Key steps of protein function, in particular backbone conformational changes and proton transfer reactions, often take place in the microsecond to millisecond time scale. These dynamical processes can be studied by time-resolved step-scan Fourier-transform infrared spectroscopy, in particular for proteins whose function is triggered by light.
Monitoreo de la dinámica de protonación y proteínas backbone cambios de conformación durante la función de una proteína es un paso esencial hacia la comprensión de su mecanismo. De protonación y conformacionales cambios afectan el patrón de vibración de las cadenas laterales de aminoácidos y del enlace peptídico, respectivamente, ambos de los cuales se puede probar por infrarrojos (IR) espectroscopia de diferencia. Para las proteínas cuya función puede ser repetitiva y reproducible provocada por la luz, es posible obtener espectros de diferencia de infrarrojo, con (sub) Resolución de microsegundos en un amplio rango espectral usando la técnica infrarroja paso a escanear la transformada de Fourier. Con ~ 10 2 -10 3 repeticiones de la fotorreacción, el número mínimo para completar una exploración a una resolución espectral razonable y ancho de banda, el nivel de ruido en los espectros de diferencia de absorción puede ser tan bajo como ~ 10 – 4, suficiente para seguir la cinética de cambios de protonación de un único aminoácido. Inferiorlos niveles de ruido se puede lograr por más de promediado de datos y / o procesamiento matemático. La cantidad de proteína requerida para obtener resultados óptimos es entre 5-100 mg, dependiendo de la técnica de muestreo utilizada. En cuanto a requisitos adicionales, la proteína necesita ser concentrado primero en un tampón de fuerza iónica baja y después se seca para formar una película. La película de proteína se hidrata antes del experimento, o bien con pequeñas gotas de agua o bajo la humedad atmosférica controlada. El nivel de hidratación alcanzado (g de agua / g de proteína) se mide a partir de un espectro de absorción IR. Para mostrar la técnica, se estudió la fotociclo del bacteriorhodopsin la bomba de protones impulsada por la luz en su entorno membrana púrpura nativa, y del canal de iones canalrodopsina-2 la luz cerrada solubilizada en detergente.
Para dilucidar plenamente cómo las proteínas realizan su función, se requiere para medir mientras trabajan, es decir, a lo largo de un camino de reacción que implica a menudo una serie de productos intermedios y se extiende varios órdenes de tiempo. Los pasos clave de la función de proteínas a menudo tienen lugar en el microsegundo de milisegundos rango de tiempo 1, en particular la columna vertebral cambios conformacionales y reacciones transferencias de protones en las proteínas de membrana. La cristalografía de rayos X, sin duda el pilar de la biología estructural, proporciona (promediada en el tiempo) densidades electrónicas estáticas de bienestar de difracción de cristales de proteína, muy difícil de crecer con proteínas de la membrana 2. Un modelo atómico 3D puede ser construido en base a la densidad de electrones, aunque rara vez incluida la ubicación de los átomos de hidrógeno. El notable avance en la cristalografía de rayos X con resolución temporal, basándose ya sea en Laue difracción 3 o en pulsos de rayos X de femtosegundos 4, añade la dimensión temporal a la gran información estructural eninherente a la cristalografía de rayos X 5. Pero dejando a un lado desafíos técnicos y analíticos, la red cristalina puede afectar la columna vertebral cambios conformacionales y alterar la dinámica de proteínas, un inconveniente inevitable de métodos basados en cristales de proteínas 5. En consecuencia, los aspectos dinámicos de proteínas están aún mejor cubiertas por métodos ópticos, ya que por primera vez por el flash fotólisis 6,7, aunque con el inconveniente general de visión estructural limitado.
Espectroscopia de infrarrojos por transformada de Fourier (FT-IR) combina la resolución temporal de espectroscopias ópticas con una sensibilidad valiosa a la estructura de la proteína, la última característica explotada en innumerables investigaciones estructurales y funcionales estáticas en proteínas de la membrana 8-11. En particular, la espectroscopia de diferencia FT-IR ha demostrado ser una herramienta ideal para estudiar pequeños cambios espectrales como tránsitos de proteínas de un estado metaestable a otro 12-19.
Studies sobre la dinámica de proteínas, excepto en el único nivel de molécula 20,21, requieren un proceso de activación para la sincronización. Una reacción está convenientemente inició rápida y no invasiva utilizando la luz como disparador, como se hizo en el estudio de las proteínas con fotorreacciones cíclicos. Un reto importante asociado con estudios de tiempo-resuelto es la consecución de suficiente resolución de tiempo manteniendo una buena resolución espectral y la relación adecuada de señal a ruido. También es esencial para cubrir una gama suficientemente amplia espectral y temporal. Paso de barrido Tiempo de resolver la espectroscopia FT-IR sobresale en todos estos aspectos 22, con ejemplos publicados que cubren los rangos espectrales tan amplia como 3,900-850 cm -1 y la dinámica que se extiende ~ 9 órdenes de tiempo, con un máximo de 3,5 cm -1 espectral y 30 de la resolución temporal ns 23-28.
Espectrómetros de transformación de Fourier de infrarrojos muestran ruido reducido y mayor precisión fotométrica sobre los dispersivos 29. Sin emer, en el modo de grabación rápida exploración normal espectrómetros FT-IR sufren de un tiempo de resolución limitado a ≥ 5-10 mseg como consecuencia de el tiempo mínimo el espejo móvil del interferómetro requiere para completar una exploración. Con la técnica de paso de escaneado, en contraste, la dependencia del tiempo del evento dinámico está desacoplada de la duración de la exploración del interferómetro. En pocas palabras, el espejo se mueve móviles en pasos discretos en lugar de escanear continuamente para realizar la exploración. En cada uno de estos pasos el espejo (móvil) se mantiene fijo y un transitorio se registra. Por lo tanto, el tiempo de resolución está limitada por el tiempo de subida del mercurio de teluro de cadmio (MCT) detector, que está típicamente en el intervalo de 10-100 nseg. En la práctica, la gran gama dinámica del interferograma (que contiene una señal intensa en las señales centerburst y pequeños en las alas), requiere de digitalización adecuado un convertidor analógico / digital (ADC) con un máximo de 16 a 24 bits que lleva a un muestreo tasas no superiores a 200 kHz ~(5 microsegundos) 30. Nanosegundo tiempo-resolución puede llevarse a cabo mediante la medición de sólo los cambios en el interferograma, para el que un bit ADC 8-12 es suficiente 23,31-33. Aspectos técnicos 30,34,35 y aplicaciones 36-38 de paso-scan con resolución temporal se han discutido en detalle en otra parte.
El propósito de la contribución actual es proporcionar un protocolo que describe los aspectos prácticos de la etapa de exploración espectroscopía FT-IR resuelta en el tiempo en proteínas de la membrana fotosensibles. Aquí, el rendimiento de la técnica se muestra para dos métodos de muestreo: de transmisión y reflexión total atenuada (ATR). El uso de ATR, permite trabajar en la presencia de exceso de agua, que no sólo garantiza condiciones de hidratación completa para la proteína, pero también permite el control agudo de la muestra de pH y fuerza iónica 49,50. Experimentos escanear a paso se ilustran en dos sistemas seleccionados: bacteriorrodopsina y canalrodopsina-2.
<p class="jove_content"> El bacteriorhodopsin bomba de protones impulsada por la luz (BR) ha sido objeto de numerosos estudios biofísicos para más de cuarenta años 39,40, por lo que es la proteína de membrana mejor entendido hasta ahora. Entre las numerosas técnicas aplicadas al estudio de la funcionalidad bR espectroscopia FT-IR ha ejercido sin duda uno de los impactos más grandes. A saber, la espectroscopia FT-IR ha sido la clave para resolver los grupos involucrados en la transferencia de protones a través de la membrana como en otros lugares representaron 13,41,51.Canalrodopsina (CHR) es el primer canal de iones de luz cerrada que se encuentra en la naturaleza 42,43. Luz de excitación de ChR conduce a la apertura transitoria de un canal iónico. Su descubrimiento se estableció el camino para el desarrollo de la optogenética, donde los procesos moleculares son controlados por la luz 44,45. ChR pertenece, como bR, a la familia de rhodopsins microbiana pero en contraste con bR, y mucho menos se sabe acerca de su mecanismo funcional 52. ChR2 combina su función como ion con la actividad del canal de protones bombeo 46,47. Recientemente, hemos aplicado paso-scan espectroscopia FT-IR de resolución temporal para resolver las reacciones de transferencia de protones dentro de la proteína y la dinámica de las proteínas de backbone cambios de conformación en ChR2 48.
Uno de los aspectos primero que necesita consideración a la hora de realizar el paso de escaneo experimentos FT-IR resueltas en el tiempo en una proteína es la preparación de una muestra en una forma adecuada para la espectroscopia de IR. La absorción de IR de sustancias distintas de la proteína de interés debe ser reducido, sobre todo que a partir de agua. El enfoque más común es para evaporar el agua a granel de la muestra para formar una película. La película puede ser rehidratado ya sea mediante la adición de algunas gotas de una solución acuosa o mediante la exposición de la película a una atmósfera de humedad controlada. Hemos mostrado cómo en ambos casos es posible estimar el nivel de hidratación obtenida por medio de la espectroscopia de absorción de IR (véase la Figura 3 y la Figura 5). Aunque los niveles de hidratación obtenidos pueden aparecer bajo en comparación con aquellos en solución, que son en realidad cerca de las que se encuentran en las células vivas 70, por lo que el estudio de las películas hidratadas de proteínas funcionalmente relevantes. Además de agua,También es importante conocer y controlar la cantidad de lípidos o detergente en la muestra. Tanto debe mantenerse lo suficientemente baja para tener un impacto espectroscópico reducida en la absorción de IR, pero lo suficientemente alta para preservar la integridad y la funcionalidad de la proteína de interés.
Espectroscopia de paso del escaneo de resolución temporal es sólo francamente aplicable a las proteínas que muestran reacciones reversibles que se pueden activar de forma reproducible por la luz (pero ver el progreso en el acoplamiento de la etapa de exploración con el intercambio de tampón rápido) 71. En la etapa-escanear la reacción tiene que ser reproducible para al menos ~ 500x, el número mínimo para completar un interferograma que cubre el 1,800-850 cm -1 región a 8 cm -1 resolución. En la práctica, sin embargo, con un promedio adicional de datos generalmente se requiere para impulsar el nivel de ruido. Por 200 posición co-additions/mirror (10 5 repeticiones de la reacción) un espectro 6,25 microsegundos resolución diferencia de absorción puede mostrar una estación de ruidodesviación ndard entre 2 x 10 -5 y 2 x 10 -4 para un ATR y entre 5 x 10 -6 y 3 x 10 -5 para un experimento de transmisión (Figura 15). Gracias a su mayor rendimiento de fotones, la transmisión permite ~ 7 niveles de ruido más bajos que los ATR, un aspecto clave para el estudio de muestras en las que con éxito los cambios de absorción débiles como ChR2. Por otro lado, ATR requiere de 5 a 25 veces menos que muestra un experimento de transmisión.
La aplicación de la etapa de exploración espectroscopia FT-IR resuelta en el tiempo es un problema para proteínas que muestra photocycles lentos: la grabación de un interferograma a paso-scan puede llegar a ser poco práctico larga. Algunas soluciones se han presentado para hacer frente a estos casos 72,73, a menudo basadas en el uso de múltiples muestras intercambiables para acelerar las medidas a costa de un mayor consumo de proteínas y la complejidad experimental 27,74. En algunos casos es posible eludir este problema por el excitando la muestra antes de la fotociclo está estrictamente completó. Para ChR2, con un fotociclo requiere después de la foto-excitación 60 seg para la recuperación de 99%, la recuperación en 4 seg ya de 80% es 48. Con una eficiencia de excitación de 10% por pulso láser, 98% de las moléculas de Chr2 están en la oscuridad estado 4 seg después de la foto-excitación, lo que hace posible llevar a cabo experimentos a una tasa de repetición del láser a 0,25 Hz.
Tratamiento de la información es un aspecto técnico final necesario para alcanzar los mejores resultados posibles. Promedio logarítmico reduce el ruido y, también importante, reduce el tamaño de los datos sin distorsiones, una característica esencial para el análisis de datos posteriores utilizando la descomposición de valor singular o ajuste global. Promedio logarítmico es, sin embargo, no es muy exitosa en un promedio de las fluctuaciones en el tiempo-huellas causadas por las oscilaciones en el espejo móvil y otras fuentes de ruido 1 / f durante las mediciones (Figura 9). Estas fluctuaciones en la línea de basepuede superar el ruido en el rango de milisegundos y corrupto de la calidad de los datos. Descomposición de valor singular se aprovecha de la redundancia de los datos para reducir el ruido, y con algunas modificaciones 57 que puede reducir así las fluctuaciones en la línea de base.
Finalmente, la mayor parte más difícil y requiere mucho tiempo de un paso de exploración de FT-IR experimento resuelta en el tiempo corresponde a la asignación de bandas y para la interpretación espectral y cinética de los datos. Para bacteriorhodopsin muchas de las bandas que aparecen en los espectros de diferencia IR han sido asignados o interpretado gracias al trabajo acumulado de muchos grupos de investigación en las últimas décadas. Para una proteína mucho menos estudiado, como canalrodopsina-2, los experimentos de IR con resolución temporal anteriormente presentados tienen que ser acompañados por experimentos paralelos en mutantes dirigidos al sitio y se combinan con la información de técnicas complementarias para llegar a una interpretación mecanicista 48.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants from the Deutsche Forschungsgemeinschaft to J.H. (FOR-1279, SFB-1078, B3). We thank Tom Resler and Björk Süss for helpful comments.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
FT-IR spectrometer | Bruker | Vertex 80v | Equipped with photovoltaic-MCT detector, an external global, and an oil-free pump. Firmware 2.3. |
BaF2 windows | korth Kristalle | ||
diamond ATR accesory | Smiths detection | Nine-reflection DuraDisk | |
thermostatic bath | Julabo | F25 | |
vibration decoupled table | OPTA | ||
Pulsed Nd:YAG laser with a second harmonic generator | Continuum electro-Optics | Minilite | |
Optical parametric oscillator (OPO) | OPTA | BBO-355-VIS/IR S/N 1009 | |
Digital delay/pulse generator | Stanford Research Systems | DG535 | |
Pulsed Nd:YAG laser with a third harmonic generator | Spectra-Physics | Quanta-Ray | |
Various optical mirrors and lenses | ThorLabs | ||
OPUS 7.0 | Bruker | Software to control Vertex 80v spectrometer | |
Matlab run time | Mathworks | Used to run home-made executable programs to preprocess the data |