JoVE Journal > Engineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Engineering

نقل بروتون والبروتين التشكل حيوية في وقت حساس البروتينات عن طريق حل خطوة المسح الضوئي فورييه، تحويل الأشعة تحت الحمراء الطيفي

Published: June 27, 2014
doi:
10.3791/51622
,
1Experimental Molecular Biophysics,Freie Universität Berlin

Summary

Key steps of protein function, in particular backbone conformational changes and proton transfer reactions, often take place in the microsecond to millisecond time scale. These dynamical processes can be studied by time-resolved step-scan Fourier-transform infrared spectroscopy, in particular for proteins whose function is triggered by light.

Abstract

رصد ديناميات أيون الهيدروجين الموجب والبروتين العمود الفقري التغييرات التشكل خلال وظيفة البروتين هو خطوة أساسية نحو فهم آلية عمله. أيون الهيدروجين الموجب ومتعلق بتكوين التغييرات تؤثر على نمط الاهتزاز من السلاسل الجانبية الأحماض الأمينية والسندات الببتيد، على التوالي، وكلاهما يمكن بحثها من خلال الأشعة تحت الحمراء (IR) الفرق التحليل الطيفي. للبروتينات وظيفتها يمكن أن تكون متكررة وبتكاثر الناجمة عن الضوء، فمن الممكن الحصول على الأشعة تحت الحمراء مع اختلاف الأطياف (الفرعية) القرار ميكروثانية على نطاق واسع الطيفي باستخدام خطوة تفحص تحويل فورييه تقنية الأشعة تحت الحمراء. مع ~ 10 2 -10 3 التكرار من تفاعل ضوئي، الحد الأدنى من عدد لإكمال المسح في القرار الطيفية معقولة وعرض النطاق الترددي، ومستوى الضوضاء في الفرق الأطياف امتصاص يمكن أن تكون منخفضة مثل ~ 10 – 4، كافية لمتابعة حركية التغييرات أيون الهيدروجين الموجب من حمض أميني واحد. أدنىمستويات الضوضاء يمكن أن يتحقق عن طريق طرح المزيد المتوسط ​​البيانات و / أو المعالجة الرياضية. كمية البروتين المطلوبة لتحقيق النتائج المثلى ما بين 5-100 ميكروغرام، اعتمادا على تقنية أخذ العينات المستخدمة. بشأن متطلبات إضافية، يحتاج البروتين لأن تتركز أولا في انخفاض القوة الأيونية عازلة ومن ثم تجفيفها لتشكيل الفيلم. ورطب الفيلم البروتين قبل التجربة، إما مع قطرات صغيرة من الماء أو الرطوبة في الغلاف الجوي تحت رقابة. يقاس على تحقيق مستوى الماء (غرام من الماء / غرام من البروتين) من امتصاص الطيف تحت الحمراء. لتسليط الضوء على التقنية، درسنا photocycle من يحركها ضوء جرثومي مضخة البروتون في البيئة غشاء الأرجواني الأصلي لها، وعلى ضوء بوابات قناة ايون channelrhodopsin-2 solubilized في صناعة المنظفات.

Introduction

لتوضيح تماما كيف البروتينات أداء وظيفتها، هو مطلوب منها لقياس منهم وهم يعملون، أي على طول مسار رد الفعل الذي غالبا ما ينطوي على سلسلة من السلع الوسيطة وتمتد عدة أوامر من الزمن. الخطوات الرئيسية في وظيفة البروتين غالبا ما تحدث في ميكروثانية إلى ميلي ثانية واحدة الوقت مجموعة 1، ولا سيما العمود الفقري التغييرات متعلق بتكوين ونقل بروتون ردود الفعل في البروتينات الغشاء. البلورات بالأشعة السينية، يمكن القول إن عمود البيولوجيا البنيوية، ويوفر ثابت (متوسط ​​الوقت) كثافة الإلكترون من الانعراج جيدا بلورات البروتين، والمعروف أن من الصعب تنمو مع بروتينات الغشاء 2. يمكن بناء نموذج الذرية 3D على أساس كثافة الإلكترون، على الرغم من ونادرا ما بما في ذلك موقع ذرات الهيدروجين. تقدما ملحوظا في وقت حل البلورات بالأشعة السينية، والاعتماد إما على لاو حيود 3 أو الفيمتو ثانية على نبضات أشعة X 4، يضيف البعد الزمني للمعلومات هيكلية عالية فيالمتأصلة في البلورات بالأشعة السينية 5. ولكن وضع جانبا التحديات التقنية والتحليلية، شعرية الكريستال يمكن أن يضعف العمود الفقري التغييرات متعلق بتكوين وتغيير ديناميات البروتين، وهي القصور التي لا يمكن تجنبها من الأساليب القائمة على بلورات البروتين 5. بالتالي، والجوانب الديناميكية للبروتينات لا تزال أفضل تغطيها وسائل بصرية، ورائدها فلاش التحلل الضوئي 6،7، على الرغم من العيب العامة البصيرة الهيكلية محدودة.

فورييه الطيفي بالأشعة تحت الحمراء تتحول (FT-IR) يجمع بين القرار الزماني للspectroscopies البصرية مع حساسية قيمة لبنية البروتين، والميزة الأخيرة استغلالها في التحقيقات الهيكلية والوظيفية ثابتة لا تعد ولا تحصى على بروتينات الغشاء 8-11. على وجه الخصوص، وقد ثبت FT-IR الفرق التحليل الطيفي لتكون أداة مثالية لدراسة التغيرات الطيفية صغيرة باعتبارها تعبر البروتين من الدولة متبدل الاستقرار إلى 12-19 آخر.

Studieتتطلب ق على ديناميات البروتين، بخلاف على مستوى جزيء واحد 20،21، وهي عملية تحريك للتزامن. وشرع في رد فعل سريع ومريح لا جراحية باستخدام الضوء كما الزناد، كما فعلت في دراسة البروتينات مع photoreactions دوري. ويتمثل أحد التحديات الرئيسية المرتبطة دراسات حل الوقت هو تحقيق القرار الوقت الكافي مع الحفاظ على القرار الطيفية جيدة ونسبة مناسبة إشارة إلى الضوضاء. كما هو ضروري لتغطية مجموعة والطيفية والزمانية واسعة بما فيه الكفاية. وقت حل الخطوة المسح FT-IR الطيفي تتفوق في كل من هذه الجوانب 22، مع أمثلة نشرت تغطي نطاقات طيفية واسعة كما 3،900-850 سم -1 وديناميكية تمتد ~ 9 أوامر من الزمن، مع ما يصل الى 3.5 سم -1 الطيفية و30 القرار الزماني NSEC 23-28.

تظهر الطيف فورييه، تحويل الأشعة تحت الحمراء انخفاض الضوضاء وتحسين دقة الضوئية أكثر منها التشتت 29. Howevإيه، في وضع التسجيل السريع المسح العادي الطيف FT-IR-تعاني من وقت القرار يقتصر على ≥ 5-10 ميللي ثانية نتيجة الحد الأدنى من الوقت المرآة المحمول من تداخل يتطلب لإكمال المسح الضوئي. مع تقنية المسح الضوئي خطوة، في المقابل، يتم فصله الاعتماد وقت الحدث ديناميكية من مدة المسح للتداخل. لفترة وجيزة، والتحركات مرآة المحمول في خطوات منفصلة بدلا من المسح الضوئي بشكل مستمر لإكمال المسح الضوئي. في كل خطوة من هذه الخطوات هو عقد (المحمول) مرآة ثابتة ويتم تسجيل عابرة. وبالتالي، فإن دقة الوقت ويحد من الوقت صعود الزئبق والكادميوم-تلوريد (MCT) كاشف، والذي هو عادة في حدود 10-100 NSEC. في الممارسة العملية، ومجموعة ديناميكية كبيرة للللتداخل (التي تحتوي على إشارة مكثفة في إشارات centerburst والصغيرة في الأجنحة)، ويتطلب لرقمنة السليم التناظرية / المحول الرقمي (ADC) مع ما يصل الى 16-24 بت، مما يؤدي إلى أخذ العينات معدلات يست أعلى من 200 كيلو هرتز ~ (5 μsec) 30. النانوسيكند وقت القرار يمكن أن يتحقق فقط من خلال قياس التغيرات في للتداخل، والتي قليلا ADC 8-12 كافية 23،31-33. وقد نوقشت الجوانب التقنية والتطبيقات 30،34،35 36-38 من وقت حل خطوة تفحص بالتفصيل في مكان آخر.

الغرض من المساهمة الحالية هو توفير بروتوكول اصفا العملية لوقت حل الخطوة المسح FT-IR الطيفي على بروتينات غشاء حساس. هنا، يظهر أداء تقنية لأخذ العينات طريقتين: انتقال وانعكاس مجموع الموهن (ATR). استخدام ATR يسمح العمل في وجود المياه الزائدة، والتي تضمن ليس فقط الظروف ترطيب كامل للبروتين ولكنه يسمح أيضا السيطرة حاد في درجة الحموضة العينة والقوة الأيونية 49،50. ويوضح تجارب المسح الضوئي خطوة على نظامين المختارة: جرثومي وchannelrhodopsin-2.

<p class="jove_content"> وكانت مدفوعة للضوء جرثومي مضخة البروتون (BR) موضوع العديد من الدراسات الفيزيائية الحيوية لأكثر من أربعين سنة 39،40، مما يجعل من البروتين غشاء أفضل مفهومة حتى الآن. من بين العديد من التقنيات التطبيقية لدراسة وظائف BR FT-IR الطيفي بذلت القول إن واحدة من أكبر الآثار. وهي كانت FT-IR الطيفي مفتاح حل الجماعات المتورطة في نقل بروتون عبر غشاء كما شكلت مكان آخر 13،41،51.

Channelrhodopsin (مركز حقوق الانسان) هو بوابات أول ضوء ايون القناة الموجودة في الطبيعة 42،43. الإثارة ضوء مركز حقوق الانسان يؤدي إلى فتح عابرة للقناة أيون. اكتشافه استقر الطريق لتطوير optogenetics، حيث يتم التحكم في العمليات الجزيئية من الضوء 44،45. مركز حقوق الانسان ينتمي، كما BR، لأسرة rhodopsins الميكروبية ولكن على النقيض من غرفة واحدة، كما هو معروف أقل بكثير عن آلية وظيفية 52. ChR2 يجمع بين وظيفته باعتباره الإعلام والتوعيةن قناة مع النشاط بروتون ضخ 46،47. في الآونة الأخيرة، طبقنا الخطوة المسح FT-IR-الطيفي حل الوقت للحل داخل البروتين ردود الفعل نقل بروتون وديناميات البروتين العمود الفقري في التشكل التغييرات ChR2 48.

Protocol

1. الجوانب العامة للعينة وإعداد الصك استخدام مطياف FT-IR التجارية مجهزة لقياسات خطوة مسح وقت حل. للحصول على أفضل النتائج وضع مطياف FT-IR على رأس جدول تنفصل الاهتزاز. إخلاء المقصورة البصريات لبضعة م بار. تطهير العينة مقصورة مع الهواء الجاف أو النيتروجين. وضع مادة شفافة IR مبهمة للإشعاع مرئية أمام كاشف MCT من مطياف FT-IR. هذه الاحتياطات أمر ضروري لمنع القطع الأثرية من نبضة ليزر مثيرة خلال التجارب خطوة المسح الضوئي. ملاحظة: نحن نستخدم الجرمانيوم (قه) نافذة 25 مم. أسبابه معامل الانكسار عالية يفقد كثافة غير مرغوب فيه، تجنب إلى حد كبير باستخدام فلتر قه مع antireflecting الطلاء. تهدئة MCT كاشف ديوار مع النيتروجين السائل. ملاحظة: يفضل استخدام كاشفات الضوئية MCT على photoconductives بسبب استجابتها الخطية، وبالتالي photometr متفوقةجيم دقة وموثوقية خط الأساس 31،53. قبل التركيز العينة المستخدمة في التجارب للا يقل عن 2 ملغم بروتين / مل في منطقة عازلة من منخفضة (<20 ملم) القوة الأيونية لمنع تشكيل بلورات الملح بينما تجفيف التعليق البروتين لتشكيل البروتين فيلم متجانسة. لعينات الرواسب التي، وغسل / التركيز عليها من خلال تطبيق تنبيذ فائق (على سبيل المثال، والبروتينات الغشاء في الجسيمات الشحمية أو في بقع غشاء الخلية). استخدام centricons من قطع السليم للبروتينات التي لا الرواسب (مثل المنظفات البروتينات الغشاء solubilized). لاستخدام أفضل النتائج: أ) الاستعدادات البروتين النقي كما ونشط ممكن؛ ب) نسب الدهون / البروتين ≤ 3 في الوزن للبروتينات في بقع غشاء الخلية أو تشكيلها في الجسيمات الشحمية؛ ج) نسب المنظفات / البروتين ≤ 1 في الوزن لsolubilized المنظفات البروتينات. تجنب استخدام المنظفات أو الدهون التي تتداخل مع تلك من البروتين (على سبيل المثال، CHAPS) نطاقات الذبذبات. </oل> 2. إعداد الموهن إجمالي التجارب انعكاس على جرثومي تحميل ملحق ATR في حجرة عينة من مطياف FT-IR. ملاحظة: نحن نستخدم ATR ZnSe / الماس مع 5 تأملات نشطة. تجنب المواد أشباه الموصلات مثل الجرمانيوم أو السيليكون كعنصر التأمل الداخلي (غضب) من ملحق ATR، كما تتأثر خصائصها البصرية بواسطة الليزر مرئية مثيرة. قياس طائفة واسعة (حوالي 4،000-800 سم -1) الطيف الطاقة في 4 سم -1 قرار من سطح غضب نظيفة من خلال المسح التقليدية السريع FT-IR الطيفي. استخدام هذا الطيف بمثابة مرجع لحساب الطيف امتصاص الأطياف في مرحلة لاحقة. تغطية سطح غضب من ATR مع 20 ميكرولتر من العازلة المستخدمة في وقت لاحق لترطيب العينة (على سبيل المثال، 4 M كلوريد الصوديوم و 100 ملي نابى في درجة الحموضة 7.4). قياس امتصاص الأشعة تحت الحمراء من المخزن المؤقت. إزالة العازلة، وشطف السطح واي غضبالمياه ال. تجنب لمس السطح. إزالة السائل المتبقي من سطح غضب من قبل تدفق الهواء الشديد. انتشرت ~ 3 ميكرولتر من جرثومي (BR) في الأغشية الأرجواني (~ البروتين 6 ملغ / مل في الماء منزوع الأيونات) على رأس السطح غضب (~ 0.2 سم 2 المنطقة). تجف تعليق البروتين تحت تيار لطيف من الهواء الجاف حتى يتحقق فيلم. قياس طيف الامتصاص للفيلم الجافة (انظر الشكل 1). بلطف إضافة 20-40 ميكرولتر من العازلة للقوة الأيونية عالية لترطيب الفيلم الجافة (على سبيل المثال، 4 M كلوريد الصوديوم و 100 ملي نابى في درجة الحموضة 7.4). ملاحظة: إن قوة الأيونية عالية يمنع تورم المفرطة من الفيلم الغشاء، مما يسمح للاحتفاظ بقدر من البروتين ممكن على مقربة من سطح سبر (الشكل 2). تغطية حامل ATR مع غطاء لمنع تبخر المياه. اختياريا، ووضع غطاء سترة متصلة حمام الدورة الدموية تعيين إلى 25 درجة مئوية لمدة التحكم في درجة الحرارة. لبروتينات مع photocycles طويلة (& #62؛ ثانية)، التحكم في درجة الحرارة قد تزيد استقرار الأساس. قياس الطيف الامتصاصية. تقدير النسبة المئوية للعينة المتبقية بالقرب من السطح بعد الإماهة للفيلم من خلال طرح طيف الامتصاص المخزن المؤقت (الشكل 3). تأكيد استقرار الفيلم تورم عن طريق تسجيل امتصاص الأطياف في 5-20 دقيقة فترات بعد الإماهة (الشكل 4). هذه الخطوة اختيارية ولكن الموصى بها. 3. بإجراء تجارب البث في المنظفات-solubilized Channelrhodopsin-2 إضافة 10 ميكرولتر من ChR2 (~ 10 ملغم بروتين / مل) المذاب في 5 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5 ملي HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.4) وديكل-مالتوزيد (DM) في وسط الأحيائي 2 من النافذة 20 مم. انتشر ذلك مع مساعدة من طرف micropipette إلى 6-8 مم (بروتين الكثافة السطحية لل~ 200 ميكروغرام / سم 2). تشكيل باليود الفيلمنانوغرام تدفق لطيف من الهواء الجاف. للحصول على أفضل النتائج تأكد من أن الفيلم هو متجانسة والتي يبلغ قطرها مطابقة تقريبا حجم شعاع الأشعة تحت الحمراء في أكبر الفتحة. هيدرات الفيلم عن طريق إضافة 3-5 ميكرولتر من مزيج من الجلسرين / المياه الموزعة في 3-5 قطرات حول الفيلم الجافة، وإغلاقه بإحكام مع نافذة ثانية باستخدام شقة سيليكون يا الدائري من ≥ 1 مم. ملاحظة: نسبة خليط الجلسرين / المياه تسيطر على الرطوبة النسبية بين النوافذ 54. لعينات hydroscopic استخدام نسبة 7/3 أو 2/8 الجلسرين / الماء (ث / ث). يجب قطرات الجلسرين / الماء أبدا أن يكون على اتصال مباشر مع الفيلم البروتين. إدراج الأحيائي 2 نوافذ تقع في حامل. منع الضوء على التوالي من الوصول إلى كشف من خلال تغطية النافذة العينة مع مادة مبهمة الأشعة تحت الحمراء، مثل الورق، مع وجود ثقب مطابقة حجم الفيلم رطب. وضع حامل في العينة المقصورة. السيطرة على درجة الحرارة من حامل إلى 25 درجةC بواسطة سترة الحرارية متصلة درجة الحرارة التي تسيطر عليها حمام الدورة الدموية. وقياس طيف الامتصاص. تأكد من أن الحد الأقصى للامتصاص في المنطقة أميد الأول (~ 1،700-1،620 سم -1) هو في حدود 0.6-1.0. تقدير كتلة ونسبة المولي من البروتين / المنظفات / الماء من امتصاص الطيف من الفيلم رطب (الشكل 5) باستخدام معامل الانقراض إشارة أطياف للمياه، DM، والبروتينات الغشاء ممثل (الشكل 6). انتظر حتى تستقر على مستوى الترطيب قبل إجراء التجارب خطوة في الفحص (≥ 1 ساعة). 4. التعديل وتزامن الليزر مثيرة لإجراء التجارب على استخدام BR الانبعاثات التوافقي الثاني من بدون تاريخ نابض: YAG الليزر (λ = 532 نانومتر) لتحريك photocycle. التجارب التي تنطوي على ChR2، استخدام الإثارة من λ = 450 نانومتر على النحو المنصوص عليه اوبمذبذب حدودي تلك الواقعة على الدولة (OPO) مدفوعا التوافقي الثالث (λ = 355 نانومتر) من الثانية: YAG الليزر. التأكد من أن نبضة ليزر قصيرة بما فيه الكفاية (~ 10 NSEC) لتقليل الثانوي الصور الإثارة. ملاحظة: يجب أن تكون الطاقة من نبضات الليزر ثابتة قدر الإمكان. في الإعداد لدينا، وكثافة الليزر يتقلب ≤ 10٪ حول القيمة المتوسطة، كما أكد عن طريق قياس رد الفعل من ليزر عن طريق الثنائي الضوئي متصلة مسجل عابرة ودمج الاستجابة (الشكل 8). زوجين ليزر للعينة. ضبط كثافة الطاقة من الليزر في العينة إلى 2-3 ميغا جول / سم 2 لكل نبضة باستخدام السلطة متر. لإعداد ATR، استخدام الألياف البصرية توضع فوق الغطاء ATR. لنقل التجارب، واستخدام المرايا لجلب الليزر لعينة، وإذا لزم الأمر، والعدسات إما collimate أو تتباعد شعاع الليزر إلى قطر أعلى قليلا من حجم الفيلم العينة. مزامنة عالج بالليزرص النبض مع تسجيل البيانات عن طريق مطياف. استخدام Q-التبديل التدريجي متزامنة TTL نبض الالكترونيات من الثانية: YAG الليزر لتشغيل مطياف. تعيين معدل الإثارة من الثانية: YAG الليزر إلى 10 هرتز لالأخ و0.25 هرتز لChR2، على التوالي. استخدام مولد نبض تأخير (PDG) للسيطرة على معدل الإثارة ليزر إذا كان معدل تكرار الثانية: YAG الليزر ليست قابلة للتعديل بسهولة. توصيل مصباح مزامنة من الثانية: YAG الليزر إلى PDG المدخلات الزناد الخارجية. يوفر PDG إخراج ~ 190 μsec تأخر TTL نبض إلى Q-التبديل متزامنة في المدخلات من الثانية: YAG الليزر لتحريك إحلال. بوابة PDG لقبول الزناد الخارجية إلا بعد فترة معينة من الزمن منذ الزناد المقبولة الماضي (100 ميللي ثانية للغرفة واحدة أو 4 ثانية لChR2). 5. وقت حل-الاستعدادات الخطوة مسح وإعدادات وضع منخفض تمرير مرشح بصري في مسار بصري. لإجراء قياسات خطوة المسح الضوئي وحلها في الوقت 1،800-850 سم -1 المدى الطيفي، واستخدام مبهمة مرشح أعلاه و1،950 سم -1 مع انتقال حسن (> 50-80٪) أدناه 1،800 سم -1 (الشكل 7). تغيير كاشف من AC إلى وضع DC-الديناميكي. ملاحظة: بعد هذا التعديل إشارة للتداخل لن تتذبذب حول الصفر ولكن حول قيمة المعروفة باسم على مستوى العاصمة. استخدام أكبر الفتحة ممكن شعاع من مطياف لأعلى تدفق الفوتون، وبالتالي أفضل إشارة إلى الضجيج، ولكن ضمن حدود الخطي للكشف. جلب على مستوى العاصمة من الصفر للتداخل وتعديل المكسب الإلكترونية للاستفادة بشكل أفضل من مجموعة ديناميكية من التناظرية الرقمية تحويل (ADC). تحقيق على مستوى العاصمة تعويض عن طريق تطبيق الجهد التحيز إلى إشارة التي قدمتها قبل مكبر للصوت. ملاحظة: يتم تضمين هذا الخيار في حديث الطيف FT-IR. على خلاف ذلك، وهو جهاز خارجي الصنع يمكن استخدامها بدلا من ذلك، وضعت بين المضخم وADC 38. الرعاية ومن ثمهناك حاجة للتأكد من أن هذه الالكترونيات الجهاز سريعة والخطية. بدء قائمة خطوة تفحص مطياف FT-IR. تعيين عرض النطاق الترددي الطيفي المستهدفة لقياس خطوة المسح الضوئي ل1،975.3-0 سم -1. ضبط عرض النطاق الترددي الطيفي لجزء صغير من متجه مموج موجه بالليزر وني (1/8 عشر في هذه القضية)، وهو ما يتجاوز بقليل من قطع للمرشح بصري. تعطيل أي مرشح الإلكترونية تمريرة عالية لمنع تشوهات حركية في أوقات لاحقة. مرشح تمرير منخفض الإلكترونية يمكن أن تكون مفيدة عندما تردد قطع منه هو في النظام أو فوق معدل أخذ العينات من ADC (يقلل من الضوضاء التعرجات). تعيين الطيفية وقرار المرحلة إلى 8 سم -1 سم -1 و 64، على التوالي. تعيين طريقة اكتساب للتداخل إلى جانب واحد إلى الأمام. مع هذه الخيارات للتداخل واحدة يتطلب حوالي 500 نقطة. تعيين معدل أخذ العينات من ADC إلى أعلى المتاحة في مطياف (على سبيل المثال، 160 KH. ض، أو 6.25 μsec) تعيين "الزناد لتجربة" إلى "خارجية"، أي ليزر هو سيد. تعيين عدد من نقاط البيانات متباعدة خطيا ليتم تسجيلها: 7،000 لالأخ (تصل إلى 42 ميللي ثانية) و 20،000 لChR2 (تصل إلى 125 مللي ثانية). ملاحظة: يمكن تغطية أطول نطاقات زمنية دون تفيض الذاكرة ADC باستخدام شبه غاريثمي البقول TTL الخارجي متباعدة الوقت من مولد موجة لتحريك الحصول على البيانات 38، أو عن طريق استخدام اثنين من مسجلات عابرة موازية كبدائل للADC الداخلية 31، 32. انقاذ حوالي 100 نقطة قبل الزناد كمرجع للدولة الظلام من العينة. ملاحظة: في ميلي ثانية واحدة مقياس الوقت نوعية البيانات غالبا ما تكون محدودة من قبل تقلبات في المرآة المحمول. زيادة نقاط قبل الزناد فوق 100 هو، لذلك، ليس من المتوقع أن تحسن بشكل كبير من جودة البيانات. تعيين عدد من زملاء الإضافات، أي عدد من المتوسطات من تفاعل ضوئي في مرآة يفترضأيون. لالأخ، استخدم 20 شارك في الإضافات (20 دقيقة لقياس الوقت في 10 هرتز معدل الإثارة). لاستخدام ChR2 2 المشارك الإضافات (70 دقيقة لقياس الوقت عند 0.25 هرتز معدل الإثارة) تكرار التجربة 10X لالأخ، و35X على ثلاثة أفلام مختلفة لعينة ChR2، ليكون في النهاية ~ 200 شارك الإضافات لكل موقف المرآة. 6. معالجة البيانات تأكيد حالة من العينة من خلال مقارنة يسببها ضوء الأشعة تحت الحمراء الفرق الطيف تم الحصول عليها من أول وقياس الماضي. تنظر نبذ أي قياسات حيث تنخفض كثافة الطيف الفرق أقل من 60٪ من القياس الأول. ويبلغ متوسط ​​interferograms المسجلة. باستخدام برنامج OPUS من مطياف FTIR حدد interferograms وقت حل في المتوسط ​​وإضافتها إلى "الطيف حاسبة". انقر فوق "=" للحصول على متوسط ​​interferograms. ملاحظة: عندما يكون مرحلة من مراحل للتداخلهو ثابت أثناء عملية القياس هو غير مبال متوسط ​​interferograms أو على قناة واحدة الأطياف. ويمكن التأكد من مرحلة مستمرة من خلال حساب ومقارنة الطيف المرحلة لأول وسجلت للتداخل الماضي. إجراء تحويل فورييه للinterferograms وقت حل متوسط ​​للحصول على متوسط ​​الوقت حل واحد قناة الأطياف. باستخدام نفس البرنامج كما في الخطوة 6.2.1، حدد متوسط ​​للتداخل وقت حل وانقر فوق رمز "للتداخل الأطياف ل". استخدام أسلوب ميرتز مرحلة التصحيح، وهو عامل صفر ملء 2 (نقطتين الرقمية في قرار فعال)، وظيفة apodization (على سبيل المثال، مثلث، Blackmann هاريس 3 فصول، الخ). انقر أسفل "تحويل" لتحويل للتداخل في وقت حل أطياف وقت حل. تصدير البيانات قناة واحدة وقت حل بأنه "نقطة بيانات الجدول" أو "؛ ماتلاب "ملف باستخدام" حفظ ك "أيقونة في برنامج التأليف. مواصلة معالجة البيانات في برنامج خارجي. متوسط ​​قناة واحدة قبل أطياف الليزر، وتحويل البيانات قناة واحدة وقت حل إلى حل فارق التوقيت امتصاص الأطياف. حساب متجه للضوضاء الانحراف المعياري المتوقع في الفرق الأطياف بوصفها وظيفة من متجه مموج موجه (الشكل 12)، وذلك باستخدام الانحراف المعياري الضوضاء، ε، ويعني، S 0 (ν)، من 100 واحد قناة أطياف الليزر السابقة: ε / S 0 (ν). ويقدر قيمة ε طرح متتالية قناة واحدة الأطياف واحتساب الانحراف المعياري تصحيحها عن طريق √ 2. إزالة المناطق الطيفية صاخبة جدا ليكون الاستخدام (على سبيل المثال، أعلاه 1،825 سم -1 وأقل من 850 سم -1). إجراء بمعدل شبه غاريثمي (على سبيل المثال، 20 العقد / الوقت أطياف). وappearanسوف م من البيانات وتحسين سيتم تخفيض عدد من الأطياف من ~ 10 ~ 10 4 إلى 2 دون أي معلومات مهمة فقدت (الشكل 9). زيادة أربعة أضعاف الكثافة الطيفية للنقطة (1 نقطة ل/ سم -1) باستخدام فورييه الاستيفاء (إضافة الصفر ملء). ملاحظة: نحن تنفيذ الخطوات 6.4.1 إلى 6.4.4 في برنامج الصنع تعمل في MATLAB. معالجة الحصول على وقت حل الأطياف (الشكل 10A) مع تجزئ القيمة المفرد، SVD، (الشكل 13). إنجاز تقليل الضوضاء البيانات عن طريق إعادة بناء البيانات مع عدد محدود من مكونات SVD كبيرة (الشكل 10B). ملاحظة: نحن أداء SVD في MATLAB، وذلك باستخدام وظيفة "SVD" المضمنة.

Representative Results

ويبين الشكل 1 لامتصاص الطيف من فيلم الجافة من غرفة واحدة تترسب على سطح عنصر التأمل الداخلي الماس يستخدم لATR الطيفي. نطاقات مميزة من الاهتزازات من السندات الببتيد (أميد A، أميد الأول والثاني أميد) بشكل واضح للتمييز. يمكن تقدير سمك التقريبية للفيلم الجاف ~ 1 ميكرون، بالنظر إلى كمية من البروتين المضافة (18 ميكروغرام) وسطح ATR (~ 0.2 سم 2)، وأخذ كثافة البروتين كما ~ 1.4 جم / سم 3 و 58 و الدهون كما 1.0 جم / سم 3، 59 ونسبة الدهون / البروتين من 1/3 (ث / ث) في الغشاء الأرجواني 60. تم ممهى الفيلم الجافة مع فائض من 4 M كلوريد الصوديوم، و 100 ملي نابى في درجة الحموضة 7.4 (الشكل 3). تركيز مستوى الماء والبروتين الفعال في حجم بحثها من قبل موجة زائل يمكن استخلاصه من عامل التحجيم اللازمة لإزالة رقميا العصابات امتصاصمن المياه. كان عامل التحجيم الأمثل 0.87، وهذا يعني أنه في هذه الحالة المخزن المؤقت تحتل 87٪ والعينة 13٪ من حجم بالقرب من السطح. مع الأخذ بعين الاعتبار البروتين وكثافة الدهون ونسبة الدهون / البروتين في الأغشية الأرجواني (انظر أعلاه)، نستنتج تركيز البروتين فعالية من 125 ملغ / مل في حجم بحثها من قبل موجة زائل. نستنتج من مستوى ترطيب أنه في هذه الحالة بالذات، وسعت سماكة الفيلم عينة ~ 6 مرات على الإماهة، من ~ ~ 1 إلى 6 ميكرون. لبزاوية 45 درجة الحادث، نموذجية لدينا وبالنسبة لمعظم الترتيبات ATR، وعمق تغلغل مجال زائل (د ع) لفيلم البروتين تتراوح ما بين 0.3 رطب و 0.6 ميكرومتر في الطول 1،800-850 -1 فاصل 61. لأن الحقل زائل غير حساس تقريبا إلى عينة يقع مرتين أعلاه د ص 61، نستنتج أن كمية البروتين التي استخدمت في التجربة ATR يمكن أن يكون من حيث المبدأ انخفاض 5X ثithout أي خسائر كبيرة في الإشارة. عند استخدام مخازن انخفاض القوة الأيونية الفيلم يوسع أكثر من ذلك، ويتم تقليل كمية البروتين في حجم بحثها حسب الحقل زائل (الشكل 2). فإن الاعتماد الدقيق بين تورم الفيلم وقوة الأيونية المخزن المؤقت تعتمد، من بين عوامل أخرى، على طبيعة الدهون. على سبيل المثال، تم الحصول على الفيلم مماثلة تورم كما تم الحصول عليها هنا لمكتب الاتصالات الراديوية في غشاء الأرجواني باستخدام 4 M كلوريد الصوديوم لبروتين الغشاء تشكيلها في القطبية E. الدهون القولونية باستخدام فقط 0.1 M كلوريد الصوديوم 62. إذا تحتل العينة أقل من 5٪ من حجم سبر النظر في إعادة القيام-الخطوة الترطيب باستخدام العازلة ارتفاع القوة الأيونية. الفيلم تورم بعد ترطيب يتطلب بعض الوقت للوصول إلى الاستقرار (الشكل 4). لمكتب الاتصالات الراديوية في غشاء الأرجواني هو عملية monoexponential، مع ثابت من الوقت 12 دقيقة: أنها لا تستغرق أكثر من 30-60 دقيقة لفيلم ممهى مستقرة <pالطبقة = "jove_content"> ويبين الشكل 5 على امتصاص الأشعة تحت الحمراء الطيف من فيلم رطب من ChR2 التي حصلت عليها انتقال العدوى. هنا، وقد تحقق الترطيب من خلال تعريض الفيلم جافة لجو من الرطوبة تسيطر المقدمة من خليط من الجلسرين / المياه. يمكن أن تتحلل الطيف إلى مساهمات من المياه والمنظفات والبروتين. نحن يمكن تقدير كمية كل واحد منهم باستخدام معامل الانقراض الأطياف، لتتناسب مع حجم الطيف التجريبية. للمياه أخذنا الطيف معامل الانقراض من الأدب 63، ونحن لDM قياسه من حل 100 ملغ / مل (الشكل 6). كنا أيضا معاملات الانقراض لمدة ممثل البروتينات الغشاء: والميتوكوندريا الناقل ADP / ATP 64 و BR (الشكل 7). عامل التحجيم يشير كتلة كثافة المياه السطحية وDM 260 ميكروغرام / سم 2 و 200 ميكروغرام / سم 2 في الفيلم، على التوالي. امتصاص المتبقية (الارقام ..ه 5، خط أحمر) ويأتي أساسا من البروتين، وتشير التقديرات إلى أن في مناطق ذات كثافة سطح 250 ميكروغرام / سم 2 باستخدام معامل الانقراض أميد الثاني من اثنين من البروتينات الغشاء مختلفة (انظر الشكل 6). تم حساب نسبة المولي للبروتين / المنظفات / الماء لتكون 1/60/2000 باستخدام الكتلة الجزيئية من 35 كيلو دالتون، 480 دا، دا و 18، على التوالي. ويرد مؤامرة 3D من وقت حل نموذجي خطوة المسح FT-IR التجربة على غرفة واحدة في الشكل 10A، التي حصلت عليها ATR والتي تنطوي على 200 دقيقة من الحصول على البيانات. أطياف يمكن استخراجها في أوقات محددة، على سبيل المثال عندما L، ومن المتوقع أن تصل إلى أعلى سكانها (الشكل 11) وسيطة M و N من photocycle ر. وقد وصفت السمات الطيفية لها على نطاق واسع 13،41،65 وسوف لا مزيد من النقاش هنا. الشكل 12 يظهر-آثار بعض الوقت في wavenumbers المحدد. وهي صعود حركية في 1،762 جم -1 (ر 1/2 ~ 60 μsec) تقارير عن ديناميات Asp85 أيون الهيدروجين الموجب من قاعدة الشبكية شيف 66، واضمحلاله إلى الصفر يشير نزع بروتون طلبها استرداد الأرض أشبع 67. صعود السلبية للحركية في 1،740 سم -1 (ر 1/2 ~ 1 ميللي ثانية) تقارير عن نزع بروتون من Asp96 سلسلة جانبية، الجهة المانحة بروتون إلى قاعدة شيف 68. اضمحلال شدة لتقارير صفر على reprotonation في الفترة من السيتوبلازم 67. ديناميات البروتين التغييرات متعلق بتكوين يمكن بحثها من خلال التغيرات في امتصاص أميد الأول والثاني أميد المنطقة، والتي يصل أقصى تغير في ~ 3 ميللي ثانية في درجة حرارة الغرفة 67،69. وقد استعرضت تطبيق SVD إلى الطيفية المشاكل قبل 55،56. لفترة وجيزة، SVD factorizes البيانات التجريبية، وترتيبها في مصفوفة A، على النحو التالي: A = U S <stroنانوغرام> V T. يمكن تعديل هذا إلى عوامل لحساب الاعتماد على الضجيج ومتجه مموج موجه لمعاقبة تقلبات / الانجرافات في الأساس 57. أعمدة U و V تحتوي على أطياف المتعامدة المعيرة وآثار الزمن ناقلات لكل مكون SVD، على التوالي. S هو مصفوفة قطري تحتوي على ما يسمى القيم المفرد. تظهر (مجردة) مكونات الطيف الزمنية في U و V في خفض صلة لوصف البيانات التجريبية بمعنى الأقل مربع، كميا بواسطة المرتبطة قيمتها المفرد. يبين الشكل 13A القيم المفرد بوصفها وظيفة من عدد مكون، و يستنسخ ثمانية أعمدة الأول / مكونات U (أطياف مجردة، الشكل 13B) والخامس (آثار الزمن مجردة، 13C الشكل). ويتركز إشارة في المكونات الخمسة الأولى (كما هو متوقع لفتاهotocycle تحتوي على خمس ولايات وسيطة)، مع المكونات أعلاه تهيمن إلى حد كبير من الضجيج العشوائي وغيرها من مصادر الأخطاء. أعيد بناؤها البيانات التجريبية فقط باستخدام الأعمدة الخمسة الأولى من U و V، والأعمدة الخمسة الأولى والصفوف من S. البيانات أعيد بناؤها من قبل SVD يمثل أفضل تقريب الأقل مربع من البيانات التجريبية إلى مصفوفة من المرتبة الخامسة. تظهر البيانات التي أعيد بناؤها تحسين نوعية (الشكل 10B). وهي، يتم تقليل الضوضاء إلى حد كبير، وكذلك بعض التقلبات والانجرافات بالكاد في الأساس (مشتركة في وقت حل من خطوة والمسح الطيفي 25). تجهيز SVD هو مفيد خاصة لتحسين نوعية التجريبية، آثار الزمن في مجموعة ميلي ثانية (خطوط حمراء في الشكل 12). تم الحصول على بيانات المسح الخطوة وقت حل لphotocycle ChR2 باستخدام بروتوكول الموصوفة أعلاه لtransmis تجارب سيون (الشكل 14A)، التي تنطوي على ما يقرب من 120 ساعة من القياسات المتراكمة. البيانات التي تم جمعها وقت حل بخطوة المسح تمتد من 6.25 إلى 125 ميللي ثانية μsec. وphotocycle من ChR2 يتطلب حوالي 60 ثانية للانتعاش الكامل. أحدث جزء من photocycle يمكن تغطيتها باستخدام المسح السريع FT-IR، واندمجت كل من خطوات الفحص ومجموعات البيانات السريع المسح كما وردت في أماكن أخرى 48. التغيرات الطيفية للChR2 هي ~ 10 أضعاف أصغر من تلك التي تحصل عليها من غرفة واحدة، مما يجعل قياسات أكثر تحديا. خصيصا، التذبذبات في الأساس في النطاق ميلي ثانية واحدة أصبح واضحا بشكل واضح في هذه التغييرات امتصاص منخفضة. هذه هي نتيجة لتقلبات صغيرة في المرآة المتنقلة في النطاق الزمني ميلي ثانية واحدة 25. التذبذبات، جنبا إلى جنب مع جزء من الضوضاء، ويمكن إزالتها بشكل كبير SVD، وتحسين ملحوظ في مظهر البيانات (الشكل 14B). جوري 1 "لل: محتوى العرض =" 5IN "سرك =" / files/ftp_upload/51622/51622fig1highres.jpg "العرض =" 500 "/> الشكل 1. طيف الامتصاص من غرفة واحدة في الغشاء الأرجواني المجفف على أعلى سطح الماس من ملحق ATR. البولنجر من الاهتزازات من السندات الببتيد (أميد الأول والثاني، وA) والمشار إليها. الشكل 2. طيف الامتصاص للفيلم من غرفة واحدة بعد الإماهة باستخدام مخازن من مختلف نقاط القوة الأيونية (التخفيفات من 4 M كلوريد الصوديوم، و 100 ملي نا 2 هبو 4 / ناه 2 ص 4 في درجة الحموضة 7.4). لاحظ انخفاضا من النطاق أميد الثاني، أي زيادة الفيلم تورم، مع تناقص القوة الأيونية المخزن المؤقت. (إدراج) كمية من البروتين النسبية بالقرب من السطح، كميا من شدة الامتصاصية في 1،541 سم -1 (أميد الثاني كحد أقصى) بعد subtractiعلى مساهمة امتصاص العازلة. الرقم 3. طيف الامتصاص للفيلم من غرفة واحدة ممهى مع العازلة السائبة (4.3 M القوة الأيونية) وبعد الطرح للمساهمة العازلة. وقد تم اختيار عامل الطرح، 0.87، لإزالة امتصاص الماء قوية بين 3،700-3،000 سم -1 و للحصول على خط الأساس شقة بين 2،700-1،800 سم -1. الشكل 4. الطيف امتصاص BR بعد الإماهة العازلة مع 4.3 M القوة الأيونية (تم طرح امتصاص عازلة لوضوح كما في الشكل 3). يبين إدراج تطور الفيلم تورم بعد rehydratأيون، تليها الامتصاصية البروتين أميد الثاني في 1،541 سم -1. A مناسبا لالأسي واحد يشير إلى وجود مستمر الوقت للفيلم تورم استقرار 12 دقيقة. الرقم 5. طيف الامتصاص للفيلم رطب من ChR2 يقاس نقل (الخط الأزرق). تم تحجيم معامل الطيف انقراض المياه (الخط البرتقالي متقطع) وDM (خط متقطع السماوي) وطرح (خط أحمر). الرقم 6. مستنسخة الانقراض الجماعي معامل الأطياف عند 25 درجة مئوية لمدة الماء السائل (http://www.ualberta.ca/ ~ jbertie / JBDownload.HTM # الأطياف) وفيلم رطب من ADP / ATP الناقل (AAC) 64 . </s ترونج> تم قياس معامل الطيف الانقراض الجماعي في حل لDM (100 ملغ / مل)، وفيلم رطب لر. الرقم 7. النفاذية للمرشح الضوئية المستخدمة في فحص المسح قياسات وقت حل FT-IR. الشكل 8 الأداء من نبضات الليزر التي تقدمها التوافقي الثاني (532 نانومتر) من الثانية:. YAG الليزر الرسم البياني من التباين من الطاقة النسبية لل1،000 نبضات الليزر، ويصلح لتوزيع جاوس مع انحراف معياري 0.05. 1622/51622fig9highres.jpg "العرض =" 500 "/> الرقم 9. الضوء الناجم عن التغيرات الامتصاصية من غرفة واحدة في ثلاثة wavenumbers ممثل في وقت موحد تباعد فترات (الأخضر والأسود، والخطوط الزرقاء) وبعد المتوسط ​​شبه لوغاريتمي ل~ 20 نقطة / العقد (الخطوط الحمراء). لاحظ الحد من الضوضاء بعد المتوسط ​​لوغاريتمي، وكشف عن التذبذب في ذلك الوقت يتتبع في نطاق ميلي ثانية واحدة. الرقم 10. تمثيل 3D من التغيرات التي يسببها الامتصاصية للضوء لالأخ سجلتها ATR في درجة الحموضة 7.4 (4 M كلوريد الصوديوم، و 100 ملي نابى). A) البيانات الخام. ب) بيانات بناؤها مع خمسة عناصر SVD. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <p class="jove_content" fس: together.within المحافظة على صفحة = "دائما"> الرقم 11. FT-IR امتصاص الفرق أطياف photocycle BR ثلاث مرات في اختيارها حيث L (12.5 μsec)، M (300 μsec)، وN (6 ميللي ثانية) سيطة هي الأكثر التخصيب. الرقم 12. نقل بروتون والبروتين ديناميكية العمود الفقري في غرفة واحدة photocycle كما تحل بخطوة المسح FT-IR الفرق الطيفي وقت حل. التغييرات الامتصاصية في و1،762 سم -1 تقارير عن ديناميات أيون الهيدروجين الموجب / نزع بروتون من Asp85، في 1،741 سم -1 على ديناميات نزع بروتون / reprotonation من Asp96 (بما في ذلك التغييرات H-الترابط قبل 300 μsec). للآثار في وقت و1،670 1،555 سم -1التغييرات في تقرير أميد الأول والثاني الاهتزازات، سواء حساسة للالتشكل من العمود الفقري الببتيد. آثار مرة أخرى تتوافق مع البيانات الخام، والحمراء منها لبيانات SVD المعاملة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الرقم 13. التحلل المفرد القيمة (SVD) من خطوة مسح البيانات FT-IR-حلها الوقت التجريبي للphotocycle BR (انظر الشكل 10A). تم تنفيذ SVD بعد وزنها البيانات التجريبية مع مراعاة الضوضاء الانحراف المعياري الاعتماد على متجه مموج موجه (الشكل 15)؛ جنبا إلى جنب مع شارع مشتقة من 1 إلى خفض الوزن الإحصائية التقلبات خط الأساس، كما هو موضح قبل 57 ألف) & #160؛ مؤامرة من القيم المفرد النسبية للمكونات ال 50 الأولى (الدوائر السوداء). يتم تعيين المكونات الخمسة الأولى للإشارة إلى مكونات (الدوائر الحمراء). بقية مكونات الاضمحلال كما أضعافا مضاعفة المتوقع للضوضاء مكونات (انظر خط رمادي متقطع). B) سنة ثمانية أطياف مجردة (U U 1 إلى 8). C) أولا ثمانية مجردة، آثار الزمن (V 1 إلى 8 V). وصفت أطياف مجردة وآثار الوقت المخصص للإشارة في الخطوط الحمراء، ومع خطوط سوداء على خلاف ذلك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. تمثيل الرقم 14. 3D التغيرات التي يسببها ضوء الأشعة تحت الحمراء الامتصاصية للChR2 سجلت خطوة المسحفي وضع الإرسال. يمتد البيانات خطوة مسح حتى 125 ميللي ثانية، لا تغطي سوى جزء من photocycle. A) البيانات الخام. ب) بيانات بناؤها مع خمسة عناصر SVD. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. الرقم 15. مستوى الضجيج المقدر في FT-IR. طيف الامتصاص الفرق عند 6.25 μsec الزمنية و8 سم -1 القرار الطيفية للتجربة تنطوي على موقف co-addition/mirror 1 (500 photoreactions) أو ~ 200 موقف co-addition/mirror (10 photoreactions 5). يتم عرض القيم للانعكاس الموهنة الإجمالي (ATR) والإعداد الإرسال.

Discussion

واحدة من أولى الجوانب التي يحتاج الاعتبار عند تنفيذ الخطوة المسح تجارب حل الوقت FT-IR على البروتين هو إعداد عينة في شكل مناسب لأطياف الأشعة تحت الحمراء. امتصاص الأشعة تحت الحمراء من المواد الأخرى من البروتين من الفائدة يجب أن يتم تخفيض، خصوصا أن من المياه. النهج الأكثر شيوعا هو لتتبخر الماء الجزء الأكبر من العينة لتشكيل الفيلم. الفيلم يمكن ممهى إما عن طريق إضافة بعض قطرات من محلول مائي أو من خلال تعريض الفيلم لجو من الرطوبة التي تسيطر عليها. أظهرنا كيف في كلتا الحالتين فمن الممكن لتقدير مستوى الترطيب التي تم الحصول عليها عن طريق الأشعة تحت الحمراء طيف الامتصاص (انظر الشكل 3 والشكل 5). على الرغم من أن مستويات الترطيب التي تم الحصول عليها قد تظهر منخفضة مقارنة مع تلك الموجودة في الحل، فهي في الواقع على مقربة من تلك الموجودة في الخلايا الحية 70، مما يجعل الدراسة من الأفلام رطب من البروتينات ذات الصلة وظيفيا. إلى جانب الماء، فإنهالمهم أيضا أن نعرف والسيطرة على كمية من الدهون أو المنظفات في العينة. كلا يجب أن تبقى منخفضة بما يكفي ليكون لها تأثير الطيفية انخفاض في امتصاص الأشعة تحت الحمراء، ولكن مرتفعة بما يكفي للحفاظ على سلامة وظيفة البروتين من الفائدة.

الوقت حل من خطوة والمسح الطيفي هو فقط قابلة للتطبيق بشكل مباشر إلى البروتينات تظهر ردود الفعل عكسها التي يمكن أن تسبب بتكاثر من الضوء (ولكن نرى تقدما في اقتران خطوة المسح مع تبادل عازلة السريع) 71. في خطوة مسح يحتاج رد فعل لتكون قابلة للتكرار على الأقل ~ 500X، والحد الأدنى لعدد لاستكمال للتداخل تغطي 1،800-850 سم -1 في المنطقة 8 سم -1 القرار. في الممارسة العملية، ومع ذلك، مطلوب المتوسط ​​عموما بيانات إضافية لدفع مستوى الضوضاء إلى أسفل. 200 موقف co-additions/mirror (10 5 التكرار من رد فعل) طائفة 6.25 μsec القرار الفرق الامتصاصية يمكن عرض ستا الضوضاءالانحراف ndard بين 2 × 10 -5 و 2 × 10 -4 لATR وبين 5 × 10 -6 و 3 × 10 -5 لتجربة الإرسال (الشكل 15). وذلك بفضل ارتفاع الفوتون الإنتاجية، انتقال يسمح ل~ 7 مستويات الضوضاء أقل من ATR، أحد الجوانب الرئيسية لدراسة عينات إعطاء التغييرات امتصاص ضعيفة مثل ChR2 بنجاح. من ناحية أخرى، يتطلب ATR 5-25 مرات العينة أقل من تجربة الإرسال.

تطبيق خطوات الفحص FT-IR الطيفي وقت حل إشكالية للبروتينات بطيئة عرض photocycles: يمكن للتداخل مسجلا خطوة المسح تصبح غير عملية طويلة. وقدمت بعض الحلول للتعامل مع مثل هذه الحالات 72،73، غالبا ما تقوم على استخدام عينات صرف متعددة لتسريع القياسات على حساب زيادة استهلاك البروتين والتعقيد التجريبية 27،74. في بعض الحالات من الممكن للتحايل على هذه المشكلة عن طريق السابقنقلا عن العينة قبل اكتمال photocycle بدقة. لChR2، مع photocycle تتطلب بعد الصور الإثارة 60 ثانية لاسترداد 99٪، فإن الانتعاش في 4 ثانية هو بالفعل من 80٪ 48. مع كفاءة الإثارة من 10٪ لكل نبضة ليزر، و 98٪ من الجزيئات ChR2 في الظلام الدولة 4 ثانية بعد الصور الإثارة، مما يجعل من الممكن إجراء تجارب بمعدل تكرار الليزر إلى 0.25 هرتز.

معالجة البيانات هو أحد الجوانب التقنية النهائية اللازمة لتحقيق أفضل النتائج الممكنة. المتوسط ​​لوغاريتمي يقلل من الضوضاء، والمهم أيضا، ويقلل من حجم البيانات دون تشوهات، وهي الميزة الأساسية لتحليل البيانات الخلفية باستخدام تجزئ القيمة المفرد أو تركيب العالمي. المتوسط ​​لوغاريتمي هو، ومع ذلك، لم تكن ناجحة جدا في المتوسط ​​من تقلبات في الوقت-آثار الناجمة عن التذبذبات في المرآة المحمولة وغيرها من مصادر الضوضاء 1 / و خلال القياسات (الشكل 9). هذه التقلبات في خط الأساسيمكن أن يتجاوز الضجيج في نطاق ميلي ثانية واحدة وإفساد نوعية البيانات. تجزئ القيمة المفرد يستفيد من التكرار من البيانات للحد من الضوضاء، ومع بعض التعديلات 57 أنها يمكن أن تقلل أيضا تقلبات في الأساس.

أخيرا، والأكثر استهلاكا للوقت والجزء الأصعب من خطوة المسح التجربة وقت حل FT-IR يتوافق مع تخصيص نطاقات وتفسير الطيفية والحركية للبيانات. لجرثومي العديد من العصابات التي تظهر في الأشعة تحت الحمراء الفرق الأطياف تم تعيينها أو تفسيرها بفضل العمل المتراكم من العديد من الجماعات الباحث على مدى عقود. لبروتين أقل بكثير مدروسة، مثل channelrhodopsin-2، تحتاج التجارب IR-حلها الوقت المعروضة أعلاه لتكون مصحوبة تجارب موازية على المسوخ الموجه الموقع وجنبا إلى جنب مع المعلومات من تقنيات تكميلية للتوصل إلى تفسير الآلية 48.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to J.H. (FOR-1279, SFB-1078, B3). We thank Tom Resler and Björk Süss for helpful comments.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
FT-IR spectrometer Bruker Vertex 80v Equipped with photovoltaic-MCT detector, an external global, and an oil-free pump. Firmware 2.3.
BaF2 windows korth Kristalle
diamond ATR accesory Smiths detection Nine-reflection DuraDisk
thermostatic bath Julabo  F25
vibration decoupled table OPTA
Pulsed Nd:YAG laser with a second harmonic generator Continuum electro-Optics Minilite 
Optical parametric oscillator (OPO) OPTA BBO-355-VIS/IR S/N 1009
Digital delay/pulse generator  Stanford Research Systems DG535
Pulsed Nd:YAG laser with a third harmonic generator Spectra-Physics Quanta-Ray
Various optical mirrors and lenses ThorLabs
OPUS 7.0  Bruker Software to control Vertex 80v spectrometer
Matlab run time Mathworks Used to run home-made executable programs to preprocess the data
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450, 964-972 (2007).
  2. Lacapère, J. J., Pebay-Peyroula, E., Neumann, J. M., Etchebest, C. Determining membrane protein structures: still a challenge. Trends Biochem. Sci. 32, 259-270 (2007).
  3. Wöhri, A. B., et al. Light-induced structural changes in a photosynthetic reaction center caught by Laue diffraction. Science. 328, 630-633 (2010).
  4. Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Opt. Express. 20, 2706-2716 (2012).
  5. Neutze, R., Moffat, K. Time-resolved structural studies at synchrotrons and X-ray free electron lasers: opportunities and challenges. Curr. Opin. Struc. Biol. 22, 651-659 (2012).
  6. Austin, R. H., et al. Dynamics of carbon monoxide binding by heme proteins. Science. 181, 541-543 (1973).
  7. Alberding, N., et al. Tunneling in ligand binding to heme proteins. Science. 192, 1002-1004 (1976).
  8. Goormaghtigh, E., Cabiaux, V., Ruysschaert, J. M. Determination of soluble and membrane protein structure by Fourier transform infrared spectroscopy. III. Secondary structures. Subcell. Biochem. 23, 405-450 (1994).
  9. Tamm, L. K., Tatulian, S. A. Infrared spectroscopy of proteins and peptides in lipid bilayers. Q. Rev. Biophys. 30, 365-429 (1997).
  10. Arrondo, J. L., Goñi, F. M. Structure and dynamics of membrane proteins as studied by infrared spectroscopy. Prog. Biophys. Mol. Biol. 72, 367-405 (1999).
  11. Barth, A., Zscherp, C. What vibrations tell us about proteins. Q. Rev. Biophys. 35, 369-430 (2002).
  12. Gerwert, K. Molecular reaction-mechanisms of proteins as monitored by time-resolved FTIR Spectroscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 769-773 (1993).
  13. Maeda, A. Application of FTIR spectroscopy to the structural study on the function of bacteriorhodopsin. Isr. J. Chem. 35, 387-400 (1995).
  14. Kandori, H. Role of internal water molecules in bacteriorhodopsin. Biochim. Biophys. Acta. 1460, 177-191 (2000).
  15. Zscherp, C., Barth, A. Reaction-induced infrared difference spectroscopy for the study of protein reaction mechanisms. Biochemistry. 40, 1875-1883 (2001).
  16. Nyquist, R. M., Heitbrink, D., Bolwien, C., Gennis, R. B., Heberle, J. Direct observation of protonation reactions during the catalytic cycle of cytochrome c oxidase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 8715-8720 (2003).
  17. Rich, P. R., Iwaki, M. Methods to probe protein transitions with ATR infrared spectroscopy. Mol. Biosyst. 3, 398-407 (2007).
  18. Noguchi, T. Light-induced FTIR difference spectroscopy as a powerful tool toward understanding the molecular mechanism of photosynthetic oxygen evolution. Photosynth. Res. 91, 59-69 (2007).
  19. Granell, M., Leon, X., Leblanc, G., Padros, E., Lorenz-Fonfria, V. A. Structural insights into the activation mechanism of melibiose permease by sodium binding. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 22078-22083 (2010).
  20. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 16-26 (2008).
  21. Kapanidis, A. N., Strick, T. Biology, one molecule at a time. Trends Biochem. Sci. 34, 234-243 (2009).
  22. Uhmann, W., Becker, A., Taran, C., Siebert, F. Time-resolved FT-IR absorption spectroscopy using a step-scan interferometer. Appl. Spectrosc. 45, 390-397 (1991).
  23. Dioumaev, A. K., Braiman, M. S. Two bathointermediates of the bacteriorhodopsin photocycle, distringuished by nanosecond time-resolved FTIR spectroscopy at room temperature. J. Phys. Chem. B. 101, 1655-1662 (1997).
  24. Rammelsberg, R., Huhn, G., Lübben, M., Gerwert, K. Bacteriorhodopsin’s intramolecular proton-release pathway consists of a hydrogen-bonded network. Biochemistry. 37, 5001-5009 (1998).
  25. Rödig, C., Siebert, F. Errors and artifacts in time-resolved step-scan FT-IR spectroscopy. Appl. Spectrosc. 53, 893-901 (1999).
  26. Brudler, R., Rammelsberg, R., Woo, T. T., Getzoff, E. D., Gerwert, K. Structure of the I1 early intermediate of photoactive yellow protein by FTIR spectroscopy. Nat. Struct. Biol. 8, 265-270 (2001).
  27. Remy, A., Gerwert, K. Coupling of light-induced electron transfer to proton uptake in photosynthesis. Nat. Struct. Biol. 10, 637-644 (2003).
  28. Lórenz-Fonfría, V. A., Furutani, Y., Kandori, H. Active internal waters in the bacteriorhodopsin photocycle. A comparative study of the L and M intermediates at room and cryogenic temperatures by infrared spectroscopy. Biochemistry. 47, 4071-4081 (2008).
  29. Griffiths, P. R., de Haseth, J. A. . Fourier Transform Infrared Spectrometry. , (1986).
  30. Smith, G. D., Palmer, R. A. . Handbook of vibrational spectroscopy. , (2002).
  31. Rammelsberg, R., Heßling, B., Chorongiewski, H., Gerwert, K. Molecular reaction mechanisms of protein monitored by nanosecond step-scan FT-IR difference spectroscopy. Appl. Spectrosc. 51, 558-562 (1997).
  32. Rödig, C., Chizhov, I., Weidlich, O., Siebert, F. Time-resolved step-scan Fourier transform infrared spectroscopy reveals differences between early and late M intermediates of bacteriorhodopsin. Biophys. J. 76, 2687-2701 (1999).
  33. Bromberg, S. E., et al. The mechanism of a C-H bond activation reaction in room-temperature alkane solution. Science. 278, 260-263 (1997).
  34. Rödig, C., Siebert, F. . Handbook of vibrational spectroscopy. , (2002).
  35. Braiman, M. S., Xiao, Y. . Vibrational Spectroscopy of Biological and Polymeric Materials. , 353-418 (2006).
  36. Gerwert, K. . Handbook of vibrational spectroscopy. , (2002).
  37. Koutsoupakis, C., Pinakoulaki, E., Stavrakis, S., Daskalakis, V., Varotsis, C. Time-resolved step-scan Fourier transform infrared investigation of heme-copper oxidases: implications for O2 input and H2O/H+ output channels. Biochim. Biophys. Acta. 1655, 347-352 (2004).
  38. Radu, I., Schleeger, M., Bolwien, C., Heberle, J. Time-resolved methods in biophysics. 10. Time-resolved FT-IR difference spectroscopy and the application to membrane proteins. Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1517-1528 (2009).
  39. Haupts, U., Tittor, J., Oesterhelt, D. Closing in on bacteriorhodopsin: progress in understanding the molecule. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 367-399 (1999).
  40. Lanyi, J. K. Bacteriorhodopsin. Annu. Rev. Physiol. 66, 665-688 (2004).
  41. Heberle, J., Fitter, J., Sass, H. J., Büldt, G. Bacteriorhodopsin: the functional details of a molecular machine are being resolved. Biophys. Chem. 85, 229-248 (2000).
  42. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296, 2395-2398 (2002).
  43. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. 100, 13940-13945 (2003).
  44. Zhang, F., et al. The microbial opsin family of optogenetic tools. Cell. 147, 1446-1457 (2011).
  45. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).
  46. Feldbauer, K., et al. Channelrhodopsin-2 is a leaky proton pump. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 12317-12322 (2009).
  47. Nack, M., et al. Kinetics of proton release and uptake by channelrhodopsin-2. FEBS Lett. 586, 1344-1348 (2012).
  48. Lórenz-Fonfría, V. A., et al. Transient protonation changes in channelrhodopsin-2 and their relevance to channel gating. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, (2013).
  49. Heberle, J., Zscherp, C. ATR/FT-IR difference spectroscopy of biological matter with microsecond time resolution. Appl. Spectrosc. 50, 588-596 (1996).
  50. Nyquist, R. M., Ataka, K., Heberle, J. The molecular mechanism of membrane proteins probed by evanescent infrared waves. Chembiochem. 5, 431-436 (2004).
  51. Gerwert, K., Freier, E., Wolf, S. The role of protein-bound water molecules in microbial rhodopsins. Biochim. Biophys. Acta. 1837, 606-613 (2014).
  52. Lórenz-Fonfría, V. A., Heberle, J. Channelrhodopsin unchained: Structure and mechanism of a light-gated cation channel. Biochim. Biophys. Acta. 1837, 626-642 (2014).
  53. Carter, R. O., Lindsay, N. E., Beduhn, D. A solution to base-line uncertainty due to MCT detector nonlinearity in FT-IR. Appl. Spectrosc. 44, 1147-1151 (1990).
  54. Noguchi, T., Sugiura, M. Flash-induced FTIR difference spectra of the water oxidizing complex in moderately hydrated photosystem II core films: effect of hydration extent on S-state transitions. Biochemistry. 41, 2322-2330 (2002).
  55. Henry, E. R., Hofrichter, J. Singular value decomposition: application to analysis of experimental data. Methods Enzymol. 210, 129-192 (1992).
  56. Hendler, R. W., Shrager, R. I. Deconvolutions based on singular value decomposition and the pseudoinverse: a guide for beginners. J. Biochem. Biophys. Methods. 28, 1-33 (1994).
  57. Lórenz-Fonfría, V. A., Kandori, H. Spectroscopic and kinetic evidence on how bacteriorhodopsin accomplishes vectorial proton transport under functional conditions. J. Am. Chem. Soc. 131, 5891-5901 (2009).
  58. Fischer, H., Polikarpov, I., Craievich, A. F. Average protein density is a molecular-weight-dependent function. Protein Sci. 13, 2825-2828 (2004).
  59. Nagle, J. F., Tristram-Nagle, S. Structure of lipid bilayers. Biochim. Biophys. Acta. 1469, 159-195 (2000).
  60. Lee, A. G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochim. Biophys. Acta. 1612, 1-40 (2003).
  61. Goormaghtigh, E., Raussens, V., Ruysschaert, J. M. Attenuated total reflection infrared spectroscopy of proteins and lipids in biological membranes. Biochim. Biophys. Acta. 1422, 105-185 (1999).
  62. Lórenz-Fonfría, V. A., León, X., Padrós, E. Studying substrate binding to reconstituted secondary transporters by attenuated total reflection infrared difference spectroscopy. Methods Mol. Biol. 914, 107-126 (2012).
  63. Bertie, J. E., Lan, Z. D. Infrared intensities of liquids XX: the intensity of the OH stretching band of liquid water revisited, and the best current values of the optical constants of H2O(l) at 25 oC between 15,000 and 1 cm-1. Appl. Spectrosc. 50, 1047-1057 (1996).
  64. Lórenz, V. A., et al. The secondary structure of the inhibited mitochondrial ADP/ATP transporter from yeast analyzed by FTIR spectroscopy. Biochemistry. 40, 8821-8833 (2001).
  65. Heßling, B., Souvignier, G., Gerwert, K. A model-independent approach to assigning bacteriorhodopsin’s intramolecular reactions to photocycle intermediates. Biophys. J. 65, 1929-1941 (1993).
  66. Braiman, M. S., et al. Vibrational spectroscopy of bacteriorhodopsin mutants: light-driven proton transport involves protonation changes of aspartic acid residues 85, 96, and 212. 27, 8516-8520 (1988).
  67. Gerwert, K., Souvignier, G., Hess, B. Simultaneous monitoring of light-induced changes in protein side-group protonation, chromophore isomerization, and backbone motion of bacteriorhodopsin by time-resolved Fourier-transform infrared spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 9774-9778 (1990).
  68. Gerwert, K., Hess, B., Soppa, J., Oesterhelt, D. Role of aspartate-96 in proton translocation by bacteriorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 4943-4947 (1989).
  69. Lórenz-Fonfría, V. A., Kandori, H., Padrós, E. Probing specific molecular processes and intermediates by time-resolved Fourier transform infrared spectroscopy: application to the bacteriorhodopsin photocycle. J. Phys. Chem. B. 115, 7972-7985 (2011).
  70. Ellis, R. J., Minton, A. P. Cell biology: join the crowd. Nature. 425, 27-28 (2003).
  71. Furutani, Y., Kimura, T., Okamoto, K. Development of a rapid Buffer-exchange system for time-resolved ATR-FTIR spectroscopy with the step-scan mode. Biophysics. 9, 123-129 (2013).
  72. Rammelsberg, R., Boulas, S., Chorongiewski, H., Gerwert, K. Set-up for time-resolved step-scan FTIR spectroscopy of noncyclic reactions. Vib. Spectrosc. 19, 143-149 (1999).
  73. Rödig, C., Siebert, F. Monitoring fast reactions of slow cycling systems with time-resolved FTIR spectroscopy. Vib. Spectrosc. 19, 271-276 (1999).
  74. Rödig, C., Siebert, F. Distortion of the L→M transition in the photocycle of the bacteriorhodopsin mutant D96N: a time-resolved step-scan FTIR investigation. FEBS Lett. 445, 14-18 (1999).

Tags

Proton TransferProtein Conformation DynamicsPhotosensitive ProteinsTime-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared SpectroscopyInfrared Difference SpectroscopyPhotoreactionProtonation ChangesProtein Backbone ConformationBacteriorhodopsinChannelrhodopsin-2

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lórenz-Fonfría, V. A., Heberle, J. Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy. J. Vis. Exp. (88), e51622, doi:10.3791/51622 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image