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Engineering

Proton Transfer e conformazione proteica Dynamics in proteine ​​fotosensibili da Time-risolto Step-scan trasformata di Fourier Infrared Spectroscopy

Published: June 27, 2014
doi:
10.3791/51622
,
1Experimental Molecular Biophysics,Freie Universität Berlin

Summary

Key steps of protein function, in particular backbone conformational changes and proton transfer reactions, often take place in the microsecond to millisecond time scale. These dynamical processes can be studied by time-resolved step-scan Fourier-transform infrared spectroscopy, in particular for proteins whose function is triggered by light.

Abstract

Monitoraggio delle dinamiche di protonazione e proteine ​​backbone cambiamenti di conformazione durante la funzione di una proteina è un passo essenziale verso la comprensione del suo meccanismo. Protonazione e conformazionali cambiamenti riguardano il modello di vibrazione di catene laterali di aminoacidi e del legame peptidico, rispettivamente, entrambi i quali possono essere controllato di spettroscopia infrarossa differenza (IR). Per le proteine ​​la cui funzione può essere ripetutamente e riproducibile innescata dalla luce, è possibile avere spettri infrarossi differenza con (sub) risoluzione microsecondo in un range spettrale ampia utilizzando il passo scansione trasformata di Fourier tecnica dell'infrarosso. Con ~ 10 2 -10 3 ripetizioni del fotoreazione, il numero minimo per completare una scansione a ragionevole risoluzione spettrale e larghezza di banda, il livello di rumore negli spettri differenza di assorbimento può essere basso come ~ 10 – 4, sufficiente seguire le cinetiche di modifiche protonazione di un singolo amminoacido. Minorelivelli di rumore può essere realizzato da più media di dati e / o elaborazione matematica. La quantità di proteina necessaria per ottenere risultati ottimali è tra 5-100 mg, a seconda della tecnica di campionamento utilizzato. Sui requisiti aggiuntivi, la proteina deve essere prima concentrato in un buffer bassa forza ionica e quindi essiccato per formare una pellicola. Il film proteina è idratata prima dell'esperimento, sia con piccole goccioline di acqua o umidità atmosferica sotto controllo. Il livello di idratazione raggiunto (g di acqua / g di proteina) è misurato da uno spettro di assorbimento IR. Per mostrare la tecnica, abbiamo studiato la fotociclo del batteriorodopsina pompa protonica luce-driven nel suo ambiente nativo membrana viola, e della luce-dipendenti canale ionico channelrhodopsin-2 solubilizzati in detergente.

Introduction

Per chiarire completamente come le proteine ​​svolgono la loro funzione, è necessario misurare come funzionano, cioè lungo un percorso di reazione che spesso comporta una serie di intermedi e si estende diversi ordini di tempo. Passaggi chiave della funzione della proteina si svolgono spesso in microsecondo per millisecondo di tempo 1, in particolare dorsali cambiamenti conformazionali e trasferimenti protone reazioni in proteine ​​di membrana. Cristallografia a raggi X, forse il pilastro della biologia strutturale, fornisce statiche (time-media) densità di elettroni da ben diffrazione cristalli proteici, notoriamente difficili da crescere con proteine ​​di membrana 2. Un modello atomico 3D può essere costruito sulla base di densità elettronica, anche se raramente compresa la posizione degli atomi di idrogeno. Notevoli progressi in cristallografia a raggi X risolta nel tempo, basandosi sia su diffrazione Laue 3 oppure al femtosecondi impulsi di raggi X 4, aggiunge la dimensione temporale all'alta informazioni strutturali inherent di cristallografia a raggi X 5. Ma mettendo da parte le sfide tecniche e analitiche, il reticolo cristallino può compromettere la spina dorsale cambiamenti conformazionali e modificare la dinamica delle proteine, un difetto inevitabile di metodi basati sui cristalli proteici 5. Di conseguenza, gli aspetti dinamici di proteine ​​sono ancora meglio coperti da metodi ottici, come sperimentato dal flash fotolisi 6,7, anche se con l'inconveniente generale della limitata comprensione strutturale.

Spettroscopia infrarossa trasformata di Fourier (FT-IR) combina la risoluzione temporale di spettroscopie ottiche con una preziosa sensibilità a struttura proteica, l'ultima caratteristica sfruttata in innumerevoli studi strutturali e funzionali statici sulle proteine ​​di membrana 8-11. In particolare, la spettroscopia differenza FT-IR ha dimostrato di essere uno strumento ideale per studiare piccoli cambiamenti spettrali come transiti di proteine ​​da uno stato metastabile ad un altro 12-19.

Studies sulla dinamica delle proteine, diverse a livello di singola molecola 20,21, richiedono un processo di attivazione per la sincronizzazione. Una reazione è convenientemente iniziata veloce e non invasivo utilizzando la luce come trigger, come fatto nello studio delle proteine ​​con photoreactions ciclici. Una sfida maggiore associata a studi risolta nel tempo è il raggiungimento della risoluzione temporale sufficiente pur mantenendo una buona risoluzione spettrale e opportuno rapporto segnale-rumore. Anche essenziale è quello di coprire una gamma sufficientemente ampia spettrale e temporale. Step-scan-tempo risolto spettroscopia FT-IR eccelle in tutti questi aspetti 22, con esempi pubblicati coprono intervalli spettrali larga come 3,900-850 cm -1 e dinamica che si estende ~ 9 ordini di tempo, fino a 3,5 centimetri -1 spettrale e 30 risoluzione temporale nsec 23-28.

Spettrometri a trasformata di Fourier IR mostrano rumore ridotto e una maggiore accuratezza fotometrica su quelli dispersivi 29. Tuter, nella modalità di registrazione rapida scansione normale spettrometri FT-IR soffrono di una risoluzione temporale limitato a ≥ 5-10 msec come conseguenza del tempo minimo lo specchio mobile dell'interferometro richiede di completare una scansione. Con la tecnica step-scan, al contrario, la dipendenza dal tempo della manifestazione dinamica è disaccoppiato dalla durata della scansione dell'interferometro. In breve, lo specchio mobile si sposta a passi discreti anziché scansione continua per completare una scansione. In ciascuna di queste fasi del (mobile) Specchio è tenuto fisso e un transitorio viene registrato. Così, la risoluzione temporale è limitata dal tempo di salita del mercurio-cadmio-tellururo (MCT) rilevatore, che è tipicamente nell'intervallo di 10-100 nsec. In pratica, l'ampia gamma dinamica del interferogramma (contenente un intenso segnale nei segnali centerburst e piccoli nelle ali), è necessario per una corretta digitalizzazione un convertitore analogico / digitale (ADC) con ben 16-24 bit, portando a campionamento tariffe non superiori a ~ 200 kHz(5 msec) 30. Nanosecondo risoluzione temporale può essere realizzato misurando solo le variazioni del interferogramma, per cui un bit ADC 8-12 è sufficiente 23,31-33. Aspetti tecnici 30,34,35 e applicazioni 36-38 di step-scan risolta nel tempo sono state discusse in dettaglio altrove.

Lo scopo del contributo è di fornire un protocollo che descrive le pratiche di passo-scan spettroscopia FT-IR risolta nel tempo sulle proteine ​​di membrana fotosensibili. Qui, le prestazioni della tecnica sono presentati due metodi di campionamento: trasmissione e riflessione totale attenuata (ATR). L'uso di ATR permette di lavorare in presenza di acqua in eccesso, che non solo assicura la completa idratazione condizioni per la proteina ma permette anche il controllo acuta del campione pH e forza ionica 49,50. Esperimenti di Step-scansione sono illustrati su due sistemi selezionati: batteriorodopsina e channelrhodopsin-2.

<p class="jove_content"> Il batteriorodopsina pompa protonica luce-driven (Br) è stata oggetto di numerosi studi biofisici per oltre 40 anni 39,40, il che rende la proteina di membrana più capito finora. Tra le numerose tecniche applicate allo studio di funzionalità bR spettroscopia FT-IR ha probabilmente esercitato uno dei più grandi impatti. Vale a dire, spettroscopia FT-IR è stata la chiave per risolvere i gruppi coinvolti nel trasferimento di protoni attraverso la membrana come rappresentato altrove 13,41,51.

Channelrhodopsin (CHR) è il primo canale ionico-luce gated trovano in natura 42,43. Eccitazione luce di ChR conduce all'apertura transitoria di un canale ionico. La sua scoperta risolto la strada allo sviluppo di optogenetics, dove processi molecolari sono controllati dalla luce 44,45. ChR appartiene, come Br, alla famiglia di rhodopsins microbiche, ma a differenza di BR, molto meno si sa circa il suo meccanismo funzionale 52. ChR2 combina la sua funzione come iocanale n con l'attività protone-pompaggio 46,47. Recentemente, abbiamo applicato step-scan spettroscopia FT-IR risolta in tempo per risolvere reazioni di trasferimento di protoni intra-proteine ​​e la dinamica delle proteine ​​backbone cambiamenti di conformazione a ChR2 48.

Protocol

1. Aspetti generali del campione e strumento di preparazione Utilizzare uno spot spettrometro FT-IR attrezzato per misure step-scan risolte nel tempo. Per ottenere i migliori risultati posizionare lo spettrofotometro FT-IR in cima ad una tavola vibrante disaccoppiati. Evacuare il vano ottico a pochi mbar. Spurgare il vano campione con aria secca o azoto. Collocare un materiale trasparente IR opaco alla radiazione visibile davanti al rivelatore MCT dello spettrometro FT-IR. Questa precauzione è indispensabile per evitare artefatti da l'impulso laser emozionante durante gli esperimenti step-scan. Nota: Usiamo un (Ge) finestra di 25 mm di diametro germanio. Il suo alto indice di rifrazione provoca intensità indesiderabile perde, in gran parte evitato utilizzando un filtro Ge con rivestimento antiriflettente. Raffreddare il rivelatore MCT dewar con azoto liquido. Nota: L'uso di rilevatori fotovoltaico MCT è preferibile rispetto photoconductives a causa della loro risposta lineare e, quindi, photometr superioreprecisione ic e affidabilità basale 31,53. Pre-concentrare il campione usato per gli esperimenti di almeno 2 mg di proteina / ml in tampone di bassa (<20 mM) forza ionica per prevenire la formazione di cristalli di sale durante l'asciugatura della sospensione proteina per formare una pellicola proteina omogenea. Per i campioni che sedimentano, lavare / concentrarli applicando ultracentrifugazione (ad esempio, proteine ​​di membrana in liposomi o in zone della membrana cellulare). Utilizzare centricons di corretta taglio per le proteine ​​che non lo fanno sedimento (ad esempio, detersivi proteine ​​di membrana solubilizzate). Per risultati ottimali uso: a) preparati proteici come puro e attivo possibile; b) i rapporti di lipidi / proteine ​​≤ 3 in peso di proteine ​​in patch di membrana cellulare o ricostituiti in liposomi; c) rapporti di detersivo / proteine ​​≤ 1 in peso per le proteine ​​detergenti solubilizzati. Evitare l'uso di detergenti o lipidi cui bande vibrazionali sovrapporsi con quelli della proteina (per esempio, CHAPS). </ol> 2. Preparazione di Attenuated totali esperimenti riflessione su batteriorodopsina Montare l'accessorio ATR nel compartimento campione dello spettrometro FT-IR. Nota: Usiamo un ATR ZnSe / diamante con 5 riflessi attivi. Evitare materiali semiconduttori come il germanio o silicio come elemento di riflessione interna (IRE) dell'accessorio ATR, come le loro proprietà ottiche sono influenzate dal laser visibile eccitante. Misurare una vasta gamma (circa 4,000-800 cm -1) spettro di energia a 4 cm -1 risoluzione della superficie IRE pulita mediante spettroscopia FT-IR rapida scansione convenzionale. Utilizzare questo spettro come spettro di riferimento per calcolare gli spettri di assorbimento in una fase successiva. Coprire la superficie IRE del ATR con 20 ml di tampone usato successivamente per reidratare il campione (per esempio, 4 M NaCl e Napi 100 mM a pH 7,4). Misurare l'assorbimento IR del buffer. Rimuovere il tampone e risciacquare la superficie IRE with acqua. Evitare di toccare la superficie. Rimuovere il liquido residuo dalla superficie IRE da un flusso d'aria intenso. Diffondere ~ 3 microlitri di batteriorodopsina (Br) in membrane viola (~ proteine ​​6 mg / ml in acqua deionizzata) sulla parte superiore della superficie IRE (~ 0,2 centimetri 2 area). Asciugare la sospensione proteina sotto una leggera corrente di aria secca fino a quando un film è raggiunto. Misurare lo spettro di assorbimento del film secco (vedi figura 1). Aggiungere delicatamente 20-40 ml di un tampone di alta forza ionica per reidratare la pellicola secca (es. 4 M NaCl e Napi 100 mM a pH 7,4). Nota: L'alta forza ionica impedisce un eccessivo rigonfiamento della membrana film, permettendo di mantenere il più proteine ​​possibile vicino alla superficie tastata (Figura 2). Coprire il titolare ATR con un coperchio per evitare l'evaporazione dell'acqua. Facoltativamente, inserire una copertura giacca collegata ad un bagno circolatorio impostato a 25 ° C per il controllo della temperatura. Per le proteine ​​con lunghe photocycles (& #62, secondi), il controllo della temperatura potrebbe aumentare la stabilità della linea di base. Misurare uno spettro di assorbimento. Stimare la percentuale di campione rimanente vicino alla superficie dopo la reidratazione del film sottraendo lo spettro di assorbimento del tampone (Figura 3). Confermare stabilizzazione del film gonfiore registrando gli spettri di assorbimento a 5-20 minuti di intervallo dopo la reidratazione (Figura 4). Questo passaggio è facoltativo ma consigliato. 3. Esecuzione di esperimenti di trasmissione su Detergente-solubilizzato channelrhodopsin-2 Aggiungere 10 ml di ChR2 (~ 10 mg di proteina / ml) disciolti in 5 mM NaCl, 5 mM HEPES (pH 7,4) e decile-maltoside (DM) al centro di una finestra BaF 2 del diametro di 20 mm. Stenderlo con l'aiuto della punta micropipetta ad un diametro di 6-8 mm (proteina densità superficiale di circa 200 mg / cm 2). Formare una USI pellicolang leggera corrente di aria secca. Per ottenere i migliori risultati assicurarsi che il film è omogenea ed ha un diametro di circa l'adeguamento delle dimensioni del fascio IR alla massima apertura. Idratare la pellicola aggiungendo 3-5 ml di una miscela di glicerolo / acqua distribuita in 3-5 gocce attorno al film secco e chiudere ermeticamente con una seconda finestra con un silicone piana O-ring di ≥ 1 mm di spessore. Nota: Il rapporto della miscela glicerolo / acqua controlla l'umidità relativa tra le finestre 54. Per campioni igroscopici utilizzare un rapporto 3/7 o 2/8 glicerolo / acqua (w / w). Le gocce glicerolo / acqua non devono mai essere a contatto diretto con il film proteina. Inserire le BaF 2 finestre inserita in un supporto. Impedire alla luce di raggiungere direttamente il sensore coprendo la finestra campione con un materiale opaco IR, come carta, con un foro corrispondente al formato del film idratato. Posizionare il supporto nel vano campione. Controllare la temperatura del supporto a 25 °C da una camicia termostatica collegata ad un bagno circolatorio temperatura controllata. Misurare uno spettro di assorbimento. Assicurarsi che il massimo assorbimento nella regione ammide I (~ 1,700-1,620 cm -1) è nell'intervallo 0.6-1.0. Stimare la massa e il rapporto molare di proteine ​​/ detergente / acqua dallo spettro di assorbimento del film idratato (Figura 5) utilizzando estinzione riferimento spettri coefficiente di acqua, DM, e proteine ​​di membrana rappresentativi (Figura 6). Attendere che il livello di idratazione stabilizza prima di eseguire esperimenti di step-scan (≥ 1 ora). 4. Regolazione e sincronizzazione del laser emozionante Per esperimenti su bR usa il secondo emissione armonica di un Nd: YAG laser (λ = 532 nm) per attivare il fotociclo. Per esperimenti ChR2, utilizzare una eccitazione di λ = 450 nm come fornito da un optici oscillatore parametrico (OPO) guidato dalla terza armonica (λ = 355 nm) di un laser Nd: YAG. Assicurarsi che l'impulso laser è sufficientemente breve (~ 10 nanosecondi) per ridurre al minimo secondario foto-eccitazione. Nota: L'energia degli impulsi laser deve essere il più costante possibile. Nella nostra configurazione, l'intensità del laser oscilla ≤ 10% attorno al valore medio, come confermato misurando un riflesso del laser da un fotodiodo collegato ad un registratore di transitori e integra la risposta (Figura 8). Coppia il laser al campione. Regolare la densità di energia del laser a campione a 2-3 mJ / cm 2 per impulso usando un power-metro. Per la configurazione ATR, utilizzare una fibra ottica messi sopra del coperchio ATR. Per gli esperimenti di trasmissione, utilizzare specchi per portare il laser al campione e, se necessario, lenti a uno o divergere collimare il fascio laser su un diametro leggermente superiore alla dimensione del campione di film. Sincronizzare il laser impulsi con registrazione dati dallo spettrometro. Utilizzare il Q-switch sync-out TTL pulse dell'elettronica del laser Nd: YAG per attivare lo spettrometro. Impostare la velocità di eccitazione del laser Nd: YAG a 10 Hz per bR e 0,25 Hz per ChR2, rispettivamente. Utilizzare un generatore di ritardo dell'impulso (PDG) per controllare il tasso di eccitazione laser se la frequenza di ripetizione del Nd: YAG laser non è facilmente regolabile. Collegare la lampada sync-out del Nd: YAG laser per l'ingresso di trigger esterno PDG. Il PDG fornisce un'uscita ~ 190 msec TTL ritardato impulso al Q-switch-sync in ingresso del Nd: YAG laser per attivare il lasing. Porta il PDG di accettare un trigger esterno solo dopo un certo periodo di tempo dall'ultima attivazione accettata (100 msec per bR o 4 secondi per ChR2). 5. Preparazioni Step-scan e impostazioni Time-risolti Collocare un filtro ottico passa-basso nel percorso ottico. Per eseguire misure step-scan-time risolta nel 1,800-850 centimetri -1 gamma spettrale, utilizzano un filtro opaco sopra 1950 centimetri -1 e con buona trasmissione (> 50-80%) sotto 1.800 centimetri -1 (Figura 7). Modificare il rivelatore da AC a DC-coupled modalità. Nota: Dopo questa regolazione il segnale interferogramma non sarà più oscillare attorno allo zero ma intorno ad un valore noto come il livello DC. Utilizzare la più grande apertura possibile fascio dello spettrometro per l'elevato flusso di fotoni e, quindi, migliore rapporto segnale-rumore, ma entro i limiti di linearità del rivelatore. Portare il livello DC del interferogramma a zero e regolare il guadagno elettronico per sfruttare meglio la gamma dinamica del digitale analogico convertito (ADC). Conseguire compensata applicando una polarizzazione di tensione al segnale fornito dal pre-amplificatore-livello DC. Nota: Questa opzione è inclusa nei moderni spettrometri FT-IR. Altrimenti, un dispositivo esterno fatto in casa può essere usata al posto, posto tra il preamplificatore e l'ADC 38. Care è quindinecessarie per garantire che l'elettronica di tale dispositivo sono veloci e lineari. Avviare il menu passo scansione del spettrometro FT-IR. Impostare la larghezza di banda spettrale di destinazione per la misurazione step-scan per 1,975.3-0 cm -1. Regolare la larghezza di banda spettrale per una frazione del numero d'onda laser He-Ne (1/8 nella fattispecie), leggermente superiore al taglio del filtro ottico. Disattivare qualsiasi filtro elettronico passa-alto per evitare distorsioni della cinetica in tempi successivi. Un filtro elettronico passa-basso può essere utile quando la frequenza di taglio è nell'ordine o al di sopra della frequenza di campionamento dell'ADC (riduce aliasing rumore). Impostare la risoluzione spettrale e fase a 8 cm -1 e 64 cm -1, rispettivamente. Impostare la modalità di acquisizione interferogramma a singolo-lato in avanti. Con queste opzioni si interferogramma necessita di circa 500 punti. Impostare la frequenza di campionamento del ADC al massimo valore possibile nello spettrometro (es. 160 kHz, o 6,25 msec). Impostare il "trigger per esperimento" a "esterno", cioè, il laser è il padrone. Impostare il numero di punti dati linearmente spaziati da registrare: 7,000 per bR (fino a 42 msec) e 20.000 per ChR2 (fino a 125 msec). Nota: tempi più lunghi possono essere coperte senza traboccare il ricordo ADC utilizzando un quasi-logaritmica impulsi TTL esterni a tempo distanziato da un generatore di onde per attivare l'acquisizione dati 38, oppure utilizzando due registratori di transitori parallele come sostituti di ADC interna 31, 32. Salvare circa 100 punti pre-trigger come riferimento per lo stato scuro del campione. Nota: Nel millisecondo di tempo-scala della qualità dei dati è spesso limitata dalle fluttuazioni specchio mobile. Aumentando i punti pre-trigger sopra 100 è, quindi, non dovrebbe migliorare notevolmente la qualità dei dati. Impostare il numero di co-aggiunte, cioè, il numero delle medie del fotoreazione a specchio positione. Per bR, utilizzare 20 co-integrazioni (20 min di misurazione del tempo a 10 Hz di frequenza di eccitazione). Per ChR2 utilizzare 2 co-integrazioni (70 min di tempo di misura a 0,25 Hz tasso di eccitazione) Ripetere l'esperimento 10x BR, e 35x su tre diversi film campione per ChR2, per avere finalmente ~ 200 co-addizioni per posizione dello specchio. 6. Elaborazione Dati Confermare lo stato del campione confrontando lo spettro IR differenza indotta dalla luce ottenuto dalla prima e l'ultima misura. Considerare scartando qualsiasi misurazione in cui l'intensità dello spettro differenza scende sotto il 60% della prima misurazione. Calcolare la media dei interferogrammi registrati. Utilizzando il software OPUS dal spettrometro FTIR selezionare le interferogrammi risolta in tempo a media e aggiungerli al "Spectrum Calcolatrice". Fare clic su "=" per ottenere la media dei interferogrammi. Nota: Quando la fase del interferogrammaè costante durante la misurazione è indifferente a interferogrammi medie o spettri singolo canale. Una fase costante può essere confermata mediante calcolo e confrontare lo spettro di fase del primo e dell'ultimo interferogramma registrato. Eseguire la trasformata di Fourier dei interferogrammi risolta in tempo medi di ottenere spettri a singolo canale media risolta nel tempo. Utilizzando lo stesso software come al punto 6.2.1, selezionare l'interferogramma risolta in tempo media e fare clic sull'icona per "interferogramma di spettri". Utilizzare il metodo Mertz fase di correzione, un fattore zero di riempimento di 2 (due punti digitali per la risoluzione strumentale), e una funzione apodizzazione (ad esempio, triangolo, Blackmann-Harris 3-termini, ecc.) Clicca in basso su "Convert" per trasformare l'interferogramma risolta in tempo in spettri risolta nel tempo. Esportare i dati del canale singolo risolte nel tempo come una "tabella punto dati" o "; "File utilizzando il" matlab salva come "icona nel software OPUS. Continuare il trattamento dei dati in un programma esterno. Mediare gli spettri singolo canale prima del laser, e convertire i dati monocanale risolta nel tempo a differenza spettri di assorbimento risolta nel tempo. Calcolare un vettore per la deviazione standard del rumore previsto negli spettri differenza in funzione del numero d'onda (Figura 12), utilizzando la deviazione standard del rumore, ε, e significa, S 0 (ν), del singolo spettri 100 canale precedente il laser: ε / S 0 (ν). Il valore di ε è stimato sottraendo consecutivo spettri singolo canale e calcolando la deviazione standard corretto per √ 2. Rimuovere regioni spettrali troppo rumoroso per essere di utilizzo (ad esempio, sopra 1.825 centimetri -1 e inferiore a 850 cm-1). Eseguire un quasi-logaritmica media (ad esempio, 20 spettri / ora decade). Il appearance dei dati migliorerà e il numero di spettri verrà ridotto da 4 a ~ 10 ~ 10 2 senza alcuna informazione significativa perso (Figura 9). Aumentare quattro volte la densità spettrale di punti (1 punto / cm -1) utilizzando l'interpolazione di Fourier (inserire zero riempimento). Nota: Eseguire i passi da 6.4.1 a 6.4.4 in un programma fatto in casa in esecuzione in MATLAB. Elaborare il tempo risolto spettri ottenuti (Figura 10A) con decomposizione in valori singolari, SVD, (Figura 13). Realizzare denoising dati ricostruendo i dati con un numero limitato di componenti SVD significative (Figura 10B). Nota: Eseguiamo SVD in MATLAB, utilizzando la funzione "SVD" built-in.

Representative Results

La Figura 1 mostra uno spettro di assorbimento di un film secco di bR depositato sulla superficie dell'elemento di riflessione interna diamante utilizzato per spettroscopia ATR. Bande caratteristiche da vibrazioni del legame peptidico (ammidico A, ammide I e amide II) sono chiaramente distinguibili. Lo spessore approssimativo del film secco può essere stimato come ~ 1 micron, considerando la quantità di proteine ​​aggiunte (18 mg) e la superficie del ATR (~ 0,2 centimetri 2), tenendo la densità della proteina come ~ 1,4 g / cm 3, 58 e dei lipidi come 1.0 g / cm 3, 59 e un rapporto lipide / proteina di 1/3 (w / w) in viola membrana 60. Il film secco è stato reidratato con eccesso di 4 M NaCl, Napi 100 mM a pH 7,4 (Figura 3). La concentrazione livello di idratazione e proteina efficace nel volume sondato dall'onda evanescente può essere dedotto dal fattore di scala necessaria per rimuovere digitalmente bande di assorbimentodall'acqua. Il fattore di scala ottimale era 0,87, il che significa che in questo caso il buffer occupa 87% e il campione 13% del volume vicino alla superficie. Tenendo conto proteine ​​e lipidi densità e il rapporto lipidi / proteine ​​in membrane viola (vedi sopra), si può dedurre una concentrazione proteica efficace di 125 mg / ml in volume rilevato dal onda evanescente. Si può dedurre dal livello di idratazione che, in questo caso particolare, lo spessore del film campione ampliato ~ 6 volte su reidratazione, da ~ 1 a ~ 6 micron. Per un angolo di incidenza di 45 °, tipico per la nostra e per la maggior parte regime ATR, la profondità di penetrazione del campo evanescente (d p) per un film proteina idratata varia tra 0,3 e 0,6 micron in cm -1 intervallo 61 1,800-850. Poiché il campo evanescente è quasi insensibile al campione situato due volte sopra d p 61, si deduce che la quantità di proteina usata nell'esperimento ATR potrebbe essere in linea di principio ridotta 5x wenza qualsiasi significativa perdita di segnale. Quando si utilizzano tamponi di bassa forza ionica del film si espande più, e la quantità di proteina nel volume rilevato dal campo evanescente è diminuito (Figura 2). La dipendenza esatta tra gonfiore pellicola e la forza ionica del tampone dipenderà, tra l'altro, dalla natura dei lipidi. Per esempio, una pellicola simile gonfiore ottenuto qui per bR in membrana viola con 4 M NaCl è stato ottenuto per una proteina di membrana ricostituito in polare E. lipidi coli che utilizzano solo 0,1 M NaCl 62. Se il campione occupa meno del 5% del volume analizzato considerare rifare la fase di idratazione utilizzando un buffer di elevata forza ionica. Film gonfiore dopo l'idratazione richiede un certo tempo per raggiungere la stabilizzazione (Figura 4). Per bR nella membrana viola il processo è monoesponenziale, con una costante di tempo di 12 min: ci vuole non più di 30-60 minuti per avere un film reidratato stabile <pclass = "jove_content"> Figura 5 mostra uno spettro di assorbimento IR di un film idrata del ChR2 ottenuto mediante trasmissione. Qui, idratazione stato ottenuto esponendo il film secco ad un'atmosfera di umidità controllata offerto da una miscela di glicerolo / acqua. Lo spettro può essere scomposto in contributi da acqua, detersivo e proteine. Abbiamo potuto stimare la quantità di ciascuno di loro usando estinzione spettri coefficiente, adattata allo spettro sperimentale. Per l'acqua abbiamo preso spettro coefficiente di estinzione dalla letteratura 63, e per DM abbiamo misurato da una soluzione di 100 mg / ml (Figura 6). Abbiamo anche usato coefficienti di estinzione per due proteine ​​di membrana rappresentativi: il carrier ADP / ATP mitocondriale 64 e BR (figura 7). Il fattore di scala indica un acqua e DM massa densità superficiale di 260 g / cm 2 e 200 mg / cm 2 nel film, rispettivamente. L'assorbimento rimanente (Figure 5, linea rossa) deriva principalmente dalla proteina, stimata ad una densità superficiale di 250 g / cm 2 utilizzando il coefficiente di estinzione ammide II da due diverse proteine ​​di membrana (vedere Figura 6). Il rapporto molare di proteine ​​/ detergente / acqua era pari al 1/60/2000 con una massa molecolare di 35 kDa, 480 Da, e 18 Da, rispettivamente. Un grafico 3D dal passo-scan tipico esperimento risolta nel tempo FT-IR bR è presentato in Figura 10A, ottenuto mediante ATR e coinvolgendo 200 min di acquisizione dati. Spectra può essere estratto in momenti specifici, per esempio quando la L, M e N intermedi del fotociclo bR si prevede di raggiungere la loro popolazione più alta (Figura 11). Le loro caratteristiche spettrali sono stati descritti ampiamente 13,41,65 e non saranno ulteriormente discusse qui. Figura 12 mostra temporali tracce in alcuni numeri d'onda selezionati. Vale a dire, l'aumento della cinetica a 1762 cm -1 (t 1/2 ~ 60 msec) riporta sulla dinamica della Asp85 protonazione della base di Schiff retina 66, e il suo decadimento a zero indica la sua deprotonazione su un terreno-sate di recupero 67. L'aumento negativo della cinetica a 1.740 centimetri -1 (t 1/2 ~ 1 msec) riferisce sulla deprotonazione di Asp96 catena laterale, il protone donatore alla base di Schiff 68. Il decadimento dell'intensità a zero relazioni sulla sua reprotonation dal citoplasma 67. La dinamica della proteina cambiamenti conformazionali possono essere sondati da variazioni di assorbimento nella regione ammide I e II ammide, che raggiunge una variazione massima a ~ 3 msec a temperatura ambiente 67,69. L'applicazione della SVD per spettroscopiche problemi è stato valutato prima 55,56. Brevemente, SVD factorizes i dati sperimentali, disposti in una matrice A, come: A = U S <strong> V T. Questa fattorizzazione può essere modificato per tenere conto della dipendenza rumore sul numero d'onda e di penalizzare fluttuazioni / derive nella linea di base 57. Le colonne di U e V contengono spettri ortonormale e temporali tracce vettori per ogni componente SVD, rispettivamente. S è una matrice diagonale contenente i cosiddetti valori singolari. I (abstract) componenti spettro-temporale a U e V appaiono discendente rilevanza per descrivere i dati sperimentali nel senso dei minimi quadrati, quantificato dal loro valore singolare associato. Figura 13A mostra i valori singolari in funzione del numero dei componenti, e riproduce le prime otto colonne / componenti di U (spettri astratto, Figura 13B) e V (abstract temporali tracce, Figura 13C). Il segnale è concentrato nei primi cinque componenti (come previsto per un photocycle contenente cinque stati intermedi), con componenti di cui sopra in gran parte dominati da rumore casuale e altre fonti di errori. I dati sperimentali è stata ricostruita utilizzando soltanto le prime cinque colonne di U e V, e le prime cinque colonne e righe di S. I dati ricostruiti dalla SVD rappresenta la migliore approssimazione minimi quadrati dei dati sperimentali ad una matrice di rango cinque. I dati ricostruiti mostra una migliore qualità (Figura 10B). Vale a dire, il rumore è sostanzialmente ridotto, così come alcune fluttuazioni quasi impercettibile e derive della base di riferimento (comuni in spettroscopia passo-scan risolta nel tempo 25). Trasformazione SVD è particolarmente utile per migliorare la qualità dei sperimentali temporali tracce del millisecondo (linee rosse in Figura 12). Dati di step-scan risolta in tempo per il fotociclo ChR2 sono stati ottenuti utilizzando il protocollo sopra descritto per trasmissione esperimenti di Sion (Figura 14A), che coinvolgono circa 120 ore di misurazioni accumulate. I dati risolta in tempo raccolti da step-scan si estende da 6,25 msec a 125 msec. La fotociclo di ChR2 richiede circa 60 s per il pieno recupero. L'ultima parte del fotociclo può essere coperto con una rapida scansione FT-IR, ed entrambi step-scan e insiemi di dati rapido scan fusa come presentato altrove 48. I cambiamenti spettrali di ChR2 sono ~ 10 volte più piccoli di quelli di ottenere da bR, rendendo le misurazioni più impegnativo. Specialmente, oscillazioni nella linea di base nella gamma millisecondi diventano evidente a queste modifiche basso assorbimento. Questi sono dovuti a piccole oscillazioni nello specchio mobile nella scala temporale millisecondo 25. Le oscillazioni, insieme con parte del rumore, possono essere in gran parte rimosse SVD, migliorando notevolmente l'aspetto dei dati (Figura 14B). gura 1 "fo: content-width =" 5in "src =" / files/ftp_upload/51622/51622fig1highres.jpg "width =" 500 "/> Figura 1. Spettro di assorbimento del bR in membrana viola essiccata sopra la superficie del diamante di un accessorio ATR. Bande di vibrazioni del legame peptidico (ammidico I, II e A) sono indicati. Figura 2. Spettro di assorbimento di un film di bR dopo la reidratazione utilizzando tamponi di varie forze ioniche noti la diminuzione della banda amide II (diluizioni di 4 M NaCl, 100 mM Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 a pH 7,4)., ovvero, maggiore pellicola gonfiore, con diminuzione forza ionica del tampone. (Insert) Quantità relativa di proteine ​​in prossimità della superficie, quantificato dalla intensità della assorbanza a 1.541 centimetri -1 (amide II massimo) dopo subtractisul contributo assorbimento del buffer. Figura 3. Spettro di assorbimento di un film di bR reidratato con tampone bulk (4.3 M forza ionica) e dopo la sottrazione del contributo buffer. Il fattore di sottrazione, 0.87, è stata scelta per rimuovere il forte assorbimento di acqua tra 3,700-3,000 cm -1 e per ottenere una linea di base piatta tra 2,700-1,800 cm -1. Figura 4. Spettro di assorbimento bR dopo la reidratazione con un buffer di 4,3 M forza ionica (assorbimento buffer è stato sottratto per chiarezza come nella figura 3). L'inserto mostra l'evoluzione del film rigonfiamento dopo rehydratione, seguito dal assorbanza proteina amide II a 1541 centimetri -1. Una misura di un singolo esponenziale indica una costante di tempo per il film gonfiore stabilizzazione di 12 min. Figura 5. Spettro di assorbimento di un film idrato di ChR2 misurata mediante trasmissione (linea blu). L'estinzione spettro coefficiente di acqua (linea tratteggiata arancione) e DM (linea azzurra tratteggiata) è stata ridimensionata e sottratto (linea rossa). Figura 6. Riprodotto estinzione di massa coefficiente spettri a 25 ° C per acqua liquida (http://www.ualberta.ca/ ~ jbertie / JBDownload.HTM # Spectra) e per un film idratato del / vettore ATP ADP (AAC) 64 . </s Trong> Lo spettro di coefficiente di estinzione di massa è stata misurata in soluzione per DM (100 mg / ml), e in un film idratato per bR. Figura 7. Trasmittanza del filtro ottico utilizzato nelle scan-scan FT-IR misure risolte nel tempo. . Figura 8 Rappresentazione degli impulsi laser forniti dalla seconda armonica (532 nm) di un Nd:. YAG Istogramma della variazione di energia relativa di 1000 impulsi laser, e si adattano ad una distribuzione gaussiana con una deviazione standard di 0,05. 1622/51622fig9highres.jpg "width =" 500 "/> Figura 9. Luce indotte variazioni di assorbanza di bR a tre numeri d'onda rappresentative a tempo uniforme spaziatura intervalli (verde, nero e linee blu) e dopo una media quasi-logaritmica a ~ Si noti la riduzione del rumore dopo 20 punti / decade (linee rosse). media logaritmica, rivelando oscillazione del tempo traccia dell'ordine del millisecondo. Figura 10. Rappresentazione 3D delle variazioni di assorbanza di luce-indotta per bR registrati da ATR a pH 7.4 (4 M NaCl, Napi 100 mm). A) I dati grezzi. B) i dati ricostruiti con cinque componenti SVD. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. <p class="jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Figura 11. FT-IR spettri di assorbimento differenza del fotociclo bR a tre volte selezionati in cui la L (12,5 msec), M (300 msec), e N (6 msec) intermedi sono più arricchita. Figura 12. Trasferimento di protoni e di proteine ​​dinamica backbone in fotociclo bR deliberato dal passo-scan spettroscopia differenza FT-IR risolta nel tempo. L'assorbanza cambiamenti a 1.762 centimetri -1 relazioni sulle dinamiche protonazione / deprotonazione di Asp85, ea 1741 centimetri -1 sulle dinamiche deprotonazione / reprotonation di Asp96 (compresi i cambiamenti H-bonding prima di 300 msec). I termini tracce a 1.670 e 1.555 centimetri -1segnalare i cambiamenti amide I e II vibrazioni, sia sensibili alla conformazione del scheletro peptidico. Le tracce posteriori corrispondono ai dati grezzi, e quelli rossi ai dati SVD-trattati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 13. Decomposizione in valori singolari (SVD) della fase a scansione dati risolta nel tempo sperimentali FT-IR del fotociclo br (vedi Figura 10A). SVD è stata eseguita dopo la pesatura dei dati sperimentali tenendo conto del rumore deviazione standard dipendenza dal numero d'onda (Figura 15); combinato con il 1 ° derivato per ridurre il peso statistico delle fluttuazioni della linea di base, come descritto in precedenza 57. A) e #160; Plot dei relativi valori singolari dei primi 50 componenti (cerchi neri). I primi cinque componenti sono assegnati per segnalare componenti (cerchi rossi). Il resto dei componenti decadimento esponenziale come previsto per il rumore-componenti (vedi linea tratteggiata grigia). B) primi otto spettri abstract (U 1 a U 8). C) prima di otto temporali tracce astratte (V 1 a V 8). Gli spettri astratto e temporali tracce assegnato al segnale sono raffigurati in linee rosse, e con linee nere altrimenti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Rappresentazione Figura 14. 3D delle variazioni di assorbanza IR indotta dalla luce per ChR2 registrati da step-scanin modalità di trasmissione. I dati step-scan si estende fino a 125 msec, solo che copre una parte del fotociclo. A) I dati grezzi. B) I dati ricostruiti con cinque componenti SVD. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 15 livello di rumore. Stimata in una differenza spettro FT-IR. Assorbimento a 6.25 msec temporale e 8 cm -1 risoluzione spettrale per un esperimento che coinvolge 1 posizione co-addition/mirror (500 photoreactions) o ~ 200 posizione co-addition/mirror (10 5 photoreactions). I valori sono indicati per la riflessione totale attenuata (ATR) e l'impostazione della trasmissione.

Discussion

Uno dei primi aspetti cui occorre tener conto quando si esegue passo-scansione FT-IR esperimenti risolta nel tempo su una proteina è la preparazione di un campione in una forma adatta per spettroscopia IR. L'assorbimento IR da sostanze diverse dalla proteina di interesse deve essere ridotta, in particolare che dall'acqua. L'approccio più comune è per evaporare l'acqua bulk del campione per formare una pellicola. Il film può essere reidratato o aggiungendo alcune gocce di una soluzione acquosa o esponendo il film un'atmosfera di umidità controllata. Abbiamo mostrato come in entrambi i casi è possibile stimare il livello di idratazione ottenuto mediante spettroscopia di assorbimento IR (vedere Figura 3 e Figura 5). Anche se i livelli di idratazione ottenuti possono apparire bassi rispetto a quelli in soluzione, in realtà sono vicini a quelli trovati in cellule viventi 70, rendendo lo studio dei film idrati di proteine ​​funzionalmente rilevanti. Oltre all'acqua,è anche importante conoscere e controllare la quantità di lipidi o detersivo nel campione. Entrambi devono essere sufficientemente bassa per avere un impatto ridotto spettroscopica in assorbimento IR, ma abbastanza alto per preservare l'integrità e la funzionalità della proteina di interesse.

Spettroscopia step-scan-Time risolto è solo semplicemente applicabile alle proteine ​​che mostrano reazioni reversibili che possono essere attivati ​​in modo riproducibile dalla luce (ma vedi progressi accoppiamento step-scan con scambio rapido buffer) 71. Nel passo-scan la reazione deve essere riproducibile per almeno ~ 500x, il numero minimo per completare un interferogramma copre il 1,800-850 cm -1 regione a 8 cm -1 risoluzione. In pratica, tuttavia, ulteriori dati media è generalmente richiesta per spingere il livello di rumore basso. Per la 200 posizione co-additions/mirror (10 5 ripetizioni della reazione) uno spettro 6,25 risoluzione psec differenza di assorbanza può visualizzare una stazione di rumoredeviazione ndard tra 2 x 10 -5 e 2 x 10 -4 per un ATR e tra 5 x 10 -6 e 3 x 10 -5 per un esperimento di trasmissione (Figura 15). Grazie alla sua maggiore produttività fotone, la trasmissione permette di ~ 7 livelli di rumore inferiori rispetto ATR, un aspetto fondamentale per studiare con successo i campioni che danno cambiamenti deboli di assorbimento come ChR2. D'altra parte, ATR richiede da 5 a 25 volte inferiore di campione di un esperimento di trasmissione.

L'applicazione di step-scan spettroscopia FT-IR risolta nel tempo è problematico per proteine ​​visualizzazione photocycles lente: registrando un interferogramma passo-scansione può diventare poco pratico lungo. Alcune soluzioni sono state presentate per risolvere tali casi 72,73, spesso basati sull'utilizzo di campioni multipli scambiabili per accelerare misurazioni a costo di un aumento del consumo di proteine ​​e complessità sperimentale 27,74. In alcuni casi è possibile aggirare questo problema excitando l'esempio prima che il fotociclo è strettamente completata. Per ChR2, con un fotociclo richiede dopo fotoeccitazione 60 sec per 99% di recupero, il recupero a 4 sec è già del 80% 48. Con un rendimento del 10% di eccitazione per impulso laser, il 98% delle molecole ChR2 sono all'oscuro stato 4 sec dopo foto-eccitazione, rendendo possibile eseguire esperimenti cadenza di ripetizione laser a 0.25 Hz.

L'elaborazione dei dati è un aspetto tecnico finale necessaria per ottenere i migliori risultati possibili. Media logaritmica riduce il rumore e, altrettanto importante, riduce la dimensione dei dati senza distorsioni, una caratteristica essenziale per l'analisi dei dati posteriori mediante decomposizione in valori singolari o raccordo globale. Media logaritmica è, tuttavia, non molto successo in media le fluttuazioni nel tempo-tracce causate da oscillazioni nello specchio mobile e altre sorgenti di rumore 1 / f durante la misurazione (Figura 9). Queste fluttuazioni della linea di basepuò superare il rumore del millisecondo e corrotto la qualità dei dati. Singular Value Decomposition sfrutta la ridondanza dei dati per ridurre il rumore, e con alcune modifiche 57 può ridurre così fluttuazioni della linea di base.

Infine, la maggior parte più difficile e di un passo-scan esperimento FT-IR risolta nel tempo in termini di tempo corrisponde alla assegnazione di bande e per l'interpretazione spettrale e cinetica dei dati. Per batteriorodopsina molte delle band che compaiono negli spettri differenza IR sono stati assegnati o interpretate grazie al lavoro accumulato di molti gruppi di ricercatori nel corso di decenni. Per una proteina molto meno studiato, come channelrhodopsin-2, gli esperimenti IR risolta nel tempo sopra presentati devono essere accompagnati da esperimenti paralleli su mutanti sito-diretti e combinati con le informazioni tecniche complementari per raggiungere una interpretazione meccanicistica 48.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to J.H. (FOR-1279, SFB-1078, B3). We thank Tom Resler and Björk Süss for helpful comments.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
FT-IR spectrometer Bruker Vertex 80v Equipped with photovoltaic-MCT detector, an external global, and an oil-free pump. Firmware 2.3.
BaF2 windows korth Kristalle
diamond ATR accesory Smiths detection Nine-reflection DuraDisk
thermostatic bath Julabo  F25
vibration decoupled table OPTA
Pulsed Nd:YAG laser with a second harmonic generator Continuum electro-Optics Minilite 
Optical parametric oscillator (OPO) OPTA BBO-355-VIS/IR S/N 1009
Digital delay/pulse generator  Stanford Research Systems DG535
Pulsed Nd:YAG laser with a third harmonic generator Spectra-Physics Quanta-Ray
Various optical mirrors and lenses ThorLabs
OPUS 7.0  Bruker Software to control Vertex 80v spectrometer
Matlab run time Mathworks Used to run home-made executable programs to preprocess the data
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Lórenz-Fonfría, V. A., Heberle, J. Proton Transfer and Protein Conformation Dynamics in Photosensitive Proteins by Time-resolved Step-scan Fourier-transform Infrared Spectroscopy. J. Vis. Exp. (88), e51622, doi:10.3791/51622 (2014).
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