הפגנה של מפרקי חלבוני הפעלה של אפיתל נתרן הערוץ (ENaC) על ידי שילוב של מדידות זרם עם איתור של שברי מחשוף
Summary
הפעלת מפרקי חלבונים של ערוץ אפיתל נתרן (ENaC) הביע heterologously בXenopus laevis ניתן להדגים ביציות על ידי שילוב של מדידות זרם עם גישת biotinylation לחקור את המראה של מוצרי מחשוף ערוץ יון על פני התא. ניתן לזהות אתרי מחשוף חשובים ופונקציונליים באמצעות מכוון mutagenesis אתר.
Abstract
The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes. In combination with site-directed mutagenesis, this approach provides a powerful tool to identify functionally relevant cleavage sites. Proteolytic activation is a characteristic feature of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel (ENaC). The final activating step involves cleavage of the channel’s γ-subunit in a critical region potentially targeted by several proteases including chymotrypsin and plasmin. To determine the stimulatory effect of these serine proteases on ENaC, the amiloride-sensitive whole-cell current (ΔIami) was measured twice in the same oocyte before and after exposure to the protease using the two-electrode voltage-clamp technique. In parallel to the electrophysiological experiments, a biotinylation approach was used to monitor the appearance of γENaC cleavage fragments at the cell surface. Using the methods described, it was demonstrated that the time course of proteolytic activation of ENaC-mediated whole-cell currents correlates with the appearance of a γENaC cleavage product at the cell surface. These results suggest a causal link between channel cleavage and channel activation. Moreover, they confirm the concept that a cleavage event in γENaC is required as a final step in proteolytic channel activation. The methods described here may well be applicable to address similar questions for other types of ion channels or membrane proteins.
Introduction
פרוטאזות הן אנזימים שמעורבים בתגובות פיסיולוגיות שונות הנעות בין השפלה מפרקי חלבונים הידועה של חלבונים, בהקשר של מערכת העיכול, למפלי פרוטאז מתוחכמים המעורבים במסלולי איתות רגולציה מורכבים. פרוטאזות מסווגות לשבע קבוצות על פי האתר הפעיל הקטליטית שלהם: aspartate, asparagine, ציסטאין, חומצה גלוטמית, metallo, סרין, ופרוטאזות תראונין. פרוטאזות שונות למקד לאתרי מחשוף ברורים שהם לא תמיד קלים לחזות מהמבנה הראשוני של חלבון. מסד הנתונים Merops (http://merops.sanger.ac.uk/) מספק מידע מפורט על מגוון רחב של פרוטאזות ואתרי המחשוף המועדף שלהם. ניתן לזהות אתרי מחשוף רלוונטיים מבחינה תפקודית באמצעות מכוון mutagenesis אתר.
היא מבוססת היטב כי עיבוד מפרקי חלבונים של ENaC הוא מנגנון חשוב של הפעלה של ההוא 1,2 ערוץ יון מסוים. מעניין, יש ראיות לכך שהפונקציה של 1a חישת החומצה הקשור ערוץ יון (ASIC1a) יכולה גם להיות שונה על ידי פרוטאזות 3-5. נכון לעכשיו היא נשארת שאלה פתוחה אם מחשוף ערוץ מפרקי חלבונים ממלא תפקיד פיסיולוגי רלוונטי בהסדרת פעילותם של תעלות יונים אחרות או מובילים. עם זאת, הוא מבוסס היטב כי מחשוף מפרקי חלבונים מפעיל קבוצה של קולטני G-חלבון בשילוב, הקולטנים מופעל פרוטאז (PARS) 6. פרוטאזות סרין כמה (פרוטאזות למשל הפעלת ערוצים (CAP1-3), chymotrypsin, טריפסין, furin, plasmin, elastase נויטרופילים, וkallikrein) הוכחו להפעיל proteolytically ENaC 2. בנוסף לפרוטאזות סרין, קבוצות אחרות של פרוטאזות עשויות להיות מעורבות בהפעלת ENaC מפרקי חלבונים. ואכן, הנתונים אחרונים מראה כי פרוטאינאז meprin-β 7 ופרוטאז ציסטאין cathepsin-S 8 יכול גם Activate ENaC. עם זאת, פרוטאזות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית (פתים-) להפעלת ENaC להישאר שייקבעו ועשויות להיות שונות מהרקמה לרקמה.
פרוטאזות ידועות לדבוק מעדיפים באתרים מסוימים ברצף חומצות אמינו. לדוגמא, chymotrypsin פרוטאז סרין מציג דפוס מחשוף ספציפי ביקוע אחרי חומצה אמינית ארומטיים שאריות פנילאלנין וטירוזין. לעומת זאת, טריפסין פרוטאז סרין מעדיף דבק לאחר יזין השאריות הבסיסי או ארגינין. באמצעות בונה γENaC אדם מוטציה שנוצרה על ידי מכוון mutagenesis אתר, אתרי מחשוף רלוונטיים מבחינה תפקודית בENaC הביעו heterologously במערכת ביטוי הביצית יכולים להיות מזוהים 8-13.
על ידי הזרקת קרנה ליחידות משנת שלוש ENaC (αβγ) לתוך ביציות מבודדות, ENaC יכול לבוא לידי ביטוי מבחינה תפקודית בתאים אלה ופעילותם של ערוצים נוכחים בקרום הפלזמה ניתן למדוד על ידיבאמצעות טכניקת המתח-clamp שתי אלקטרודות. על ידי שימוש באמילוריד משתן, מעכב ENaC ספציפי, רכיב אמילוריד רגיש בתיווך ENaC כל התא הנוכחי (ΔI עמי) יכול להיות מופרד מזרמי דליפה נוקבים או מזרמים שנערכו על ידי תעלות יונים אחרות. לפיכך, ערכי ΔI עמי משקפים פעילות ENaC כללית ויכולים שייקבעו על ידי הפחתת כל תא זרמים נמדדים בנוכחות אמילוריד מכל תא הזרמים המקביל נרשמו בהעדר אמילוריד. כדי לבדוק אם פרוטאז יש השפעה ממריצה על ENaC, ΔI עמי נמדד פעמיים באותו הביצית, כלומר לפני ואחרי הדגירה של הביצית בתמיסה המכיל פרוטאז. גידול של ΔI עמי מהראשון למדידה השנייה מציין הפעלת ENaC מפרקי חלבונים. Chymotrypsin או טריפסין ידוע כדי לעורר מקסימאלי ENaC במערכת ביטוי הביצית 2,14 וניתן להשתמש בם לconfirm כי הפעלת ENaC מפרקי חלבונים ניתן לזהות באצווה מסוימת של ביציות.
במקביל למדידות זרם כל התא, גישת biotinylation 9 הייתה בשימוש כדי לחקור האם הגידול בΔI עמי מזוהה עם חשיפה של הביציות לפרוטאזות בקורלציה עם הופעתו של ENaC מחשוף שברים על פני התא. חלבונים בתא השטח מסומנים עם ביוטין ויכולים להיות מופרדים מחלבונים תאיים באמצעות קשירת חלבוני biotinylated לחרוזי agarose כותרת Neutravidin. ניתן לנתח חלבוני biotinylated על ידי כתם מערבי. שברי מחשוף γENaC על פני התא ניתן לאתרם באמצעות נוגדן ספציפי המכוון כנגד אפיטופ בC-הסופית של γENaC. כדי לזהות את האתר רלוונטי מבחינה תפקודית מחשוף (ים), שחזה יכולים להיות מוטציה אתרי מחשוף שימוש מכוון mutagenesis אתר. ערוצי wildtype והמוטציה הם בהשוואה בניסויים מקבילים באמצעות ביציות מהיםאצווה איימי.
עם גישה המתודולוגית זה הודגם לראשונה כי הפעלת מפרקי חלבונים של כל תא זרמים בתיווך ENaC קורלציה עם המראה תלוי הזמן של ENaC מחשוף שברים על פני התא. תוצאות אלו מצביעות על קשר סיבתי בין מחשוף ערוץ והפעלת ערוץ. יתר על כן, באמצעות מכוון mutagenesis אתר של אתרי מחשוף המשוערת בשילוב עם הטכניקה של שתי האלקטרודה המתח-clamp, אתרי מחשוף רלוונטיים מבחינה תפקודית לplasmin, chymotrypsin 13 וcathepsin-S 8 זוהו.
Protocol
Representative Results
Discussion
בכתב היד הזה גישה המתודולוגית שיושמה בהצלחה ללמוד את מנגנוני ההפעלה של ENaC ידי פרוטאזות מתוארת 8,13. המערכת המבוססת היטב Xenopus laevis ביצית הביטוי שימשה לENaC תפקודי המפורש. פונקצית ENaC הוערכה עם טכניקת המתח-clamp שתי אלקטרודות הקונבנציונלית. מכוון mutagenesis אתר הועסק כדי לזהות אתרי מחשוף פרוטאז רלוונטיים מבחינה תפקודית. ניסויי biotinylation בוצעו במקביל למדידות אלקטרו אפשרו לתאם את המראה של ENaC מחשוף מוצרים על פני התא עם הפעלה נוכחית מפרקי חלבונים. קורלציה בין מהלך הזמן של הפעלה הנוכחית ואת המראה של שברי מחשוף מפרקי חלבונים בתא השטח תומכת ברעיון של הפעלת ערוץ מפרקי חלבונים.
הקלטות המתח-clamp שתי אלקטרודות דורשות impalement של oocyte עם שני microelectrodes. הליך זה מבוצע בדרך כלל פעם אחת בלבד בביצית בודדת. עם זאת, זה היה אפשרי על מנת להסיר את microelectrodes לאחר הקלטה נוכחית כל תא ראשוני ללא נזק נראה לעין לביצית. ואכן, קרום הפלזמה באתרי impalements נראה לחתום מחדש תוך כמה דקות. לפיכך, לאחר שסיים את מדידת המתח-clamp שתי האלקטרודה ראשונה, זה אפשרי להעביר את הביצית מתא הזרימה הניסיונית של התקנת המתח-clamp שתי אלקטרודות לצינור microfuge או גם צלחת 96 היטב מלאה נפח קטן של פתרון מבחן או שליטה. לאחר מכן, באותה הביצית יכולה להיות מועברת חזרה לתא הזרימה והוא יכול להיות משופד שוב לבצע מדידת המתח-clamp שתי האלקטרודה שנייה. למרבה הפלא, זרמים בתיווך ENaC לא משתנים הרבה בין המדידה הראשונה ושנייה, כאשר הביצית נשמרה בפתרון שליטה. לעומת זאת, דגירה של הביצית בסול פרוטאז המכילution אחרי המדידה הראשונה הביא הנוכחי בתיווך ENaC המוגבר במדידה השנייה (איור 2). ממצא זה מצביע על הפעלת ערוץ מפרקי חלבונים.
ביצוע שתי מדידות זרם נפרדות בביצית אחת מציע את היתרון שהביצית יכולה להיות חשופה לפרוטאזות או סוכנים תרופתיים אחרים בין שתי המדידות לאורך זמן משתנה בנפח קטן של פתרון מבחן. זה חשוב כאשר משתמשים בסוכנים שהם יקרים ו / או לא זמינים בכמויות גדולות, למשל הכנות פרוטאז מטוהרים. הזמינות המוגבלת של סוכנים עשויה להפוך אותו לבלתי אפשרי (או מעבר להישג יד) כדי להשתמש בם בהקלטות המתח-clamp שתי אלקטרודה רציפות בגלל הכמויות הגדולות של פתרון מבחן הנדרש לרציפות superfusing הביציות עם ספיקות של כמה מיליליטר לדקה. יתר על כן, מדידות המתח-clamp שתי אלקטרודה רציפות מוגבלות על ידי Phenom הידועEnon של מוזנח ערוץ ספונטני גם תאר ל15 ENaC. לעומת זאת, חשיפת ביציות כדי לבדוק פתרונות בין שתי מדידות נפרדות לעד שעה או יותר בדרך כלל אינו מהווה בעיה (ראה איור 4 א). לבסוף, שתי מדידות רציפים שבוצעו באותה הביצית מאפשרות תצפיות לזווג של השפעות תרופה. זו יש יתרון על פני מדידות מזווגים משתי קבוצות נפרדות של ביציות (שטופלה פרוטאז ורכב שטופלה), משום שהיא מפחיתה את הבעיה של שונות גבוהות בין הביציות, בדרך כלל נצפו בביטוי ערוץ יון. עם תצפיות לזווג והאפשרות לנרמל את הנתונים למדידה הראשונה, פחות ביציות נדרשות לכל קבוצת ניסוי כדי להדגים אפקט משמעותי של סוכן תרופתי. נורמליזציה של נתונים גם עושה את זה קל לסכם נתונים מקבוצות שונות של ביציות עם רמות שונות ערוץ יון ביטוי וזרמים שונים ומכאן בסיס (איור 2). כמובן, ניסויי שליטה נחוצים לגישה זו על מנת להוכיח כי פעילות ערוץ יון של עניין נותרת יציבה בביציות שליטת רכב שטופלה מהראשונה למדידה השנייה (ראה איור 2).
על מנת להוכיח כי הפעלה נוכחית מפרקי חלבונים קושרים עם הופעתו של ENaC מחשוף מוצרים על פני התא, גישת biotinylation תוארה במקור על ידי האריס et al. 9 ניתן להשתמש. הליך זה (כמפורט בסעיף הפרוטוקול ומוצג באיור 4) הותאם להפגין חשיפת שערוצי פרוטאזות וההפעלה הבאה של זרמים בתיווך ENaC הקביל על ידי הופעתו תלויה בזמן של שברי מחשוף. שיטת biotinylation גם מאפשרת הניתוח של עלייה כללית או ירידה של חלבונים בממברנה על פני התא. לכן, שיטה זו מתאימה כדי לחקור את ההשפעה של פרוטאזות וPhar האחרסוכני macological על הכנסת ערוץ לתוך קרום הפלזמה או על שליפת ערוץ. יתר על כן, ניתוח כתם המערבי של חלבוני קרום הפלזמה biotinylated מאפשר זיהוי של שברי חלבון (לדוגמא: שברי ENaC מפרקי חלבונים) או שינויים בדפוס glycosylation אשר עשוי להיות רלוונטיות מבחינה תפקודית.
לסיכום, השילוב של שיטות המשמש כדי לחקור את ההשפעה של גירוי של פרוטאזות בכל תא זרמים בתיווך ENaC ולהפגין מתאם עם המופע של ENaC מחשוף מוצרים על פני התא עשוי להיות שימושי עבור מגוון רחב של יישומים. בפרט, שיטות אלו עשויות להיות מתאימות כדי לענות על שאלות דומות לגבי הרגולציה של ערוצים אחרים יון, מובילים או קולטנים הטרנסממברני (למשל הקולטנים מופעל פרוטאז PARS).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The expert technical assistance of Céline Grüninger, Christina Lang, Sonja Mayer, and Ralf Rinke is gratefully acknowledged. We thank Dr. Morag K. Mansley for carefully reading the manuscript. This project was supported by a grant of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grant SFB 423: Kidney Injury: Pathogenesis and Regenerative Mechanisms, to C. Korbmacher), grants of the Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (to S. Haerteis and M. Krappitz), the ELAN program (to S. Haerteis) of the Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, and the University Library of Erlangen-Nürnberg.
Materials
| Bath Clamp Headstage for OC-725C-V | Warner Instrument Corporation | – | |
| Cold light source – Schott KL 1500 LCD | Schott | #SCOC150200EU | brightness 4; mechanical aperture: D; color temperature: 3000 K |
| E Series Electrode Holder (Str, Vent, Ag Wire, 1.2 mm) | ADinstruments | #ESW-F10v | |
| left micromanipulator; MM-33L | Warner Instrument Corporation | #64-0055 | |
| LIH 1600 – computer interface | HEKA | – | |
| magnetic valve system (ALA BPS-8) in combination with a TIB14 interface (HEKA) | ALA Scientific Instruments, HEKA | – | |
| OC-725C amplifier for two-electrode voltage-clamp recordings | Warner Instrument Corporation | – | |
| P-97 FLAMING/BROWN Micropipette Puller | Sutter Instruments | – | heat=550; velocity=22; time=200 |
| right micromanipulator; MM-33R | Warner Instrument Corporation | #64-0056 | |
| Series Electrode Holder (45°, Vent, Handle, Ag Wire, 1.2 mm) | ADinstruments | #E45w-f10vh | |
| STAT 2 IV Gravity Flow Controller | Conmed | #P-S2V-60 | |
| vacuum generator ejector SEG – for suction to remove bath solution | Schmalz | – | |
| Material | |||
| INFUJECT 60ml pump syringes for solutions | Braun | #22050 | |
| Injekt-F for lysing the oocytes | Braun | #9166033V | |
| standard wall borosilicate tubing with filament | Sutter Instruments | #BF150-86-10 | outside diameter: 1.50 mm; inside diameter: 0.86 mm; length: 10 cm |
| Reagent | |||
| complete, Mini, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Applied Science | #11836170001 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | #21217 | |
| Horseradish peroxidase-labeled secondary goat anti-rabbit antibody | Santa Cruz Biotechnology | #sc-2004 | |
| NeutrAvidin Agarose | Thermo Scientific | #29200 | Neutravidin-labeled agarose beads |
| NP40 (Nonidet P-40) | Sigma-Aldrich | #I8896 | |
| Roti-Load 1 (2× SDS-PAGE sample buffer) | Carl Roth | #K929.2 | |
| SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate for detection of chemiluminescent signals | Thermo Scientific | #34095 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 | |
References
- Kleyman, T. R., Carattino, M. D., Hughey, R. P. ENaC at the cutting edge: regulation of epithelial sodium channels by proteases. The Journal of Biological Chemistry. 284, 20447-20451 (2009).
- Rossier, B. C., Stutts, M. J. Activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by serine proteases. Annu Rev Physiol. 71, 361-379 (2009).
- Poirot, O., Vukicevic, M., Boesch, A., Kellenberger, S. Selective regulation of acid-sensing ion channel 1 by serine proteases. The Journal of Biological Chemistry. 279, 38448-38457 (2004).
- Vukicevic, M., Weder, G., Boillat, A., Boesch, A., Kellenberger, S. Trypsin cleaves acid-sensing ion channel 1a in a domain that is critical for channel gating. The Journal of Biological Chemistry. 281, 714-722 (2006).
- Clark, E. B., Jovov, B., Rooj, A. K., Fuller, C. M., Benos, D. J. Proteolytic cleavage of human acid-sensing ion channel 1 by the serine protease matriptase. The Journal of Biological Chemistry. 285, 27130-27143 (2010).
- Ossovskaya, V. S., Bunnett, N. W. Protease-activated receptors: contribution to physiology and disease. Physiological reviews. 84, 579-621 (2004).
- Garcia-Caballero, A., et al. Activation of the epithelial sodium channel by the metalloprotease meprin β-subunit. Channels (Austin. 5, 14-22 (2011).
- Haerteis, S., et al. Proteolytic activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by the cysteine protease cathepsin-S. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 353-365 (2012).
- Harris, M., Firsov, D., Vuagniaux, G., Stutts, M. J., Rossier, B. C. A novel neutrophil elastase inhibitor prevents elastase activation and surface cleavage of the epithelial sodium channel expressed in Xenopus laevis oocytes. The Journal of Biological Chemistry. 282, 58-64 (2007).
- Passero, C. J., Mueller, G. M., Rondon-Berrios, H., Tofovic, S. P., Hughey, R. P., Kleyman, T. R. Plasmin activates epithelial Na+ channels by cleaving the γ-subunit. The Journal of Biological Chemistry. 283, 36586-36591 (2008).
- Svenningsen, P., et al. Plasmin in nephrotic urine activates the epithelial sodium channel. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 20, 299-310 (2009).
- Patel, A. B., Chao, J., Palmer, L. G. Tissue kallikrein activation of the epithelial Na channel. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 303, (2012).
- Haerteis, S., Krappitz, M., Diakov, A., Krappitz, A., Rauh, R., Korbmacher, C. Plasmin and chymotrypsin have distinct preferences for channel activating cleavage sites in the γ-subunit of the human epithelial sodium channel. The Journal of General Physiology. 140, 375-389 (2012).
- Chraibi, A., Vallet, V., Firsov, D., Hess, S. K., Horisberger, J. D. Protease modulation of the activity of the epithelial sodium channel expressed in Xenopus oocytes. The Journal of General Physiology. 111, 127-138 (1998).
- Volk, T., Konstas, A. A., Bassalay, P., Ehmke, H., Korbmacher, C. Extracellular Na+ removal attenuates rundown of the epithelial Na+-channel (ENaC) by reducing the rate of channel retrieval. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 447, 884-894 (2004).
