使用緩衝液20μlとATRのIREの表面を覆う。バッファのIR吸収を測定します。 バッファを削除し、IRE表面WIをすすぐ目の水。表面に触れないようにしてください。強烈な空気の流れによってIRE表面から残留液を除去します。 IREの表面の上に紫色の膜中のバクテリオロドプシンの〜3μL（BR）（〜6 mgのタンパク質/ mLの脱イオン水中）スプレッド（〜0.2センチメートル2エリア）。フィルムが得られるまで乾燥した空気の穏やかな流れの下でタンパク質懸濁液を乾燥させます。 （ 図1参照）の乾燥フィルムの吸収スペクトルを測定する。 静かにドライフィルム（ 例えば 、pH7.4で4 NaClおよび100 mMののNaPi）を再水和するために、高いイオン強度の緩衝液を20〜40μlを加える。注：高イオン強度が探査された表面にできるだけ近い（ 図2）と同じくらいのタンパク質を保持することを可能にする、膜フィルムの過剰な膨潤を防止する。 水の蒸発を防ぐために蓋付きATRホルダを覆う。必要に応じて、温度制御のために25℃に設定し、循環バスに接続されたカバー·ジャケットを置く。長いphotocycles（＆＃を有するタンパク質62;秒）、温度制御は、ベースライン安定性を高める可能性があります。 吸収スペクトルを測定します。緩衝液（ 図3）の吸収スペクトルを差し引くことにより、フィルムの再水和後に表面近傍に残留する試料の割合を推定する。 再水和後の5〜20分間隔（ 図4）で吸収スペクトルを記録することによって、フィルムの膨潤の安定化を確認する。この手順は省略可能ですが、推奨される。 3。界面活性剤で可溶化したチャネルロドプシン2の伝送実験を実施 直径20mmのBaF 2をウィンドウの中央に5のNaCl、5mMのHEPES（pH7.4）でデシルマルトシド（DM）に溶解にChR2（〜10 mgのタンパク質/ ml）を10μlを追加します。 6〜8ミリメートル径（〜200μgの/ cm 2のタンパク質表面密度）をマイクロピペットチップの助けを借りて、それを広げた。 フィルムUSIを形成乾燥した空気の穏やかな流れをngの。最良の結果を得るには膜が均一であり、およそ最大の開口部にIRビームのサイズと一致する直径を有していることを確認してください。 3-5で配布グリセロール/水の混合物の3〜5μLを添加することにより、フィルムの水和物は、ドライフィルムを中心に低下して、しっかりと≥1ミリメートルの厚さの平らなシリコーンOリングを使用して第二のウィンドウを閉じます。注：グリセロール/水混合物の比は、窓54との間の相対湿度を制御する。吸湿サンプルについては3月7日または2月8日グリセリン/（w / w）の水の比率を使用しています。グリセロール/水滴が膜タンパク質と直接接触してはいけません。 ホルダー内のBaF 2に挟まれた窓を挿入します。水和したフィルムのサイズに一致する穴と、紙等のIR不透明材料、とのサンプル窓を覆うことにより、検出器に到達するのまっすぐ光を防ぐ。サンプルコンパートメント内のホルダーを配置します。 25℃にホルダの温度を制御する温度制御された循環バスに接続された恒温ジャケットによるC。 吸収スペクトルを測定します。アミドI領域（〜1,700-1,620 cm -1）での最大吸収が0.6〜1.0の範囲内であることを確認してください。 水、DM、代表膜タンパク質（ 図6）のための基準消衰係数スペクトルを用いて、水和フィルムの吸収スペクトルからの質量およびタンパク質/界面活性剤/水のモル比（ 図5）を推定する。 水和レベルはステップ·スキャン実験（≥1時間）を実施する前に、安定するまで待ってください。 4。調整と励起レーザの同期 光サイクルをトリガするために、YAGレーザ（λ= 532nm）を：BR上の実験のために、パルスのNdの第二高調波放射を使用しています。 OPによって提供されるのChR2を含む実験では、λ= 450nmの励起を使用：YAGレーザーの第三高調波のNd（λ= 355 nm）とによって駆動されるticalパラメトリック発振器（OPO）。レーザパルスが二光励起を最小限にするために（〜10ナノ秒）十分に短いことを確認してください。注：レーザパルスのエネルギーはできるだけ一定であるべきである。過渡現象記録装置に接続されたフォトダイオードでレーザの反射を測定し、応答（ 図8）を積分することによって確認されるように我々のセットアップでは、レーザ強度は、平均値の周りの10％≤変動する。 カップルサンプルへのレーザー。パワー·メータを使用して、パルス当たり2〜3ミリジュール/ cm 2のサンプルでのレーザーのエネルギー密度を調整します。 ATRのセットアップでは、ATRの蓋の上に置か光ファイバを使用してください。 透過実験のために、試料にレーザーをもたらすためにミラーを使用して、必要に応じて、コリメートレンズのいずれか、またはわずかに試料フィルムサイズ上記直径にレーザ光を発散する。 LASEを同期させるR分光計によってデータ記録パルス。分光器をトリガする：YAGレーザーのNdエレクトロニクスのQスイッチシンク·アウトTTLパルスを使用してください。それぞれのbRは10 HzおよびChR2を0.25 Hzに：YAGレーザーのNdの励起レートを設定します。 レーザー励起速度を制御するパルス遅延発生器（PDG）を使用する場合のNd繰り返し率：YAGレーザは容易に調整できません。 PDG外部トリガ入力に：YAGレーザーのNdランプシンク·アウトに接続します。レーザ発振をトリガするためにYAGレーザ：PDGは、Q-スイッチ同期中のNdの入力にTTLパルス出力を遅延〜190マイクロ秒を提供する。ゲートPDGだけ最後に受け入れトリガ（BrまたはChR2を4秒100ミリ秒）から一定時間後に外部トリガを受け入れます。 5。時間分解ステップスキャンの準備と設定光路にローパス光学フィルタを配置します。 1,800-85で時間分解ステップスキャン測定を行うに0センチメートル-1スペクトル範囲は、1950センチメートル-1を超えると1800センチメートル-1（ 図7）の良好な伝送（>百分の50から80）で、フィルターの不透明を使用しています。 ACからDC結合モードに検出器を変更します。注：この調整した後、インターフェログラム信号は、もはや周りのゼロが、DCレベルとして知られている値を中心に振動しません。 より高い光子束及び、従って、より良好な信号対ノイズが、検出器の直線性限界内ための分光計の最大の可能なビームアパーチャを使用する。 ゼロにインターフェログラムのDCレベルを持参し、アナログデジタル変換された（ADC）のダイナミックレンジをより有効に活用するために、電子ゲインを再調整。前置増幅器によって供給される信号に電圧バイアスを印加することでDCオフセットレベルを達成する。注記：このオプションは、近代的なFT-IR分光計に含まれています。そうでなければ、自家製の外部装置は、前置増幅器とADC 38の間に配置され、代わりに使用することができる。ケアはしてあるこのようなデバイスの電子機器は、高速かつリニアであることを確認する必要がありました。 FT-IR分光計のステップ·スキャンメニューを起動します。 1,975.3-0 cmのステップスキャン測定対象のスペクトル帯域幅を設定し-1。少し光フィルタのカットオフを超え、He-Neレーザーの波数（ここでは1月8日目 ）の画分にスペクトル帯域幅を調整します。 後の時間で反応速度の歪みを防止するために、任意の高域通過フィルタの電子を無効にします。そのカットオフ周波数が順またはADC（ノイズエイリアシングを低減する）のサンプリングレートを上回る場合、ローパス電子フィルタは有益であり得る。 8センチメートル-1と64 cmのスペクトルと位相解像度を設定し-1であった。前進片面にフェログラム取得モードを設定します。これらのオプションを1フェログラムは約500ポイントが必要です。 160 kHを、 例えば （分析計で利用可能な最高にADCのサンプリング·レートを設定Z、または6.25秒）。 「外部」、 すなわち 、「実験のトリガー」を設定し、レーザーがマスターです。 BR（最大42ミリ）7,000 20,000 ChR2を（最大125ミリ）のために：記録される直線等間隔のデータポイント数を設定します。注：より長い時間スケールは、データ取得38をトリガする波発生器から擬似対数的時間間隔を外部TTLパルスを用いてADCメモリをオーバーフローすることなく覆うことができる、又は内部ADC 31の代用品として二つの平行な過渡レコーダを使用することにより、 32。 サンプルの暗状態のための基準として、約100プレトリガーポイントを保存します。注：ミリ秒の時間スケールでは、データの品質は、多くの場合、モバイル·ミラーの変動によって制限されます。 100の上方にプレトリガーポイントを増加させることは、従って、有意なデータ品質を改善することは期待されない。 共同加算の回数を設定し、 すなわち 、ミラーPOSITあたりの光反応の平均数イオン。 bRのために、20の同時添加（10 Hzの励起速度での時間を計測する20分）を使用する。 ChR2を2共添加（0.25 Hzの励起速度での時間を計測する70分）を使用するため bRのための実験の10倍を繰り返し、ChR2を3つの異なるサンプルフィルム上の35X、ミラー位置ごとに最終的に〜200の共同の追加を持っている。 6。データ処理最初と最後の測定から得られた光誘起赤外差スペクトルを比較することにより、サンプルの状態を確認してください。差スペクトルの強度は最初の測定の60％を下回る任意の測定値を廃棄することを検討してください。 記録された干渉画像を平均。 FTIR分光計からOPUSソフトウェアを使用して、平均して「スペクトル電卓」に追加し、時間分解干渉画像を選択します。 インターフェログラムの平均を得るために、「=」をクリックしてください。 注：場合にはインターフェログラムの位相それは平均的な干渉画像またはシングルチャネルスペクトルに無関心で測定中は一定である。一定の位相を計算し、第一の位相スペクトル及び最後に記録されたインターフェログラムを比較することによって確認することができる。 フーリエ平均化時間分解単一チャネルスペクトルを得るために平均時間分解インターフェログラムの変換を行う。 ステップ6.2.1と同じソフトウェアを使用して、平均した時間分解干渉図形を選択し、「スペクトルと干渉図形」のアイコンをクリックしてください。メルツ位相補正方法、2のゼロ充填率（インストゥルメンタル解像度ごとに2つのデジタル点）、およびアポダイゼーション機能（ 例えば 、三角形、ブラックマン·ハリス3 -利用など）を使用してください。 時間分解スペクトルに時間分解干渉画像を変換するために下の「変換」をクリックしてください。 「データポイントテーブル」又はA」として時間分解単一チャネルデータをエクスポート; MATLAB」を使ってファイル "OPUSソフトのアイコン"として保存します。外部プログラムでのデータ処理を続行します。 レーザーの前に単一のチャネルスペクトルを平均化し、時間分解吸収差スペクトルを時間分解シングルチャネルのデータを変換します。 レーザーの前の100シングル·チャネル·スペクトルの、ε、ノイズ標準偏差を用いて、波数の関数（ 図12）などの差スペクトルにおいて期待されるノイズ標準偏差のベクトルを計算し、平均値、S 0（ν）： ε/ S 0（ν）。 εの値は、連続した単一チャネルスペクトルを減算し、√2で補正標準偏差を計算すると推定される。 の利用にはあまりにも騒々しいスペクトル領域を削除する（ たとえば 、1825センチメートル上記-1および850センチメートル下記-1）。 準対数的に平均化（ 例えば 、20スペクトル/時間十年）を行います。 appearanデータのCEは改善し、スペクトルの数は、有意な情報がなくて〜10 2に〜10 4から減少します（ 図9）を失った。 フーリエ補間を使用して（1ポイント/センチ-1）の点の4倍のスペクトル密度を増加させる（ゼロフィリングを掲示）。 注：私たちは、MATLABで実行されている自家製のプログラムの中で6.4.4に手順6.4.1を実行します。 特異値分解、SVD（ 図13）で得られた時間分解スペクトル（ 図10A）を処理する。有意なSVDコンポーネント（ 図10B）の限られた数のデータを再構成することによって、データノイズ除去を達成する。注：私たちは、ビルトインの「SVD」機能を使用して、MATLABでSVDを実行します。