JoVE Journal > Engineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Engineering

Tarafından Işığa Proteinler Proton Transferi ve Protein Konformasyon Dynamics Zamanda çözülmüş kızılötesi spektroskopi Fourier-dönüşümü Step-tarama

Published: June 27, 2014
doi:
10.3791/51622
,
1Experimental Molecular Biophysics,Freie Universität Berlin

Summary

Key steps of protein function, in particular backbone conformational changes and proton transfer reactions, often take place in the microsecond to millisecond time scale. These dynamical processes can be studied by time-resolved step-scan Fourier-transform infrared spectroscopy, in particular for proteins whose function is triggered by light.

Abstract

Bir proteinin işlevi sırasında protonation ve protein omurga konformasyon değişiklikleri dinamiklerini İzleme mekanizmasını anlamaya yönelik önemli bir adımdır. Protonasyon ve yapı değişiklikleri, kızılötesi (IR) fark spektroskopisi ile problanabilir her ikisi de, sırasıyla, amino asit yan zincirleri ve peptid bağının titreşim modelini, etkiler. , Işlevi proteinler ışığı ile tekrar tekrar ve tekrar üretilebilir tetiklenebilir olabilir için, Fourier dönüşümü kızılötesi adım tarama tekniği kullanılarak, geniş bir tayf aralığında (alt) mikrosaniye çözünürlüğe sahip kızılötesi bir fark spektrumunu elde etmek mümkündür. Kinetiği takip etmek yeterli, 4 – fotokimyasal ~ 10 2 -10 3 kez tekrarlanarak, asgari sayı makul spektral çözünürlükte ve bant genişliği bir tarama tamamlamak için, emme fark spektrumları gürültü seviyesi ~ 10 gibi düşük olabilir bir amino asitten protonlama değişir. Altgürültü seviyesi, daha fazla veri ortalama alma ve / ya da matematiksel işlem ile gerçekleştirilebilir. En iyi sonuçlar için gerekli protein miktarı, kullanılan örnekleme tekniğe bağlı olarak, 5-100 ug arasındadır. Ek şartları ile ilgili olarak, protein önce bir düşük iyonik güçlü tampon içinde konsantre edildi ve daha sonra bir film oluşturmak üzere kurutulur edilmesi gerekmektedir. Protein filmi su damlacıkları ile az ya da kontrollü atmosferik nem koşulları altında, ya önceki deneyden hidratlanır. Elde hidrasyon seviyesi (protein su / g g), bir IR absorpsiyon spektrumu ölçülür. Vitrin tekniği için, kendi doğal mor membran ortamda ışık odaklı proton pompa bakteriyorodopsin en photocycle inceledi ve ışık-kapılı iyon kanalı channelrhodopsin-2'nin deterjan içinde çözünür.

Introduction

Tam proteinler işlevini yerine nasıl aydınlatmak için, örneğin, çoğu kez bunların ara maddelerinin bir dizi içerir ve zaman birkaç siparişleri uzanan bir tepkime yolu boyunca, çalışma olarak ölçmek için gereklidir. Protein fonksiyonunun önemli adımlar çoğu zaman aralığını 1 milisaniye mikrosaniye gerçekleşecek, omurga yapı değişiklikleri ve membran proteinlerinin proton transfer reaksiyonları özellikle. X-ışını kristalografisi, yapısal biyoloji tartışmasız ayağı, zar proteinleri 2 ile büyümek zordur, iyi kırıcı protein kristalleri statik (zaman-ortalama) elektron yoğunluğu sağlar. Nadiren hidrojen atomlarının yerini de dahil olmak üzere, ancak A 3D atomik modeli, elektron yoğunluğu göre inşa edilebilir. Laue kırınım 3 veya femtosecond X-ray bakliyat 4 ya güvenerek zaman çözüme X-ışını kristalografisi, kayda değer ilerleme, yüksek yapısal bilgi için zamanı boyut katıyorX-ışını kristalografisi ile 5 herent. Ama teknik ve analitik zorlukları bir kenara bırakarak, kristal kafes omurga yapısal değişiklikleri bozabilir ve protein dinamikleri, protein kristalleri 5 dayalı yöntemlerin kaçınılmaz bir eksiklik değiştirebilir. Sonuç olarak, proteinlerin dinamik yönleri hala en flaş photolysis 6,7 öncülüğünü gibi, optik yöntemlerle kapsamında, sınırlı yapısal içgörü genel dezavantaj olsa da. Vardır

Fourier transform kızılötesi spektroskopisi (FT-IR) protein yapısı, zar proteinleri 8-11 sayısız statik yapısal ve fonksiyonel araştırmalarda yararlanan geçen özelliği bir değerli bir hassasiyet ile optik spektroskopileri zamansal çözünürlüğü birleştirir. Özellikle, FT-IR spektroskopisi fark başka 12-19 bir metastabl devletten bir protein transits olarak küçük spektral değişiklikleri incelemek için ideal bir araç olduğu kanıtlanmıştır.

StudieTek molekül düzeyinde 20,21 de dışındaki protein dinamikleri, ilgili senkronizasyon için bir tetikleme süreci gerektirir. Siklik melaninin ile proteinlerin çalışmada yapılan gibi bir reaksiyon uygun tetikleyici olarak ışık kullanılarak invaziv hızlı olup başlatılır. Iyi spektral çözünürlük ve uygun sinyal-gürültü oranını korurken zaman çözüme çalışmaları ile ilgili önemli bir sorun yeterli zaman çözünürlük başarıdır. Ayrıca gerekli yeterince geniş bir spektral ve zamansal bir yelpazede karşılamak için olduğunu. Zaman çözülmesi adım tarama FT-IR spektroskopisi yayınlanan örnekler 3,900-850 cm gibi geniş spektrum aralıkları kapsayan -1 ve dinamikleri kadar 3,5 cm, ~ süresi 9 siparişleri uzanan -1 tayf ile, bu yönleriyle 22 bütün üstünlük ve 30 NSEC zamansal çözünürlük 23-28.

Fourier-transform kızılötesi spektrometre dağıtıcı olanlar 29 üzerinde azaltılmış gürültü ve gelişmiş fotometrik doğruluğunu göstermektedir. However, normal bir hızlı tarama kayıt modunda FT-IR spektrometre interferometrenin mobil ayna tarama tamamlamak için gereken minimum zaman bir sonucu olarak ≥ 5-10 msn sınırlı bir zaman çözünürlüğü muzdarip. Adım tarama tekniği ile, tam tersine, dinamik olayın zaman bağımlılığı interferometrenin tarama süresi aynhr,. Kısaca, ayrık adımlarla yerine cep ayna hareket sürekli bir tarama tamamlamak için tarıyor. Bu adımların her biri de (mobil) ayna sabit tutulur ve bir geçici kaydedilir. Bu nedenle, zaman çözünürlüklü cıva-kadmiyum-tellür nsaniye 10-100 aralığında bir değerdir (MCT) dedektörü, yükselişi zaman ile sınırlıdır. Uygulamada, (kanat centerburst ve küçük sinyaller yoğun bir sinyalini içeren) interferogram büyük dinamik aralık, örnekleme yol gibi birçok 16-24 gibi bitleri ile uygun dijitalleşme bir analog / dijital dönüştürücü (ADC) gerektirir ~ 200 kHz yüksek değil oranları(5 mikro-saniye) 30. Nanosaniye zaman çözünürlüğü, 8-12 bit ADC yeterli 23,31-33 belirlenebilen interferogram sadece değişiklikleri ölçerek gerçekleştirilebilir. Teknik yönler 30,34,35 ve uygulamalar zaman çözüme adım taramanın 36-38 yerde ayrıntılı olarak ele alınmıştır.

Mevcut katkı amacı, ışığa duyarlı membran protein ile ilgili olarak zaman çözümlü bir adım tarama FT-IR spektroskopisi pratik yanlar açıklayan bir protokol sağlamaktır. Iletim ve zayıflatılmış toplam yansıma (ATR): Burada, tekniğin performansı iki örnekleme yöntemleri için gösterilir. ATR kullanılması proteini için tam hidrasyon koşulları sağlar değil, aynı zamanda örnek pH ve iyonik kuvvet 49,50 akut kontrolünü sağlar, sadece fazla suyun mevcudiyetinde çalışılmasına olanak verir. Bacteriorhodopsin ve channelrhodopsin-2: Adım-tarama deneyleri seçilen iki sistemlerde gösterilmiştir.

<p class="jove_content"> Işık odaklı proton pompa bacteriorhodopsin (BR) o kadar iyi anlaşılmış membran proteini yapma, kırk yılı aşkın 39,40 için çok sayıda biyofizik çalışmaların konusu olmuştur. BR işlevsellik FT-IR spektroskopi çalışmasında uygulanan sayısız teknikler arasında tartışmasız en büyük etkilerinden birini sarf etti. Yani, FT-IR spektroskopisi başka 13,41,51 sorumluydu olarak zarından proton transferi dahil gruplarını çözmek için anahtar olmuştur.

Channelrhodopsin (THY) doğada 42,43 bulunan ilk hafif-kapılı iyon kanalıdır. CHR'ın ışık uyarım bir iyon kanalının geçici açılması yol açar. Onun keşif moleküler süreçlerin ışık 44,45 tarafından kontrol edilir optogenetik, gelişmesi için yol yerleşti. CHR'ın mikrobiyal rhodopsins ailesine, Br gibi, ancak ait bR aksine, çok az fonksiyonel mekanizması 52 hakkında az şey bilinmektedir. ChR2 bir io olarak işlevini birleştirirproton pompalama aktivitesi 46,47 n kanal. Son zamanlarda, biz intra-protein proton transfer reaksiyonları ve ChR2 48 protein omurga konformasyon değişiklikleri dinamiklerini çözmek için zaman çözüme adım tarama FT-IR spektroskopi uygulamışlardır.

Protocol

1.. Genel Numune Yönleri ve Enstrüman Hazırlık Zaman çözümlü bir adım tarama ölçümleri için donatılmış bir ticari bir FT-IR spektrometresi kullanarak. En iyi sonuç için bir titreşim-ayrılmış masanın üstüne FT-IR spektrometresi yerleştirmek için. Bir kaç mbar optik bölmesi boşaltın. Kuru hava veya azot ile örnek bölmesini temizleyin. FT-IR spektrometre MCT detektörü önünde görünür radyasyona opak bir IR saydam madde konulur. Bu önlem adım tarama deneyleri sırasında heyecan verici lazer darbesinin eserler önlemek için şarttır. Not: Biz bir germanyum 25 mm çapında (Ge) penceresi kullanın. Onun yüksek kırılma indeksi istenmeyen yoğunluğu büyük ölçüde yansıtmayıcı kaplama ile bir Ge filtre kullanarak kaçınılması, kaybeder neden olur. Sıvı azotla birlikte MCT detektörü Dewar soğumasını. Not: fotovoltaik MCT dedektörlerinin kullanılması üstün photometr, böylece, onların lineer tepki photoconductives daha fazla tercih edilir veic doğruluk ve güvenilirlik temel 31,53. Düşük bir tampon maddesi (<20 mM), homojen bir film oluşturmak için bir protein, protein süspansiyonu kurutma sırasında tuz kristallerinin oluşumunu önlemek için iyonik kuvveti en az 2 mg protein / ml 'ye deneyler için kullanılan örnek öncesi konsantre hale getirin. Sediment örnekleri için, (bir lipozomlarda veya hücre zarı yamalar örneğin, zar proteinleri) ultrasantrifüjleme uygulayarak bunları konsantre / yıkayın. Tortu (örneğin, deterjan çözünebilir membran proteinleri) yok proteinler için doğru sınır değerinin centricons kullanın. En iyi sonuçlar kullanım için: a) mümkün olduğu kadar saf protein preparatları ve aktif; Hücre membran yamalar ya da lipozomlar içinde yeniden proteinler için ağırlık içinde 3 ≤ b) lipid / protein oranı; c) deterjan / deterjan protein çözünebilir proteinleri için ağırlık olarak 1 ≤ oranları. Titreşim bantları protein (örneğin, CHAPS'tır) olanlar ile örtüşmektedir deterjan veya lipidlerin kullanımını önlemek. </ol> Bakteriyorodopsin üzerinde Zayıflatılmış Toplam Yansıma Deneyleri 2. Hazırlanması FT-IR spektrometre numune bölmesine ATR montaj aksesuarı. Not: Biz 5 aktif yansımaları ile bir ZnSe / elmas ATR kullanın. Optik özellikleri heyecan verici görünür lazer tarafından etkilenir gibi, bu tür ATR aksesuarın iç yansıma elemanı (IRE) olarak germanyum veya silikon gibi yarı iletken malzemeler kaçının. 4 cm -1 konvansiyonel hızlı tarama FT-IR spektroskopi ile temiz IRE yüzeyinin çözünürlükte geniş menzilli (yaklaşık 4,000-800 cm -1) enerji spektrumunu ölçün. Daha sonraki bir aşamada emme spektrumlarını hesaplamak için bir referans spektrumu spektrumu kullanın. Örnek (örneğin, pH 7.4 'de 4 M NaCl ve 100 mM NaPi) rehidrate için daha sonra kullanılan tampon maddesi 20 ul ATR İRE kaplanmalıdır. Tamponun kızılötesi emilim ölçülür. Tamponu çıkarın ve IRE yüzey wi durulayıninci su. Yüzeyine dokunmaktan kaçının. Yoğun bir hava akımı ile İRE yüzeyinden artık sıvıyı çıkarın. IRE yüzey (~ 0.2 cm alan 2) üzerine mor zarlarında bakteriyorodopsin arasında ~ 3 ul (br) yayın (deiyonize su içinde ~ 6 mg protein / ml). Bir film ulaşılana kadar bir kuru hava akımı altında hafif bir protein süspansiyonu kurutun. Kuru filmin absorbsiyon spektrumunu ölçün (bakınız Şekil 1). Yavaşça kuru bir film (örneğin, pH 7.4 'de 4 M NaCl ve 100 mM NaPi) rehidrate, yüksek iyonik güçlü bir tampon 20-40 ul ekleyin. Not: Yüksek iyonik kuvveti incelenen pervane yüzeyine mümkün yakın (Şekil 2) kadar protein korumak için izin, zar filmin fazla şişmesini önler. Suyun buharlaşmasını önlemek için bir kapak ile ATR tutucu örtün. İsteğe bağlı olarak, sıcaklık kontrolü için 25 ° C'ye ayarlanmış bir dolaşım banyoya bağlı bir kapak ceket yerleştirin. Uzun photocycles (& # ile proteinlerin62; saniye), sıcaklık kontrol baz istikrarı artırmak olabilir. Bir absorbans spektrumunun ölçün. Tamponun emme tayfı (Şekil 3) çıkarılarak filmin rehidrasyon işleminden sonra yüzeye yakın kalan numunenin yüzdesi tahmin. Rehidrasyon sonra 5-20 dakika aralıklarla (Şekil 4) soğurma spektrumları kaydederek şişme filmin istikrar onaylayın. Bu adım isteğe bağlıdır ama tavsiye edilir. 3. Deterjan-solübilize channelrhodopsin-2 on İletim Deneyleri Sahne 5 mM NaCI, 5 mM HEPES, 20 mm çapında bir BaF 2 penceresinin merkezine (pH 7.4) ve desil-maltozit (DM) içinde çözüldü CHR2 (~ 10 mg protein / ml) 10 ul ekle. 6-8 mm çapa mikro pipet yardımı ile yayın (~ 200 g / cm arasında protein yüzey yoğunluğu, 2). Bir film USI Formukuru hava hafif bir akış ng. En iyi sonuçlar için, film homojen ve yaklaşık olarak en diyafram IR ışınının boyutu doğrultusunda bir çapa sahip olduğundan emin olun. ≥ 1 mm kalınlığa sahip yassı bir silikon O-halka kullanılarak 3-5 kuru film yaklaşık 3-5 damla dağıtılır gliserol / su karışımından ul, ve bir ikinci pencere ile sıkıca yakın eklenmesiyle film hidratı. Not: gliserol / su karışımının oranı pencereler 54 arasındaki nispi nem kontrol eder. Hidroskopik numuneler bir 3/7 ya da 2/8 gliserol / su oranı (a / a) kullanın. Gliserol / su damla protein filmi ile doğrudan temas halinde olmamalıdır. Bir tutucu BaF 2 sandviç pencere takın. Hidratlanmış filmin büyüklükle eşleşen bir delik ile kağıt gibi bir kızılötesi ışık geçirmeyen bir maddeyle, numune penceresi ile kaplayarak dedektörü ulaşmasını düz ışığı engeller. Numune bölmesindeki tutucu yerleştirin. 25 ° tutucunun sıcaklığı kontrolSıcaklık kontrollü bir dolaşım banyoya bağlı bir termostatik silindir ile söndürüldü. Bir emme tayfı ölçün. Amid I bölgesinde maksimum absorpsiyon (~ 1,700-1,620 cm-1) 0,6-1,0 aralığında olduğundan emin olun. Su, DM ve temsili bir zar proteinleri (Şekil 6) için bir referans sönüm katsayısı spektrumları kullanılarak hidratlanmış filmin absorpsiyon spektrumu gelen kütle ve protein / deterjan / su mol oranına (Şekil 5) tahmin edilmesi. Hidrasyon seviyesi adım tarama deneyleri (≥ 1 saat) gerçekleştirmeden önce stabilize olana kadar bekleyin. Heyecanlı Lazer 4. Uyum ve Senkronizasyon Photocycle tetiklemek için YAG lazer (λ = 532 nm): bR deneyleri bir darbeli Nd ikinci harmonik emisyonunu kullanın. Bir op tarafından sağlanan ChR2 içeren deneyler için, λ = 450 nm bir eksitasyon kullanımıYAG lazer: tical parametrik osilatör (AFE) bir Nd üçüncü harmonik (λ = 355 nm) tarafından tahrik. Lazer darbe ikincil fotoğraf uyarma aza indirmek için (~ 10 NSEC) yeteri kadar kısa olduğundan emin olun. Not: lazer atımlarının enerjisi mümkün olduğu kadar sabit olmalıdır. Geçici bir kayıt cihazına bağlı bir fotodiyot tarafından lazerin refleks ölçülmesi ve tepki (Şekil 8) entegre ile teyit olarak kurulumunda, lazer yoğunluk, ortalama değer çevresinde ≤% 10 değişiklik gösterir. Numuneye çift lazer. Bir güç ölçer kullanarak puls başına 2-3 mJ / cm 2 için örnek de, lazerin enerji yoğunluğunu ayarlayın. ATR kurulum için, ATR kapağın tepesine yerleştirilen bir optik lif kullanabilirsiniz. Iletim deneyler için, numune için lazer getirmek için aynalar ve, gerekirse, lensler paralel yapma ya da hafif ya da numune film boyutu üzerinde bir çapa lazer ışını farklılaşır. Lase senkronizer spektrometresi ile veri kaydı ile darbe. Spektrometreyi tetiklemek için YAG lazer: Nd elektronik Q-switch senkron-out TTL darbe kullanın. Sırasıyla YAG bR için 10 Hz lazer ve ChR2 için 0.25 Hz: Nd uyarım hızını ayarlayın. Lazer uyarım hızını kontrol etmek için bir darbe gecikme jeneratörü (pdg) kullanırsanız Nd tekrarlama oranı: YAG lazer kolayca ayarlanabilir değildir. PDG harici tetikleme girişine YAG lazer: Nd lamba senkron-out bağlayın. PDG Q-switch Nd girişine senkron-in bir ~ 190 mikro-saniye gecikmeli TTL darbe çıkışı sağlar: YAG lazer, lazer uygulaması tetiklemek için. Kapısı PDG sadece son kabul edilen tetikleyici (bR veya ChR2 için 4 sn için 100 msn) beri belirli bir süre sonra harici bir tetikleyicisi kabul etmek. 5. Zaman çözülmesi Adım-tarama Hazırlıklar ve Ayarlar Optik yolundaki düşük geçişli bir optik filtre yerleştirin. 1,800-85 de zaman çözüme adım tarama ölçümlerini gerçekleştirmek için0 cm -1 spektral aralığı, 1950 cm -1 üstünde ve 1.800 cm -1 (Şekil 7), aşağıda iyi iletim (>% 50-80) ile bir filtre opak kullanın. AC-DC bağlanmış moduna değiştirme detektörü. Not: Bu ayarlamadan sonra interferogram sinyal artık sıfır etrafında ancak DC-düzeyi olarak bilinen bir değer etrafında salınım olacaktır. Sinyal-gürültü, ama dedektörün doğrusallık sınırları içinde böylece mümkün olan en yüksek ışın foton akı için Spektrometrenin diyafram ve daha iyi kullanın. Sıfıra interferogram DC-seviyeye getirmek ve analog dijital dönüştürülen (ADC), dinamik aralık daha iyi faydalanmak için elektronik kazanç yeniden ayarlayın. Pre-amplifikatör tarafından sağlanan sinyale bir voltaj önyargı uygulayarak telafi DC düzey elde edin. Not: Bu seçenek, modern FT-IR spektrometre dahildir. Aksi takdirde, bir ev yapımı harici aygıt preamplifikatör ve ADC 38 arasına yerleştirilir, bunun yerine kullanılabilir. Care daha sonrabu cihazın elektronik hızlı ve doğrusal olmasını sağlamak için gerekiyordu. FT-IR spektrometre adım tarama Başlat menüsü. 1,975.3-0 cm adım tarama ölçümü için hedef spektral bant genişliğini ayarlayabilirsiniz -1. Biraz optik filtrenin cutoff aşan, He-Ne lazer wavenumber (mevcut durumda 1/8 th) bir kısmını spektral bant genişliğini ayarlayın. Daha sonra zaman kinetik bozulmaları önlemek için herhangi bir yüksek geçiren elektronik filtre devre dışı bırakın. Onun kesim frekansı sırayla veya ADC (gürültü yumuşatma azaltır) örnekleme oranının üzerinde olduğu zaman bir low-pass elektronik filtre yararlı olabilir. Sırasıyla 8 cm -1 ve 64 cm -1 spektral ve faz çözünürlük ayarlayın. Ileriye tek tarafına interferogram yakalama moduna ayarlayın. Bu seçenek ile bir interferogram yaklaşık 500 puan gerektirir. 160 kH, örneğin (spektrometre mevcut en yüksek ADC örnekleme hızı ayarlayınz ya da 6,25 mikro-saniye). Yani "dış", için "deney için tetik" Set, lazer ustasıdır. BR (kadar 42 msn) 7.000 ve 20.000 ChR2 (kadar 125 msn): kaydedilecek doğrusal-aralıklı veri noktalarının sayısını ayarlayın. Not: uzun zaman ölçekleri veri toplama 38 tetiklemek için bir dalga jeneratörü bir yarı-logaritmik zaman aralıklı harici TTL darbeleri kullanarak ADC hafızayı taşan olmadan kapalı olabilir, ya da dahili ADC 31 yedek olarak iki paralel geçici kayıt cihazları kullanarak, 32. Numunenin karanlık devlet için bir referans olarak yaklaşık 100 pre-tetik noktaları kaydedin. Not: milisaniyelik bir zaman ölçeğinde, veri kalitesi genelde mobil aynaya dalgalanmalar ile sınırlıdır. 100 Yukarıdaki ön tetik kredi artırılması, bu nedenle önemli ölçüde veri kalitesini artırmak beklenmez vardır. Yani, fotokimyasal ortalamalarının sayısı ayna varsaymak başına, eş-eklemeler sayısını ayarlayıniyon. Br, 20 eş-ekleme (10 Hz uyarma hızı ölçme süresi 20 dakika) kullanın. ChR2 2 co-eklemeler (0.25 Hz uyarma hızında zamanı ölçmek için 70 dakika) kullanmak için BR için deney 10x tekrarlayın ve ChR2 için 35x üç farklı örnek filmler, ayna pozisyonu başına nihayet ~ 200 ko-eklemeler var. 6.. Veri İşleme Ilk ve son ölçümden elde edilen ışık kaynaklı IR spektrumu fark karşılaştırılarak numunenin durumunu teyit edin. Fark spektrumunun yoğunluğunun altındaki ilk ölçümün% 60 damla bir ölçüm atarak göz önünde bulundurun. Kaydedilen İnterferogram ortalama. "Spectrum Hesaplama" bunları ortalama ve eklemek için zaman çözüme İnterferogram seçmek FTIR spektrometresi OPUS yazılımını kullanma. "=" İnterferogram ortalamasını elde etmek için tıklayın. Not: Ne interferogram fazortalama İnterferogram veya tek kanal spektrumları kayıtsız ölçüm sırasında sabittir. Bir sabit bir faz işlem ve ilk için faz spektrumu ve son kaydedilen interferogram karşılaştırılarak teyit edilebilir. Ortalama zaman çözüme tek kanallı spektrumları elde etmek için Fourier ortalama zaman çözüme İnterferogram dönüşümü gerçekleştirmek. Adım 6.2.1 ile aynı yazılımı kullanarak, ortalama zaman çözüme interferogram seçin ve "spektrumları interferogram" için simgesini tıklatın. Mertz faz düzeltme yöntemi, 2 sıfır doldurma faktörü (enstrümantal çözünürlüğü başına iki dijital puan), ve bir apodizasyon fonksiyon (örneğin, üçgen, Blackmann-Harris 3-terimleri, vb) kullanın. Zaman çözüme spektrumları içine zaman çözüme interferogram dönüştürmek için alt "dönüştürmek" tıklayın. Bir "veri nokta tablosunda" veya bir "gibi zaman çözüme tek kanallı veri ihracat, Matlab "kullanarak dosya" OPUS yazılım simgesi "olarak kaydedin. Harici bir programa veri işleme devam edin. Lazer önce tek kanal spektrumunu ortalama ve zaman çözümlü emme fark spektrumları için zaman çözüme tek kanallı verileri dönüştürmek. Gürültü standart sapma, ε kullanarak wavenumber bir fonksiyonu (Şekil 12) olarak fark spektrumları beklenen gürültü standart sapma için bir vektör hesaplamak ve ortalama, S 0 (ν), lazer önceki 100 tek kanal spektrumları: ε / S 0 (ν). Ε değeri ardışık tek kanal spektrumları çıkarılarak ve √ 2 ile düzeltilmiş, standart sapmayı hesaplamak tahmin edilmektedir. Kullanım için çok gürültülü spektral bölgeleri Kaldır (1825 cm -1 ve 850 cm aşağıda, yukarıda, örneğin -1). Bir yarı-logaritmik ortalama (örneğin, 20 spektrumları / saat on) gerçekleştirin. AppearanVerilerin ce artıracak ve spektrumları sayısı kayıp önemli bir bilgi (Şekil 9) olmadan 10 ~ 2 ~ 10 4 düşecektir. Fourier interpolasyon kullanarak (1 puan / cm -1) puan dört kez spektral yoğunluğunu artırın (sıfır doldurma gönderebilir). Not: MATLAB çalışan bir ev yapımı programında 6.4.4 için adımları 6.4.1 gerçekleştirin. Tekil değer ayrışımı, SVD, (Şekil 13) ile elde edilen zaman-çözüldü spektrumları (Şekil 10A) işleyin. Önemli SVD bileşenleri (Şekil 10B) sınırlı sayıda veriyi yeniden veri Denoise başarmak. Not: Biz yerleşik "SVD" fonksiyonunu kullanarak, MATLAB SVD gerçekleştirin.

Representative Results

Şekil 1, ATR spektroskopi için kullanılan elmas iç yansıma elemanının yüzeyinde birikmiş bR bir kuru film bir emme spektrumunu göstermektedir. Peptid bağı (A amit, amit I ve amit II) titreşiminden karakteristik grupları açıkça ayırt edilebilir. Kuru filmin kalınlığı yaklaşık (~ 0.2 cm2) ilave protein (18 ug) miktarını ve ATR yüzeyini dikkate alınarak, ve yaklaşık 1.4 g / cm gibi protein yoğunluğu alınarak, ~ 1 um olarak tahmin edilebilir 3, 58 ve lipidlerin olarak 1.0 g / cm 3, 59 ve 1/3 mor membran 60 (w / w) bir lipid / protein oranı. Kuru film pH 7.4 (Şekil 3), 4 M NaCI, 100 mM NaPi içinde fazlası ile yeniden hidratlandı. Fani dalga probed hacminde hidrasyon düzeyi ve etkili bir protein konsantrasyonu dijital emilim bantları kaldırmak için gerekli ölçeklendirme faktörü çıkartılamazsu. Optimum ölçekleme faktörü, bu durumda tampon% 87 ve yüzeye yakın hacminin örnek% 13 kaplar, yani, 0.87 idi. Hesap protein ve lipid yoğunluğu ve mor membran lipid / protein oranı (yukarıya bakın) içine alarak, biz kaybolan dalga problanmış hacminde 125 mg / ml 'lik bir protein konsantrasyonu etkili olmadan belirleyebilir. Biz, bu durumda, numune, film kalınlığı 1 ila ~ ~ 6 um, tekrar nemlendirme üzerine ~ 6 kez genişletilmiş hidrasyon seviyesi ortaya çıkarabilir. Our için ve en ATR düzenlemeler için, tipik bir 45 ° 'lik geliş açısına,, bir sulu protein film için kaybolan alan (d p) nüfuz etme derinliği 1,800-850 cm -1 61 aralığı içinde 0.3 um ile 0.6 arasında değişir. Fani alanında iki kez d p 61 üzerinde yer alan örnek neredeyse duyarsız olduğu için, ATR deneyde kullanılan protein miktarının ağırlık prensibi, indirgenmiş 5x olabilir sonucunasinyalin önemli bir kayıp ithout. Düşük iyonik mukavemet tamponlar kullanırken filmin daha genişler ve kaybolan alanı ile problanmış hacimde protein miktarı (Şekil 2) azalır. Film şişme ve tampon iyonik kuvvet arasındaki tam bağımlılık lipitlerin doğasına, diğer faktörlerin yanı sıra, bağlı olacaktır. Örneğin, 4 M NaCI kullanılarak mor membran br burada elde edilen şişme benzer bir film polar E içinde yeniden bir zar proteini için elde edilmiştir sadece 0.1 M NaCl 62 kullanılarak coli lipidler. Numune, incelenen pervane hacminin% 5'den daha az işgal etmesi durumunda yüksek iyonik güçlü bir tampon kullanılarak yeniden hidrasyon aşamasını yapıyor düşünün. Hidrasyon sonra şişme Film sabitleyici (Şekil 4) ulaşmak için biraz zaman gerektirir. Mor zarında bR için işlem 12 dakikalık bir zaman sabiti ile, monoexponential: bu istikrarlı rehidre filmi için fazla 30-60 daha dk sürer <pclass = "jove_content"> Şekil 5 aktarımı ile CHR2 bir hidratlanmış filmin bir IR emilim spektrumunu göstermektedir. Burada, hidrasyon gliserol / su karışımı ile oluşturulan kontrollü nem atmosferi için kuru filmin maruz bırakılması ile elde edilmiştir. Spektrumu, su, deterjan ve protein katkılarıyla ayrılabilir. Biz sönme katsayısı spektrumları kullanılarak bunların her birinin miktarını tahmin olabilir, deneysel spektrum uygun ölçekli. Suyu için literatürde 63 yok olma katsayısı spektrumu aldı ve DM için (Şekil 6), 100 mg / ml solüsyonundan ölçülen. Mitokondriyal ADP / ATP taşıyıcı 64 ve bR (Şekil 7): Ayrıca, iki örnek zar proteinleri için sönüm katsayılarını kullanılır. Ölçekleme faktörü sırası ile, 260 ug / cm 2 ve filmde 200 ug / cm 2 lik bir su ve DM kütlesi yüzey yoğunluğunu gösterir. Kalan emilim (Figüre 5, kırmızı çizgi), iki farklı membran proteinleri arasındaki amid II sönüm katsayısı kullanarak 250 ug / cm 2 lik bir yüzey yoğunluğunda olduğu tahmin edilen protein, (bkz. Şekil 6) esas olarak gelir. Protein / deterjan / su mol oranı, sırasıyla 35 kDa, 480 Da ve 18 Da bir moleküler kütlesi ile 1/60/2000 olduğu hesaplandı. BR tipik zaman çözümlü bir adım tarama FT-IR deneyden bir 3D arsa ATR ile elde edilen ve veri toplama, 200 dakika içeren, Şekil 10A 'de sunulmaktadır. Spectra L, bR photocycle M ve N ara-en yüksek nüfus (Şekil 11) ulaşması beklenir, örneğin, belirli zamanlarda elde edilebilir. Onların spektral özellikleri yaygın 13,41,65 tarif edilmiştir ve daha burada ele olmayacaktır. 12. bazı seçilmiş dalga sayısı az zaman izlerini göstermektedir. 1762 ° C'de kinetik Yani, yükselişim -1 (t 1/2 ~ 60 mikro-saniye) retina Schiffbazı 66 Asp85 protonlaşma dinamikleri raporları, ve sıfır onun çürümesi zemin doyurmak toparlanma 67 üzerine onun protonsuzlaştırılmasını gösterir. 1740 cm-1 (t 1/2 ~ 1 milisaniye) de kinetik olumsuz yükselişi Asp96 yan zinciri, Schiff bazı 68 proton verici deprotonasyonu ve raporlar. Sitoplazma 67 onun reprotonation sıfır haberlere yoğunluğu çürüme. Protein yapısal değişikliklerin dinamikleri, oda sıcaklığında 67,69 en-3 ms 'de bir maksimum değişiklik ulaşır amid I ve II amid bölgesinde, emme değişiklikler ile problanabilir. Sorunları Spektroskopik SVD uygulaması 55,56 daha önce gözden geçirilmiştir. A = U S: Kısaca, SVD gibi, bir matris A içine düzenlenmiş deneysel veriler, factorizes <strong> V T. Bu çarpanlara wavenumber üzerinde gürültü bağımlılık hesaba ve bazal 57 dalgalanmalar / sürükleniyor cezalandırmak için modifiye edilebilir. U ve V'nin sütunları sırasıyla, her bir bileşen için SVD ortonormal spektrumları ve zaman izleri vektörleri içerir. S olarak adlandırılan tekil değerler içeren bir köşegenel matristir. U ve V (arka) spektrofotometrik zamansal bileşenler ilgili tekil değer ile nicelleştirilmiştir en küçük kareler, deneysel verileri tanımlamak için önemi azalma olarak görünür. Şekil 13A, bileşen sayısının bir fonksiyonu olarak tekil değerleri gösterir, ve U (soyut spektrumları, Şekil 13B) ve V (soyut zaman izleri, Şekil 13C) ilk sekiz sütun / bileşenleri üretir. Bir ph için beklendiği gibi sinyal (birinci beş bileşenlerinde konsantre edilirotocycle beş ara durumları içeren), büyük ölçüde rastgele gürültü ve hataların diğer kaynaklardan hakim yukarıdaki bileşenleri ile. Deneysel veriler, U ve V, ilk beş sütun ve ilk beş sütun ve S sadece satır ile yeniden inşa edildi. SVD tarafından yeniden veri rütbe beş bir matris için deneysel verilerin en az kare yaklaşımı temsil etmektedir. Yeniden veri kalitesinin iyileştirilmesi (Şekil 10B) gösterir. Yani, büyük ölçüde gürültü (zaman çözümlü bir adım tarama spektroskopisi 25) ortak temel bazı zor fark dalgalanmalar ve sürüklenir, hem de azalır. SVD işlem milisaniye aralığında deneysel zaman izleri (Şekil 12 'de kırmızı çizgiler) kalitesinin iyileştirilmesi için de faydalıdır. ChR2 photocycle için zaman çözümlü bir adım tarama veri yayınlama için yukarıda tarif edilen protokol kullanılarak elde edilmiştir kabaca birikmiş ölçümlerin 120 saat içeren sion deneyler (Şekil 14A). Adım tarama ile elde edilmiş olan zaman çözümlü bir veri 6,25 mikro-saniye ila 125 msn için uzanır. ChR2 ve photocycle tam iyileşme için yaklaşık 60 saniye gerektirir. Photocycle son bölümü hızlı tarama FT-IR kullanılarak kapalı olabilir ve başka bir yerde 48 olarak sunulan adım tarama ve hızlı tarama veri setleri hem birleşti. CHR2 spektral değişiklikler ölçümleri daha zor hale Br elde etmek daha ~ 10 kat daha küçüktür. Özellikle milisaniye aralığında taban salınımları bu düşük emme değişikliklerin açıkça belirginleşmiştir. Bunlar milisaniye ölçeğinde 25 mobil ayna küçük salınımlar nedeniyle vardır. Salınımlar birlikte gürültü kısmı ile büyük ölçüde dikkat çekici verilerin görüntüsünü (Şekil 14B) geliştirerek, SVD ile kaldırılabilir. Güre 1 "fo: İçerik-width =" 5in "src =" / files/ftp_upload/51622/51622fig1highres.jpg "width =" 500 "/> Mor membran Br Şekil 1.. Emme spektrumu, bir ATR aksesuarın üst elmas yüzeyi üzerinde kurutulmuştur. Peptid bağı titreşiminden Aralığı (amit I, II, ve A) gösterilir. Çeşitli iyonik güçlü tamponlar kullanılarak rehidrasyondan sonra br bir film Şekil 2.. Emilim tayfı (4 M NaCl, 100 mM Na 2 HPO seyreltileri 4 / NaH 2, pH 7.4 'de PO 4). Amid II bandın düşüş dikkat edin, örneğin, tampon iyonik kuvvet azalması ile, film şişme artmıştır. Subtracti sonra 1541 cm-1 (amit II maksimum) de emiciliğin yoğunluğu ile ölçülebilir yüzeyine yakın proteinin (ekleme) göreceli miktarı,Tamponun emme katkısının on. Kütle tamponu (4.3 M iyonik kuvveti) ve tampon katkı çıkarıldıktan sonra kullanımdan önce tekrar br bir film Şekil 3,. Absorbsiyon spektrumu. Çıkarma faktör, 0.87, 3,700-3,000 cm arasında güçlü bir su emme kaldırma -1 ve seçildi 2,700-1,800 cm -1 arasında düz bir temel elde etmek. 4.3 M iyonik güçlü bir tamponla rehidrasyondan sonra Br, Şekil 4,. Emilim tayfı (tampon emme Şekil 3 'de olduğu gibi netlik için alınmış olur). Insert rehydrat sonra şişme filmin değişim göstermektediriyonu, 1541 cm-1 de protein amid II absorbans takip etmektedir. Tek bir üstel A fit 12 dakikalık filmi şişme stabilizasyonu için bir zaman sabiti gösterir. Iletim (mavi çizgi) ile ölçülen ChR2 bir hidratlı film Şekil 5. Emilim spektrumu. Söndürme katsayısı su spektrumu (kesikli turuncu hat) ve DM (kesikli mavi çizgi) ölçekli ve (kırmızı çizgi) çıkarıldı. Sıvı su için 25 ° C (~ http://www.ualberta.ca/ jbertie / JBDownload.HTM # Spectra) de ve ADP / ATP taşıyıcı (AAC) bir sulu film için Şekil 6. Çoğaltılmıştır kütle yok olma katsayısı spektrumlan 64 . </s trong> Kütle spektrumu yok olma katsayısı DM (100 mg / ml) çözelti olarak ölçülür ve sonu için bir sulu film edildi. Zamana bağımlı tarama tarama FT-IR ölçümlerinde kullanılan optik filtrenin Şekil 7.. Geçirgenlik. . Şekil 8, Nd, ikinci harmonik (532 nm) ile sağlanan lazer darbelerinin Performansı:. 1000 lazer darbelerinin göreli enerji varyasyon YAG lazer Histogram, ve 0.05 'lik bir standart sapma ile bir normal dağılım için uygun. 1622/51622fig9highres.jpg "width =" 500 "/> Şekil 9. Aralıkları (yeşil, siyah ve mavi çizgiler) aralığı muntazam anda üç temsilcisi dalga adedi de bR absorbans değişimleri Işık kaynaklı ve yarı-logaritmik ortalamaya sonra ~ 20 puan / on (kırmızı çizgiler). Sonra gürültü azaltma dikkat etmek logaritmik ortalama, zaman titreşimleri ortaya milisaniye mertebesinde izler. PH 7.4 (4 M NaCl, 100 mM NaPi) de ATR tarafından kaydedilen br ışık kaynaklı absorbans değişiklikleri Şekil 10,. 3D gösterimi. Beş SVD bileşenleri ile yeniden A) Ham veri. B) Veriler. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. <p class="jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Şekil 11,. L (12.5 mikro-saniye), M (300 mikro-saniye), ve N-(6 msec) ara maddeleri, en çok zenginleştirilmiş seçilen üç kez bR photocycle FT-IR fark absorpsiyon spektrumları. Zaman çözüme adım tarama FT-IR fark spektroskopisi tarafından çözüldü olarak bR photocycle Şekil 12. Proton transferi ve protein omurga dinamikleri. 1.762 cm -1 Asp85 protonasyon / proteinizasyonu dinamikleri raporlar, en ve 1.741 cm absorbans değişiklikler -1 (300 mikro-saniye önce H-bağı değişiklikler dahil) Asp96 protonsuzlaşması / reprotonation dinamikleri üzerinde. 1670 de zaman izleri ve 1.555 cm -1peptit omurgasının konformasyona duyarlı hem de rapor amid I değişiklikler ve II titreşimler,. Geri izleri ham verilere karşılık, ve SVD-tedavi verilerine kırmızı olanlar. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. Şekil 13. BR photocycle deneysel zaman çözüme adım tarama FT-IR veri tekil değer ayrışımı (SVD) (bkz: Şekil 10A). SVD dikkate wavenumber üzerinde gürültü standart sapma bağımlılığını alarak deneysel verileri tartı sonra yapıldı (Şekil 15); 57.. A'da daha önce tarif edildiği gibi, taban dalgalanmaların istatistiksel ağırlığı azaltmak için 1 st türevi ile bir araya) & #160, ilk 50 bileşenleri (siyah daireler) nispi tekil değerlerin arsa. İlk beş bileşenleri bileşenleri (kırmızı daireler) sinyal tahsis edilmiştir. Gürültü bileşenleri için beklenen katlanarak gibi bileşenler çürüme kalanı (kesik gri çizgi). B) İlk sekiz soyut spektrumları (U 8 U 1). C) İlk sekiz soyut zaman izleri (V 8 V 1). Sinyal atanan soyut spektrumları ve zaman izleri kırmızı çizgiler tasvir ve başka siyah çizgilerle. Olan bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. Adım-tarama tarafından kaydedilen ChR2 için ışık kaynaklı IR absorbans değişimleri Şekil 14. 3D gösterimiiletim modunda. adım tarama verileri sadece photocycle bir parçası. A) Ham veri kapsayan. B) beş SVD bileşenleri ile yeniden veri, 125 milisaniye kadar uzanır. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. Bir FT-IR. Farkı absorpsiyon spektrumu Şekil 15.. Tahmini gürültü seviyesi 6.25 mikro saniye olduğu zamansal ve 8 cm -1 1 co-addition/mirror pozisyonlar (500 melaninin) veya ~ 200 co-addition/mirror konumunu içeren bir deney için spektral çözünürlüğü (10 5 melaninin). Değerler, Ayarlanmış Toplam Yansıtma (ATR) ve şanzıman kurulumu için gösterilmiştir.

Discussion

Bir protein üzerindeki zamana bağımlı adım tarama FT-IR deneyler zaman dikkate gereken ilk yönlerinden biri, IR spektroskopisi için uygun bir biçimde, bir numunenin hazırlanmasıdır. Ilgilenilen proteinin dışındaki maddelerden IR emiş azaltılması gerekir, özellikle de suya karşı o. En yaygın yaklaşım, bir film oluşturmak üzere numunenin toplu suyu buharlaştırmak için. Film, bir sulu çözelti içinde bir damlacıklar ekleyerek ya da kontrollü nem atmosferi için filmin maruz bırakılması yoluyla yeniden hidre edilebilir. Her iki durumda da IR absorpsiyon spektroskopisi vasıtasıyla elde hidrasyon seviyesi (bkz. Şekil 3 ve Şekil 5 'e bakınız) tahmin etmek için nasıl mümkün olduğunu göstermiştir. Elde edilen çözelti içinde hidrasyon seviyesi ile karşılaştırıldığında düşük görünse de, işlevsel olarak ilgili proteinlerin sulu filmlerin çalışma yapma, aslında canlı hücreler 70 bulunanlar yakındır. Suyun yanı sıra, bubilmek ve numunedeki lipid ya da deterjan miktarını kontrol etmek önemlidir. Her ikisi de IR emiliminde bir spektroskopik azaltılmış etkiye sahip olacak kadar düşük tutulması, ancak ilgilenilen proteinin bütünlüğünü ve işlevselliği korumak için yeterince yüksek olmalıdır.

Zaman çözülmesi adım tarama spektroskopisi ışıkla tekrarlanabilir tetiklenebilir tersinir reaksiyonlar gösteren proteinlerin sadece delikanlı uygulanabilir (ama hızlı tampon değişimi ile adım-tarama kavrama ilerleme bkz.) 71. , Reaksiyon en az ~ 500x için yeniden üretilebilir olması gerekmektedir adım tarama, en az sayıda 8 cm-1 çözünürlükte 1,800-850 cm -1 bölgeyi kaplayan bir interferogram tamamlayın. Ancak uygulamada, ek bir veri ortalama genellikle aşağı gürültü seviyesini itmek için gereklidir. 200 co-additions/mirror konumda (reaksiyon 10 5 tekrar) için, bir mikro-saniye çözünürlüğü 6,25 absorbans farkı spektrumu bir gürültü sta görüntüleyebilirndard sapma, bir ATR ve -5 x 10 -6 10 x 5 ile 3 arasında bir iletim deneyi (Şekil 15) için -4 x 10 -5 10 x 2 ile 2. Onun daha yüksek foton çıktı, iletim sayesinde ATR, başarıyla gibi ChR2 gibi zayıf emme değişiklikleri veren örneklerin incelenmesi için önemli bir yönü daha ~ 7 daha düşük gürültü seviyesi sağlar. Öte yandan, ATR bir iletim deneyi 5 kat 25 için daha az örnek gerektirir.

Zaman çözüme adım tarama FT-IR spektroskopisi uygulama yavaş photocycles görüntüleme proteinlerin sorunlu: adım-tarama tarafından interferogram kayıt uzun kullanışsız olabilir. Bazı çözümler genellikle artmış protein tüketimi ve deneysel karmaşıklığı 27,74 pahasına ölçümleri hızlandırmak için birden fazla değiştirilebilir numuneleri kullanılarak dayalı bu tür durumlarda 72,73 ile başa çıkmak için sunulmuştur. Bazı durumlarda, bu eski bu sorunu aşmak mümkündürphotocycle kesinlikle tamamlanmadan önce numune gerekçe. CHR2 için,% 99 kurtarma için fotoğraf uyarma 60 saniye sonra gerektiren bir photocycle ile, 4 sn kurtarma zaten% 80 48 olduğunu. Laser darbesi% 10 arasında bir uyarım verimlilik ile, ChR2 moleküllerinin% 98, 0.25 Hz, lazer tekrarlama oranında deneyler yapılması mümkün hale verilmedi-uyarma sonra karanlık durumu 4 saniye içindedir.

Veri işleme mümkün olan en iyi sonuçları elde etmek için gerekli son teknik yönüdür. Logaritmik ortalama gürültüyü azaltır ve aynı zamanda önemli, tekil değer ayrıştırma veya global uydurma kullanarak çarpıtma olmadan posterior veri analizi için bir özelliktir esasını verinin boyutunu küçültür. Logaritmik ortalama Bununla birlikte, ölçümler sırasında, mobil ayna ve diğer 1 / f ses kaynakları (Şekil 9) içinde salınımlarının neden olduğu zaman izleri dalgalanmaların ortalamasını çok başarılı değildir. Temel olarak bu dalgalanmalarmilisaniye aralık ve verilerin bozuk kalitesinde gürültü aşabilir. Tekil değer ayrışımı gürültüsünü azaltmak için verilerin fazlalık yararlanır ve bazı modifikasyonlar ile 57 aynı zamanda taban dalgalanmalara azaltabilir.

Son olarak, bir zaman çözümlü bir adım tarama FT-IR deneyinin sert ve en zaman alıcı kısmı bantların atamaya ve verilerin spektral ve kinetik yorumlanması karşılık gelir. Bakteriyorodopsin için IR fark spektrumları görünen gruplarından on yıllardır pek çok araştırmacı gruplarının birikmiş çalışmaları sayesinde atanmış veya yorumlanmıştır. Bu tür channelrhodopsin-2 gibi bir daha az çalışılan protein için, yukarıda sunulan zaman çözümlü IR deneyleri yer yönlendirmeli mutantlar üzerinde paralel deneyler ile birlikte ve mekanik bir yorumlama 48 ulaşmak için tamamlayıcı teknikleri bilgiler ile bir araya getirilmesi gerekmektedir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to J.H. (FOR-1279, SFB-1078, B3). We thank Tom Resler and Björk Süss for helpful comments.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
FT-IR spectrometer Bruker Vertex 80v Equipped with photovoltaic-MCT detector, an external global, and an oil-free pump. Firmware 2.3.
BaF2 windows korth Kristalle
diamond ATR accesory Smiths detection Nine-reflection DuraDisk
thermostatic bath Julabo  F25
vibration decoupled table OPTA
Pulsed Nd:YAG laser with a second harmonic generator Continuum electro-Optics Minilite 
Optical parametric oscillator (OPO) OPTA BBO-355-VIS/IR S/N 1009
Digital delay/pulse generator  Stanford Research Systems DG535
Pulsed Nd:YAG laser with a third harmonic generator Spectra-Physics Quanta-Ray
Various optical mirrors and lenses ThorLabs
OPUS 7.0  Bruker Software to control Vertex 80v spectrometer
Matlab run time Mathworks Used to run home-made executable programs to preprocess the data
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450, 964-972 (2007).
  2. Lacapère, J. J., Pebay-Peyroula, E., Neumann, J. M., Etchebest, C. Determining membrane protein structures: still a challenge. Trends Biochem. Sci. 32, 259-270 (2007).
  3. Wöhri, A. B., et al. Light-induced structural changes in a photosynthetic reaction center caught by Laue diffraction. Science. 328, 630-633 (2010).
  4. Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Opt. Express. 20, 2706-2716 (2012).
  5. Neutze, R., Moffat, K. Time-resolved structural studies at synchrotrons and X-ray free electron lasers: opportunities and challenges. Curr. Opin. Struc. Biol. 22, 651-659 (2012).
  6. Austin, R. H., et al. Dynamics of carbon monoxide binding by heme proteins. Science. 181, 541-543 (1973).
  7. Alberding, N., et al. Tunneling in ligand binding to heme proteins. Science. 192, 1002-1004 (1976).
  8. Goormaghtigh, E., Cabiaux, V., Ruysschaert, J. M. Determination of soluble and membrane protein structure by Fourier transform infrared spectroscopy. III. Secondary structures. Subcell. Biochem. 23, 405-450 (1994).
  9. Tamm, L. K., Tatulian, S. A. Infrared spectroscopy of proteins and peptides in lipid bilayers. Q. Rev. Biophys. 30, 365-429 (1997).
  10. Arrondo, J. L., Goñi, F. M. Structure and dynamics of membrane proteins as studied by infrared spectroscopy. Prog. Biophys. Mol. Biol. 72, 367-405 (1999).
  11. Barth, A., Zscherp, C. What vibrations tell us about proteins. Q. Rev. Biophys. 35, 369-430 (2002).
  12. Gerwert, K. Molecular reaction-mechanisms of proteins as monitored by time-resolved FTIR Spectroscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 769-773 (1993).
  13. Maeda, A. Application of FTIR spectroscopy to the structural study on the function of bacteriorhodopsin. Isr. J. Chem. 35, 387-400 (1995).
  14. Kandori, H. Role of internal water molecules in bacteriorhodopsin. Biochim. Biophys. Acta. 1460, 177-191 (2000).
  15. Zscherp, C., Barth, A. Reaction-induced infrared difference spectroscopy for the study of protein reaction mechanisms. Biochemistry. 40, 1875-1883 (2001).
  16. Nyquist, R. M., Heitbrink, D., Bolwien, C., Gennis, R. B., Heberle, J. Direct observation of protonation reactions during the catalytic cycle of cytochrome c oxidase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 8715-8720 (2003).
  17. Rich, P. R., Iwaki, M. Methods to probe protein transitions with ATR infrared spectroscopy. Mol. Biosyst. 3, 398-407 (2007).
  18. Noguchi, T. Light-induced FTIR difference spectroscopy as a powerful tool toward understanding the molecular mechanism of photosynthetic oxygen evolution. Photosynth. Res. 91, 59-69 (2007).
  19. Granell, M., Leon, X., Leblanc, G., Padros, E., Lorenz-Fonfria, V. A. Structural insights into the activation mechanism of melibiose permease by sodium binding. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 22078-22083 (2010).
  20. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 16-26 (2008).
  21. Kapanidis, A. N., Strick, T. Biology, one molecule at a time. Trends Biochem. Sci. 34, 234-243 (2009).
  22. Uhmann, W., Becker, A., Taran, C., Siebert, F. Time-resolved FT-IR absorption spectroscopy using a step-scan interferometer. Appl. Spectrosc. 45, 390-397 (1991).
  23. Dioumaev, A. K., Braiman, M. S. Two bathointermediates of the bacteriorhodopsin photocycle, distringuished by nanosecond time-resolved FTIR spectroscopy at room temperature. J. Phys. Chem. B. 101, 1655-1662 (1997).
  24. Rammelsberg, R., Huhn, G., Lübben, M., Gerwert, K. Bacteriorhodopsin’s intramolecular proton-release pathway consists of a hydrogen-bonded network. Biochemistry. 37, 5001-5009 (1998).
  25. Rödig, C., Siebert, F. Errors and artifacts in time-resolved step-scan FT-IR spectroscopy. Appl. Spectrosc. 53, 893-901 (1999).
  26. Brudler, R., Rammelsberg, R., Woo, T. T., Getzoff, E. D., Gerwert, K. Structure of the I1 early intermediate of photoactive yellow protein by FTIR spectroscopy. Nat. Struct. Biol. 8, 265-270 (2001).
  27. Remy, A., Gerwert, K. Coupling of light-induced electron transfer to proton uptake in photosynthesis. Nat. Struct. Biol. 10, 637-644 (2003).
  28. Lórenz-Fonfría, V. A., Furutani, Y., Kandori, H. Active internal waters in the bacteriorhodopsin photocycle. A comparative study of the L and M intermediates at room and cryogenic temperatures by infrared spectroscopy. Biochemistry. 47, 4071-4081 (2008).
  29. Griffiths, P. R., de Haseth, J. A. . Fourier Transform Infrared Spectrometry. , (1986).
  30. Smith, G. D., Palmer, R. A. . Handbook of vibrational spectroscopy. , (2002).
  31. Rammelsberg, R., Heßling, B., Chorongiewski, H., Gerwert, K. Molecular reaction mechanisms of protein monitored by nanosecond step-scan FT-IR difference spectroscopy. Appl. Spectrosc. 51, 558-562 (1997).
  32. Rödig, C., Chizhov, I., Weidlich, O., Siebert, F. Time-resolved step-scan Fourier transform infrared spectroscopy reveals differences between early and late M intermediates of bacteriorhodopsin. Biophys. J. 76, 2687-2701 (1999).
  33. Bromberg, S. E., et al. The mechanism of a C-H bond activation reaction in room-temperature alkane solution. Science. 278, 260-263 (1997).
  34. Rödig, C., Siebert, F. . Handbook of vibrational spectroscopy. , (2002).
  35. Braiman, M. S., Xiao, Y. . Vibrational Spectroscopy of Biological and Polymeric Materials. , 353-418 (2006).
  36. Gerwert, K. . Handbook of vibrational spectroscopy. , (2002).
  37. Koutsoupakis, C., Pinakoulaki, E., Stavrakis, S., Daskalakis, V., Varotsis, C. Time-resolved step-scan Fourier transform infrared investigation of heme-copper oxidases: implications for O2 input and H2O/H+ output channels. Biochim. Biophys. Acta. 1655, 347-352 (2004).
  38. Radu, I., Schleeger, M., Bolwien, C., Heberle, J. Time-resolved methods in biophysics. 10. Time-resolved FT-IR difference spectroscopy and the application to membrane proteins. Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1517-1528 (2009).
  39. Haupts, U., Tittor, J., Oesterhelt, D. Closing in on bacteriorhodopsin: progress in understanding the molecule. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 367-399 (1999).
  40. Lanyi, J. K. Bacteriorhodopsin. Annu. Rev. Physiol. 66, 665-688 (2004).
  41. Heberle, J., Fitter, J., Sass, H. J., Büldt, G. Bacteriorhodopsin: the functional details of a molecular machine are being resolved. Biophys. Chem. 85, 229-248 (2000).
  42. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296, 2395-2398 (2002).
  43. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. 100, 13940-13945 (2003).
  44. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147, 1446-1457 (2011).
  45. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  46. Feldbauer, K., et al. Channelrhodopsin-2 is a leaky proton pump. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12317-12322 (2009).
  47. Nack, M., et al. Kinetics of proton release and uptake by channelrhodopsin-2. FEBS Lett. 586, 1344-1348 (2012).
  48. Lórenz-Fonfría, V. A., et al. Transient protonation changes in channelrhodopsin-2 and their relevance to channel gating. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, (2013).
  49. Heberle, J., Zscherp, C. ATR/FT-IR difference spectroscopy of biological matter with microsecond time resolution. Appl. Spectrosc. 50, 588-596 (1996).
  50. Nyquist, R. M., Ataka, K., Heberle, J. The molecular mechanism of membrane proteins probed by evanescent infrared waves. Chembiochem. 5, 431-436 (2004).
  51. Gerwert, K., Freier, E., Wolf, S. The role of protein-bound water molecules in microbial rhodopsins. Biochim. Biophys. Acta. 1837, 606-613 (2014).
  52. Lórenz-Fonfría, V. A., Heberle, J. Channelrhodopsin unchained: Structure and mechanism of a light-gated cation channel. Biochim. Biophys. Acta. 1837, 626-642 (2014).
  53. Carter, R. O., Lindsay, N. E., Beduhn, D. A solution to base-line uncertainty due to MCT detector nonlinearity in FT-IR. Appl. Spectrosc. 44, 1147-1151 (1990).
  54. Noguchi, T., Sugiura, M. Flash-induced FTIR difference spectra of the water oxidizing complex in moderately hydrated photosystem II core films: effect of hydration extent on S-state transitions. Biochemistry. 41, 2322-2330 (2002).
  55. Henry, E. R., Hofrichter, J. Singular value decomposition: application to analysis of experimental data. Methods Enzymol. 210, 129-192 (1992).
  56. Hendler, R. W., Shrager, R. I. Deconvolutions based on singular value decomposition and the pseudoinverse: a guide for beginners. J. Biochem. Biophys. Methods. 28, 1-33 (1994).
  57. Lórenz-Fonfría, V. A., Kandori, H. Spectroscopic and kinetic evidence on how bacteriorhodopsin accomplishes vectorial proton transport under functional conditions. J. Am. Chem. Soc. 131, 5891-5901 (2009).
  58. Fischer, H., Polikarpov, I., Craievich, A. F. Average protein density is a molecular-weight-dependent function. Protein Sci. 13, 2825-2828 (2004).
  59. Nagle, J. F., Tristram-Nagle, S. Structure of lipid bilayers. Biochim. Biophys. Acta. 1469, 159-195 (2000).
  60. Lee, A. G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochim. Biophys. Acta. 1612, 1-40 (2003).
  61. Goormaghtigh, E., Raussens, V., Ruysschaert, J. M. Attenuated total reflection infrared spectroscopy of proteins and lipids in biological membranes. Biochim. Biophys. Acta. 1422, 105-185 (1999).
  62. Lórenz-Fonfría, V. A., León, X., Padrós, E. Studying substrate binding to reconstituted secondary transporters by attenuated total reflection infrared difference spectroscopy. Methods Mol. Biol. 914, 107-126 (2012).
  63. Bertie, J. E., Lan, Z. D. Infrared intensities of liquids XX: the intensity of the OH stretching band of liquid water revisited, and the best current values of the optical constants of H2O(l) at 25 oC between 15,000 and 1 cm-1. Appl. Spectrosc. 50, 1047-1057 (1996).
  64. Lórenz, V. A., et al. The secondary structure of the inhibited mitochondrial ADP/ATP transporter from yeast analyzed by FTIR spectroscopy. Biochemistry. 40, 8821-8833 (2001).
  65. Heßling, B., Souvignier, G., Gerwert, K. A model-independent approach to assigning bacteriorhodopsin’s intramolecular reactions to photocycle intermediates. Biophys. J. 65, 1929-1941 (1993).
  66. Braiman, M. S., et al. Vibrational spectroscopy of bacteriorhodopsin mutants: light-driven proton transport involves protonation changes of aspartic acid residues 85, 96, and 212. 27, 8516-8520 (1988).
  67. Gerwert, K., Souvignier, G., Hess, B. Simultaneous monitoring of light-induced changes in protein side-group protonation, chromophore isomerization, and backbone motion of bacteriorhodopsin by time-resolved Fourier-transform infrared spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 9774-9778 (1990).
  68. Gerwert, K., Hess, B., Soppa, J., Oesterhelt, D. Role of aspartate-96 in proton translocation by bacteriorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 4943-4947 (1989).
  69. Lórenz-Fonfría, V. A., Kandori, H., Padrós, E. Probing specific molecular processes and intermediates by time-resolved Fourier transform infrared spectroscopy: application to the bacteriorhodopsin photocycle. J. Phys. Chem. B. 115, 7972-7985 (2011).
  70. Ellis, R. J., Minton, A. P. Cell biology: join the crowd. Nature. 425, 27-28 (2003).
  71. Furutani, Y., Kimura, T., Okamoto, K. Development of a rapid Buffer-exchange system for time-resolved ATR-FTIR spectroscopy with the step-scan mode. Biophysics. 9, 123-129 (2013).
  72. Rammelsberg, R., Boulas, S., Chorongiewski, H., Gerwert, K. Set-up for time-resolved step-scan FTIR spectroscopy of noncyclic reactions. Vib. Spectrosc. 19, 143-149 (1999).
  73. Rödig, C., Siebert, F. Monitoring fast reactions of slow cycling systems with time-resolved FTIR spectroscopy. Vib. Spectrosc. 19, 271-276 (1999).
  74. Rödig, C., Siebert, F. Distortion of the L→M transition in the photocycle of the bacteriorhodopsin mutant D96N: a time-resolved step-scan FTIR investigation. FEBS Lett. 445, 14-18 (1999).

Tags

Proton TransferProtein Conformation DynamicsPhotosensitive ProteinsTime-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared SpectroscopyInfrared Difference SpectroscopyPhotoreactionProtonation ChangesProtein Backbone ConformationBacteriorhodopsinChannelrhodopsin-2

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lórenz-Fonfría, V. A., Heberle, J. Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy. J. Vis. Exp. (88), e51622, doi:10.3791/51622 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image