切断断片の検出と電流測定を組み合わせることにより、上皮性ナトリウムチャネル（ENaCの）のタンパク質分解活性の実証

アフリカツメガエル卵母細胞およびcRNAのマイクロインジェクションの1。分離大人の女性のアフリカツメガエル卵母細胞から入手します。 0.2％MS222に動物を麻酔し、小さな腹部切開を通して卵巣葉を切除。 カルシウム自由OR2溶液（ 表1のレシピ）に溶解したクロストリジウムヒストリチカムからタイプ2コラゲナーゼの600〜700 U / mlの3〜4時間、19℃で酵素消化により卵巣葉から卵母細胞を分離します。 選択のために、溶液（ 表1中のレシピND96）を含む高ナトリウムでの双眼顕微鏡下でシャーレに濾胞除去卵母細胞を配置。 ステージV〜VIの卵母細胞を選択し、パスツールピペットを用いて別のペトリ皿に入れます。注：ブラントパスツールピペットを卵母細胞の損傷を防ぐために、燃えるようで。 cRNAを（ 例えば 0.2 ngのあたりαβγENaCサブユニット）との卵母細胞を注入する。 RNaseフリー水にcRNAを溶解する。注：合計各卵母細胞に注入された量は46 NLです。 （ 表1にレシピND9）ストアは卵母細胞のナトリウム負荷を防ぐために低ナトリウム溶液中で19℃で卵母細胞を注入した。細菌の増殖を防ぐために、100 U / mlのナトリウムペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシン硫酸塩を含む溶液を補足する。慎重に損傷したか死ん卵母細胞の量を制限し、cRNAを注入後2日間はバス溶液で満たされた12穴プレートのウェル中の個々の小グループでそれらを維持するために、卵母細胞を処理します。 2。2電極電圧クランプ実験を行う 2日間の注射後の卵母細胞を測定します。 ND96溶液による重力供給灌流システムとアミロリド（2μM）を含むND96溶液で別の注射器の1注射器を埋める。マウントは50センチメートル卵母槽室の上に注射器。 NOTE：のENaC阻害剤アミロライドの濃度は、そのIC 50よりも20倍高くなるように選択された</サブ>（100nm）である。 150Wのハロゲン冷光源をオンにして、双眼顕微鏡との良好な可視化を可能にする卵母槽室10cm上にそれを調整します。その後、吸引をオンにし、卵母槽室の終了時に吸引チューブを調整します。卵母細胞の風呂に入るチューブ」アダプタを灌流吸引チューブの反対の位置を確認します。注：吸引力は、卵母細胞をsuperfusingソリューションを継続的にサポートするのに十分なものでなければならない。 静脈重力流量制御装置を使用して3〜5ミリリットル/分に各溶液の灌流速度を調整。卵母槽室アダプターに灌流チューブを接続します。 <1ミクロンの先端径を得るために、マイクロピペットプラーとガラスキャピラリーを引き出します。その後、3 M KClで〜1月4日に毛細血管を埋める。注：電極ホルダの銀線の塩素部分が塩化カリウム溶液に浸漬されていることを確認してください。キャピラリの先端に空気の泡を確認してください。気泡がmeasuを損なう抵抗の浮遊容量を増加させることによりrement。 現在の電極ホルダと電圧電極に毛細血管を挿入し、マイクロマニピュレータを用いて、アミロライド（2μM）溶液を含むND96にそれらを配置します。 アミロライド感受性全細胞電流の3。測定ゼロは、V mとV eを調整することにより電圧電極（V m）の 、および電流電極（V eの ）の電極電位は、 ボタンのオフセットNOTE：抵抗はV mおよび0.5を測定するための電極用1-2MΩでなければならない電流注入電極用-1MΩ。 電圧検出電極に近接した浴槽室に卵母細胞を配置します。注：これらの転写工程のいずれかの間に卵母細胞に損傷を与えないでください。卵母細胞を転送するためにパスツールピペットを使用してください。ピペットのエッジが燃えることで平滑化されるべきである卵母細胞の損傷を避けるため。 OOを突き刺す両方の微小電極でやさしくcytes。 -60 mVまでアンプの保持電位を設定し、チャートレコーダーの電源をオンにします。溶液を含むアミロライド（2μM）をオンにします。注：現在は約0±0.5μAである必要があります。大きなリーク電流が漏れやすい串刺しを示す。したがって、これらの卵母細胞は拒絶されるべきである。また、アミロライドの存在下で測定リーク電流（2μM）は、卵母細胞に発現αβγ変異のENaCで測定されたものに卵母細胞に発現αβγ-WTに類似していなければならない。これは変異がチャンネルのアミロライド感受性に影響を与えないことを示しています。 録音を開始する。必要に応じてゲインを調整します。 測定された電流が安定したプラトーに達した後、アミロリドを含まない溶液に変更します。注：電流トレースの下向き現在たわみが内向き電流、細胞内への細胞外側から正電荷すなわち運動し（Na +）に対応しています。 AF現在のプラトー（〜60秒後）に達するterを、背中溶液を含むアミロライドに灌流を切り替える。卵母細胞の電流が初期のベースライン電流に達すると、電圧クランプをオフにして、静かに電極を引き出す。 串刺し部位で細胞膜の再封可能にするために、プロテアーゼフリーのND96溶液を100〜150μLを含む96ウェルプレートの1ウェルに卵母細胞を置く。 5分後、30分のインキュベーション時間の溶液を含有するプロテアーゼまたはプロテアーゼを含まない対照溶液に卵母細胞を移す。注：インキュベーション時間は、プロテアーゼ、研究チャネルに依存します。 インキュベーション工程の後に、現在の測定値（3.2および以下を参照してください）​​を繰り返します。 NOTE：これは、プロテアーゼ溶液中でのインキュベーション後、卵母細胞の> 90％を測定することが可能である。 4。ビオチン化アッセイ選択し、双眼顕微鏡下での不良卵母細胞を捨てる。注：使用して注入電流測定用とビオチン化実験のための同じバッチから卵母細胞を編実験では、使用前に少なくとも20分間RTでビオチンを保管してください。 溶液を調製：ND96とND96は、適切なプロテアーゼを含有する。それらを標識することにより、短時間卵母細胞の傷害を避けるために、それらの先端を燃えることでパスツールピペットを準備します。 NOTE：ここで、ND96中のプロテアーゼキモトリプシンの2μg/ mlのに使用される。溶液の交差汚染を回避するために、別個のピペットで各グループを扱う。 RTでプロテアーゼを含有する2.5ミリリットル制御ND96またはND96に6ウェルプレートの各ウェルを埋める。次いで、ウェルにつき30卵母細胞を堆積し、RTで30分間それをインキュベートする。注：以降の手順については、それがすべての回でサンプルを氷上で維持することが重要である。全ての遠心分離工程は4℃で行われる 2.5ミリリットルのND96（各グループが洗浄ステップのための3つのウェルを必要とします）を使用して新しい6ウェルプレートの各ウェルを記入し、ビオチンを比較検討する。注：2.5 mgのビオチンPERウェル（1 mg / ml）を必要とされている。 25ミリリットルビオチン化バッファー（ 表1のレシピ）でのビオチン化バッファ10グループについて（ すなわち 25mgのビオチン（）にビオチンを溶解する。 よく2.5ミリリットルのND96でいっぱいに卵母細胞の各グループを転送します。転送が残っているプロテアーゼを洗い流しND96との二つの追加のウェルに順次卵母。 ND96中で5分間の卵母細胞をインキュベートする。 よく含む2.5ミリリットルビオチン溶液に卵母細胞を移し、15分間穏やかに攪拌（ 'シェーカー'）でそれらをインキュベートする。注：ビオチン溶液の希釈を避けるために、ピペットで移すND96を最小限に抑えます。 ビオチン化反応を停止させるとともに含む2.5ミリリットルクエンチバッファー（ 表1のレシピ）に卵母細胞の各グループを転送します。その後、また2.5ミリリットルを含む第二のウェルに卵母細胞の各グループを転送し、バッファと穏やかに攪拌しながら5分間インキュベートクエンチ。 損傷したか死ん卵母細胞を除去します。注：次の手順のためのグループごとの卵母細胞と同じ数を選択してください。 1.5ミリリットルのプラスチックマイクロチューブに卵母細胞の各グループを転送します。注：転送され、クエンチバッファーの量を最小限に抑えます。 続いて、プロテアーゼ阻害剤を補充した（レシピは表1を参照）を1mlの溶解緩衝液中の27 G針を介してそれらを通過させることにより卵母細胞を溶解する。 遠心1,500×gで10分間溶解物。 上清を吸引し、および0.5％トリトン-X-100および0.5％NP40を含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブに移す。残ったペレットを捨てる。注：上清を、ビオチン化細胞膜タンパク質及び非ビオチン化細胞内タンパク質が含まれています。 氷上で20分間マイクロ遠心チューブをインキュベートします。繰り返し完全NP40およびTriton-X-100でタンパク質を溶解するために、この期間中にチューブをボルテックス。 遠心分離機1500 X gで3分間の卵母細胞のグループごとにアガロースビーズを100μl。後に遠心分離は、ビーズ溶液から上澄みを除去し、緩衝液でビーズを平衡化するために、溶解緩衝液で3回洗浄する。 ビーズへのビオチン化タンパク質の結合を可能にするために4.13に調製されたタンパク質 – 界面活性剤溶液を含む各マイクロ遠心チューブに洗浄したビーズ100μLを加える。 4℃でオーバーヘッド回転のO / Nでマイクロチューブをインキュベート遠心1,500 x gで3分間のマイクロ遠心チューブに。次に、新しいチューブに上清を移す。注：細胞内タンパク質をビオチンで標識されていません。上清を-20℃で保存することができますビーズを吸引しないでください。 ウェスタンブロット分析により、細胞表面でのENaCの切断断片の5。検出溶解緩衝液でビーズを3回洗浄し、2×SDS-PAGE試料緩衝液100μlを加える。注：サンプルを-20℃で貯蔵するか、即座にウェスタンブロット分析のために調製することができる。 沸騰Sその後、95℃で5分間amples管を氷の上に置きます。 2万×gで3分間遠心サンプルと新しいマイクロチューブに上清をピペットで。注：この上清は、卵母細胞の細胞表面からビオチン化細胞膜タンパク質が含まれています。 細胞表面で切断断片を調査するために、ウエスタンブロットにより、この上澄み液30μlを分析します。 適切なゲル（調べ切断断片の分子量に応じて8％、10％、12％）を用いてSDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）により、ビオチン化タンパク質を分離する。 セミドライブロッティングによってポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜にタンパク質を移す。 （ 図3および13を参照のこと）C末端中のエピトープに対するヒトγENaCに対する特異的抗体を用いて膜をプローブ。 二次抗として西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体を使用しボディ。 化学発光シグナルを検出する。