Bölünme Fragmentlerin Algılama ile Akım Ölçümleri birleştiren tarafından Epitel Sodyum Kanalı (ENaC) proteolitik Aktivasyonunun gösteri
Summary
Xenopus oocytes içerisinde heterolog olarak ifade epitelyal sodyum kanal (ENaC) proteolitik aktivasyon oosit hücre yüzeyinde iyon kanal bölünme ürünlerinin görünümünü araştırmak için bir biyotinilasyon yaklaşımla akım ölçümleri birleştirerek gösterilebilir laevis. Fonksiyonel olarak önemli bölünme mevkilerinin yer yönlendirmeli mutajenezi kullanarak tespit edilebilir.
Abstract
The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes. In combination with site-directed mutagenesis, this approach provides a powerful tool to identify functionally relevant cleavage sites. Proteolytic activation is a characteristic feature of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel (ENaC). The final activating step involves cleavage of the channel’s γ-subunit in a critical region potentially targeted by several proteases including chymotrypsin and plasmin. To determine the stimulatory effect of these serine proteases on ENaC, the amiloride-sensitive whole-cell current (ΔIami) was measured twice in the same oocyte before and after exposure to the protease using the two-electrode voltage-clamp technique. In parallel to the electrophysiological experiments, a biotinylation approach was used to monitor the appearance of γENaC cleavage fragments at the cell surface. Using the methods described, it was demonstrated that the time course of proteolytic activation of ENaC-mediated whole-cell currents correlates with the appearance of a γENaC cleavage product at the cell surface. These results suggest a causal link between channel cleavage and channel activation. Moreover, they confirm the concept that a cleavage event in γENaC is required as a final step in proteolytic channel activation. The methods described here may well be applicable to address similar questions for other types of ion channels or membrane proteins.
Introduction
Proteazlar, karmaşık bir düzenleyici sinyal yollarıyla ilgili son derece gelişmiş proteaz cascades, sindirim bağlamında, proteinlerin bilinen proteolitik bozulması kadar çeşitli fizyolojik reaksiyonların katılan enzimlerdir. Proteazlar katalitik aktif sitesine göre, yedi gruba ayrılır: aspartat, asparagin, sistein, glutamik asit, metalo, serin, treonin ve proteazlardır. Farklı proteazlar, her bir proteinin birincil yapısı tahmin etmek kolay değildir ayrı bölünme mevkilerini hedef. MEROPS veritabanı ( http://merops.sanger.ac.uk/ ) Proteazlarla ve tercihli bölünme sitelerinin geniş bir yelpazede ayrıntılı bilgi sağlar. Fonksiyonel olarak, ilgili bölünme mevkilerinin yer yönlendirmeli mutagenez kullanılarak tespit edilebilir.
İyi ENaC'nın proteolitik işleme th aktivasyonu önemli bir mekanizmadır olduğu saptanmıştırÖzellikle iyon kanalı 1,2 olduğunu. İlginç bir şekilde, ilgili aside duyarlı iyon kanalı 1a (ASIC1a) fonksiyonu da proteazlar 3-5 ile modifiye edilebilir ki bir kanıt yoktur. Şu anda bu proteolitik kanal bölünme diğer iyon kanalları ya da taşıyıcıları aktivitesini düzenleyen bir ilgili fizyolojik bir rolü olup olmadığını açık bir soru kalır. Bununla birlikte, iyi proteolitik bölünme G-protein bağlı reseptörler, proteaz tarafından aktive edilen reseptör (PAR) bir grup aktive olduğu saptanmıştır 6. Çeşitli serin proteazları (örneğin, kanal aktive edici proteazların (cap1-3), kimotripsin, tripsin, furin, plasmin, nötrofil elastaz ve kallikrein) proteolitik ENaC 2 etkinleştirmek için gösterilmiştir. Serin proteazlara ilave olarak, proteaz diğer gruplar proteolitik ENaC aktivasyonu dahil olabilir. Gerçekten de, son veriler göstermektedir ki metaloproteinaz meprin-β 7 ve sistein proteaz, katepsin S-8 Ayrıca, Activate ENaC. Bununla birlikte, aktivasyon için ENaC (pato-) fizyolojik olarak uygun proteazlar, belirlenecek kalır ve dokuya dokudan farklı olabilir.
Proteazlar, tercihen, amino asit sekansında belirli bölgelerindeki parçalamak için bilinir. Örneğin, serin proteaz kimotripsin, aromatik amino asit, fenilalanin ve tirozin kalıntıları sonra yaran belirli bir yarılma modelini göstermektedir. Temel kalıntılar, lisin ya da arginin sonra aksine, serin proteaz tripsin tercihli olarak böler. , Alana-yönelik mutagenez ile üretilen mutasyona uğramış insan γENaC yapıları kullanılarak, heterolog oosit ekspresyon sistemi içinde eksprese ENaC'nın işlevsel olarak ilgili bölünme mevkilerinin 8-13 tespit edilebilir.
Izole oositlerine ENaC üç birimden (αβγ) için cRNA ile enjekte, ENaC işlevsel olarak bu hücrelerde ifade edilebilir ve plazma membranında mevcut kanallarının aktivitesi ile ölçülebiliriki elektrotlu voltaj-kelepçe tekniği kullanılarak üretilebilir. Diüretik amilorit, belirli bir ENaC inhibitörü, amiloride duyarlı ENaC aracılı bütün hücre akımı bileşen (ΔI ami) kullanılarak spesifik olmayan kaçak akımlar ya da başka iyon kanalları tarafından yürütülen akımlarından ayrılabilir. Bu nedenle, ΔI ami değerler genel ENaC aktivitesini yansıtır ve amilorid yokluğunda kaydedilen ilgili bütün hücre akımlardan amilorid varlığında ölçülen bütün hücre akımları çıkarılması ile tespit edilebilir. Bir proteaz ENaC'nın üzerinde uyarıcı bir etkiye sahip olup olmadığını test etmek için, ΔI ami yani önce ve bir proteaz içeren bir çözelti içinde, oositin inkübasyonundan sonra, aynı oosit iki kez ölçülür. Ikinci ölçüm birinci ΔI ami bir artış proteolitik ENaC aktivasyonunu gösterir. Kimotripsin ne de tripsin maksimum oosit ekspresyon sistemi içinde 2,14 ENaC uyarmak için bilinmektedir ve emin olmalarına kullanılabilirrm proteolitik harekete geçirme ENaC oosit belirli bir yığını olarak tespit edilebilir.
Bütün hücre akım ölçümleri paralel olarak, biyotinilasyon yaklaşım 9 ENaC'nın görünümü ile ilişkilidir hücre yüzeyinde fragmanları bölünmeye ΔI ami artış proteazlara maruz kaldığında oosit tespit olup olmadığını araştırmak için kullanıldı. Hücre yüzeyindeki proteinler biotin ile etiketlendi ve Neutravidin etiketli agaroz tanelerine biyotinile edilmiş proteinlerin bağlanması ile hücre içi proteinlerin ayrılabilir. Biyotinlenmiş proteinler western blot ile analiz edilebilir. Hücre yüzeyinde γENaC bölünme fragmanları, γENaC C-terminalinde bir epitopa karşı yönlendirilen özel bir antikor kullanılarak tespit edilebilir. Işlevsel olarak ilgili bölünme sitesi (ler) i tespit etmek için, bölünme mevkilerinin yer yönelimli mutagenez kullanılarak mutasyona uğratılabilir öngördü. Vahşi tipli ve mutant kanalları s den oosit kullanılarak paralel deneyler ile karşılaştırılırame toplu.
Bu metodolojik yaklaşım sayesinde ENaC aracılı bütün hücre akımların proteolitik harekete geçirme hücre yüzeyinde fragmanlarının bölünmeye ENaC'nın zamana bağımlı bir görünüm ile ilişkili olduğunu ilk kez gösterilmiştir. Bu sonuçlar kanal bölünme ve kanal aktivasyonu arasında nedensel bir bağlantı olduğunu düşündürmektedir. Ayrıca, iki-elektrotlu voltaj-kelepçe tekniği, plazmin için, fonksiyonel olarak bağlantılı yarılma siteleri, 13, Kimotripsin ve katepsin S-8 ile birlikte varsayılan yarılma siteleri yer yönelimli mutagenez kullanılarak tespit edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda başarılı bir proteaz ile ENaC'nın aktivasyonunu altında yatan mekanizmaları incelemek için uygulanan bir metodolojik 8,13 yaklaşım tarif edilmektedir. Iyi kurulmuş Xenopus laevis oosit ekspresyon sistemi işlevsel olarak ifade ENaC için kullanılmıştır. ENaC işlevi geleneksel iki elektrotlu voltaj-kelepçe tekniği ile değerlendirildi. Yer yönlendirmeli mutagenez, işlevsel olarak ilgili bir proteaz bölünme mevkilerini belirlemek için kullanılmıştır. Elektrofizyolojik ölçümlerle paralel olarak gerçekleştirilen deneyler Biyotinilasyon mümkün ENaC'nın görünümünü mevcut proteolitik aktivasyon, hücre yüzeyinde ürün bölünmeye ilişkilendirmek için yapılmıştır. Mevcut aktivasyon zaman süreci ve hücre yüzeyinde proteolitik yarılma fragmanlarının görünüşü arasında bir korelasyon proteolitik kanal aktivasyon kavramını desteklemektedir.
Iki elektrotlu voltaj-kelepçe kayıtları, bir O Impalement gerektirirİki mikro elektrod ile ocyte. Bu prosedür genellikle bireysel bir oosit içinde sadece bir kez yapılır. Bununla birlikte, oosit için aşikar zarar vermeden bir ilk bütün hücre mevcut kaydın sonra Mikroelektronlar kaldırmak mümkün oldu. Gerçekten de, impalements bölgelerinde de plazma membranı, bir kaç dakika içinde yeniden mühürlemek için görüntülenir. Bu durumda, bir ilk iki-elektrotlu voltaj-kelepçe ölçümü tamamladıktan sonra, bir mikrofüj tüpüne ya da dolu bir 96-yuvalı plakanın bir oyuğuna iki elektrotlu voltaj-kelepçe kurulum deney akış odasından oositin aktarmak mümkündür test veya kontrol solüsyonunun bir küçük hacimli. Daha sonra, aynı oosit akış odasının geri aktarılabilir ve bir ikinci iki-elektrotlu voltaj-kelepçe ölçümü gerçekleştirmek için tekrar kazığa edilebilir. Dikkate değer, ENaC-aracılıklı akımları oosit kontrol çözelti içinde muhafaza edilmiştir, birinci ve ikinci ölçüm arasında çok farklılık yoktu. Bir proteaz içeren bir Sol oositin kontrastı, kuluçkalandırmaİlk ölçümden sonra, ution ikinci ölçümde artan ENaC aracılı akımı (Şekil 2) ile sonuçlanmıştır. Bu bulgu, proteolitik kanal aktivasyonunu gösterir.
Tek bir oosit olarak iki ayrı akım ölçümleri gerçekleştirilmesi oosit test çözeltisi, küçük bir hacim içinde değişken bir zaman süresi için iki ölçüm arasında, proteazlar ya da diğer farmakolojik ajanlar maruz avantajını sunar. Büyük miktarlarda pahalı ve / veya kullanılamaz ajanlar, örneğin saflaştırılmış proteaz preparatlar kullanılırken bu önemlidir. Ajanların sınırlı durumu nedeniyle sürekli dakikada birkaç mililitre debilerde oosit superfusing için gerekli test solüsyonu geniş hacimli imkansız (ya da satın alınacak) sürekli iki elektrot gerilim-kelepçe kayıtları bunları kullanmak için yapabilir. Ayrıca, sürekli iki-elektrotlu voltaj-kelepçe ölçümleri bilinen fenomeni ile sınırlıdırspontan kanal kestirip Bu fenomene de ENaC'nın 15 nitelendirdi. Buna karşılık, bir saat ya da daha fazlasına kadar için iki ayrı ölçümler arasındaki çözüm test etmek için oosit maruz değil genel olarak (bkz, Şekil 4A) bir sorun teşkil etmez. Son olarak, aynı oosit içinde yapılan iki ardışık ölçüm ilaç etkileri eşleştirilmiş gözlemler sağlar. Genellikle iyon kanalı bir ifadesinde, oositler, arasında yüksek değişkenlik sorununu azaltır, çünkü bu, oosit (proteaz ile muamele edilmiş ve araç ile tedavi edilmiş) iki ayrı gruplarından eşleştirilmemiş ölçümleri üzerinde bir avantaja sahiptir. Eşleştirilmiş gözlem ve ilk ölçüm verileri normalleştirmek için olasılığı ile, daha az sayıda oositler bir farmakolojik maddenin önemli bir etki göstermek için deney grubu başına ihtiyaç vardır. Verilerin Normalleştirme da bunun için farklı iyon kanalı ifade seviyeleri ve bu nedenle, farklı taban akımı (Şekil 2D, gametlerin, farklı gruplar verilerini özetleyen kolaylaştırır.) Bu yaklaşım, ilgi konusu iyon kanalı faaliyet (bkz. Şekil 2) ikinci bir ölçüm için birinci araç ile tedavi edilen kontrol oositlerde sabit kalır olduğunu göstermek için Açıkçası, kontrol deneyleri gereklidir.
Mevcut proteolitik aktivasyon, hücre yüzeyinde ürün bölünmeye ENaC'nın görünümü ile karşılıklı ilişki içinde olduğunu göstermek için, biyotinilasyon yaklaşım, ilk Harris et al. 9 kullanılabilir. Bu prosedür, (Protokol bölümünde ayrıntılı olarak ve Şekil 4 'de gösterildiği gibi) ve proteaz ENaC-aracılı aktivasyonu daha sonra akımlarının ayrılması parçalarının zamana bağımlı bir görünüm ile paralel olduğu kanalları bu maruz göstermek için uyarlanmıştır. Biyotinilasyon yöntem de hücre yüzeyinde genel bir artış ya da azalma zar proteinlerinin analizini sağlar. Bu nedenle bu yöntem, proteazlar ve diğer Phar etkisini araştırmak için uygundurplazma zarı içine veya kanal alma üzerine kanal ekleme üzerine macological ajanlar. Ayrıca, biyotinile edilmiş plazma zar proteinlerinin western blot analizi sağlar: protein fragmanları (örneğin, proteolitik ENaC fragmanları) ya da işlevsel olarak ilgili olabilir glikosilasyon deseni değişikliklerin tespiti.
Sonuç olarak, yöntemlerin kombinasyonu ENaC aracılı bütün hücre akımları üzerinde proteazların uyarıcı etkisini araştırmak ve geniş bir uygulama yelpazesi için yararlı olabilir ENaC'nın meydana gelmesi ile bir korelasyon hücre yüzeyinde ürün bölünmeye göstermek için kullanılır. Özel olarak, bu yöntemler, başka iyon kanalları, taşıyıcı ya da zar-ötesi reseptör (örneğin, proteaz tarafından aktive edilen reseptörleri PAR) düzenlemesi ile ilgili olarak benzer soruları için uygun olabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The expert technical assistance of Céline Grüninger, Christina Lang, Sonja Mayer, and Ralf Rinke is gratefully acknowledged. We thank Dr. Morag K. Mansley for carefully reading the manuscript. This project was supported by a grant of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grant SFB 423: Kidney Injury: Pathogenesis and Regenerative Mechanisms, to C. Korbmacher), grants of the Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (to S. Haerteis and M. Krappitz), the ELAN program (to S. Haerteis) of the Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, and the University Library of Erlangen-Nürnberg.
Materials
| Bath Clamp Headstage for OC-725C-V | Warner Instrument Corporation | – | |
| Cold light source – Schott KL 1500 LCD | Schott | #SCOC150200EU | brightness 4; mechanical aperture: D; color temperature: 3000 K |
| E Series Electrode Holder (Str, Vent, Ag Wire, 1.2 mm) | ADinstruments | #ESW-F10v | |
| left micromanipulator; MM-33L | Warner Instrument Corporation | #64-0055 | |
| LIH 1600 – computer interface | HEKA | – | |
| magnetic valve system (ALA BPS-8) in combination with a TIB14 interface (HEKA) | ALA Scientific Instruments, HEKA | – | |
| OC-725C amplifier for two-electrode voltage-clamp recordings | Warner Instrument Corporation | – | |
| P-97 FLAMING/BROWN Micropipette Puller | Sutter Instruments | – | heat=550; velocity=22; time=200 |
| right micromanipulator; MM-33R | Warner Instrument Corporation | #64-0056 | |
| Series Electrode Holder (45°, Vent, Handle, Ag Wire, 1.2 mm) | ADinstruments | #E45w-f10vh | |
| STAT 2 IV Gravity Flow Controller | Conmed | #P-S2V-60 | |
| vacuum generator ejector SEG – for suction to remove bath solution | Schmalz | – | |
| Material | |||
| INFUJECT 60ml pump syringes for solutions | Braun | #22050 | |
| Injekt-F for lysing the oocytes | Braun | #9166033V | |
| standard wall borosilicate tubing with filament | Sutter Instruments | #BF150-86-10 | outside diameter: 1.50 mm; inside diameter: 0.86 mm; length: 10 cm |
| Reagent | |||
| complete, Mini, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche Applied Science | #11836170001 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | #21217 | |
| Horseradish peroxidase-labeled secondary goat anti-rabbit antibody | Santa Cruz Biotechnology | #sc-2004 | |
| NeutrAvidin Agarose | Thermo Scientific | #29200 | Neutravidin-labeled agarose beads |
| NP40 (Nonidet P-40) | Sigma-Aldrich | #I8896 | |
| Roti-Load 1 (2× SDS-PAGE sample buffer) | Carl Roth | #K929.2 | |
| SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate for detection of chemiluminescent signals | Thermo Scientific | #34095 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | #T8787 | |
References
- Kleyman, T. R., Carattino, M. D., Hughey, R. P. ENaC at the cutting edge: regulation of epithelial sodium channels by proteases. The Journal of Biological Chemistry. 284, 20447-20451 (2009).
- Rossier, B. C., Stutts, M. J. Activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by serine proteases. Annu Rev Physiol. 71, 361-379 (2009).
- Poirot, O., Vukicevic, M., Boesch, A., Kellenberger, S. Selective regulation of acid-sensing ion channel 1 by serine proteases. The Journal of Biological Chemistry. 279, 38448-38457 (2004).
- Vukicevic, M., Weder, G., Boillat, A., Boesch, A., Kellenberger, S. Trypsin cleaves acid-sensing ion channel 1a in a domain that is critical for channel gating. The Journal of Biological Chemistry. 281, 714-722 (2006).
- Clark, E. B., Jovov, B., Rooj, A. K., Fuller, C. M., Benos, D. J. Proteolytic cleavage of human acid-sensing ion channel 1 by the serine protease matriptase. The Journal of Biological Chemistry. 285, 27130-27143 (2010).
- Ossovskaya, V. S., Bunnett, N. W. Protease-activated receptors: contribution to physiology and disease. Physiological reviews. 84, 579-621 (2004).
- Garcia-Caballero, A., et al. Activation of the epithelial sodium channel by the metalloprotease meprin β-subunit. Channels (Austin. 5, 14-22 (2011).
- Haerteis, S., et al. Proteolytic activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by the cysteine protease cathepsin-S. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 353-365 (2012).
- Harris, M., Firsov, D., Vuagniaux, G., Stutts, M. J., Rossier, B. C. A novel neutrophil elastase inhibitor prevents elastase activation and surface cleavage of the epithelial sodium channel expressed in Xenopus laevis oocytes. The Journal of Biological Chemistry. 282, 58-64 (2007).
- Passero, C. J., Mueller, G. M., Rondon-Berrios, H., Tofovic, S. P., Hughey, R. P., Kleyman, T. R. Plasmin activates epithelial Na+ channels by cleaving the γ-subunit. The Journal of Biological Chemistry. 283, 36586-36591 (2008).
- Svenningsen, P., et al. Plasmin in nephrotic urine activates the epithelial sodium channel. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 20, 299-310 (2009).
- Patel, A. B., Chao, J., Palmer, L. G. Tissue kallikrein activation of the epithelial Na channel. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 303, (2012).
- Haerteis, S., Krappitz, M., Diakov, A., Krappitz, A., Rauh, R., Korbmacher, C. Plasmin and chymotrypsin have distinct preferences for channel activating cleavage sites in the γ-subunit of the human epithelial sodium channel. The Journal of General Physiology. 140, 375-389 (2012).
- Chraibi, A., Vallet, V., Firsov, D., Hess, S. K., Horisberger, J. D. Protease modulation of the activity of the epithelial sodium channel expressed in Xenopus oocytes. The Journal of General Physiology. 111, 127-138 (1998).
- Volk, T., Konstas, A. A., Bassalay, P., Ehmke, H., Korbmacher, C. Extracellular Na+ removal attenuates rundown of the epithelial Na+-channel (ENaC) by reducing the rate of channel retrieval. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 447, 884-894 (2004).
