JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Демонстрация протеолитических Активация эпителиальных натрия Channel (ENaC) путем объединения текущих измерений с детектором расщепления фрагментов

Published: July 05, 2014
doi:
10.3791/51582
, ,
1Institut für Zelluläre und Molekulare Physiologie,Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU)

Summary

Протеолитические активация эпителиальных натриевых каналов (ENaC) гетерологично, выраженного в Xenopus ооциты Laevis может быть продемонстрирована путем объединения измерений тока с биотинилирования подхода исследовать внешний вид продуктов расщепления ионных каналов в клеточной поверхности. Функционально важных сайты расщепления могут быть идентифицированы с помощью сайт-направленного мутагенеза.

Abstract

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes. In combination with site-directed mutagenesis, this approach provides a powerful tool to identify functionally relevant cleavage sites. Proteolytic activation is a characteristic feature of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel (ENaC). The final activating step involves cleavage of the channel’s γ-subunit in a critical region potentially targeted by several proteases including chymotrypsin and plasmin. To determine the stimulatory effect of these serine proteases on ENaC, the amiloride-sensitive whole-cell current (ΔIami) was measured twice in the same oocyte before and after exposure to the protease using the two-electrode voltage-clamp technique. In parallel to the electrophysiological experiments, a biotinylation approach was used to monitor the appearance of γENaC cleavage fragments at the cell surface. Using the methods described, it was demonstrated that the time course of proteolytic activation of ENaC-mediated whole-cell currents correlates with the appearance of a γENaC cleavage product at the cell surface. These results suggest a causal link between channel cleavage and channel activation. Moreover, they confirm the concept that a cleavage event in γENaC is required as a final step in proteolytic channel activation. The methods described here may well be applicable to address similar questions for other types of ion channels or membrane proteins.

Introduction

Протеазы являются ферменты, которые участвуют в различных физиологических реакций в диапазоне от известного протеолитической деградации белков, в контексте пищеварения, до очень сложных протеазы каскадов, участвующих в сложных путей регулирующий сигнализации. Протеазы подразделяются на семь групп в зависимости от их каталитического активного сайта: аспартат, аспарагин, цистеин, глутаминовую кислоту, металло, серин, треонин и протеазы. Различные целевые протеазы различные сайты расщепления, которые не всегда легко предсказать с первичной структуры белка. База данных Merops ( http://merops.sanger.ac.uk/ ) предоставляет подробную информацию по широкому кругу протеаз и их льготных сайтов расщепления. Функционально соответствующие сайты расщепления могут быть идентифицированы с помощью сайт-направленного мутагенеза.

Хорошо известно, что протеолитический обработка ENaC является важным механизмом активации гоОсобый 1,2 ионный канал. Интересно, что есть доказательства того, что функция связанной кислоты зондирования ионных каналов 1а (ASIC1a) также может быть изменена протеаз 3-5. В настоящее время остается открытым вопрос, играет ли расщепление протеолитический канал соответствующую физиологическую роль в регуляции активности других ионных каналов или перевозчиков. Однако хорошо известно, что протеолитическое расщепление активирует группу G-белком рецепторов, протеазы активированные рецепторов (PARS) 6. Несколько сериновые протеазы (например, для канала активации протеаз (CAP1-3), химотрипсин, трипсин, фурин, плазмин, эластазы нейтрофилов и калликреин), как было показано протеолитически активировать ENaC 2. В дополнение к сериновых протеаз, других групп протеаз могут быть вовлечены в протеолитической активации ENaC. Действительно, недавние данные показывают, что металлопротеиназы meprin-β 7 и цистеин-протеазы катепсина S-8 также может активацииТе ENaC. Тем не менее, (пато-) физиологически соответствующие протеазы для ENaC активации еще предстоит определить и могут отличаться от ткани к ткани.

Протеазы, как известно, преимущественно расщепляют на конкретных участках в аминокислотной последовательности. Например, серин протеаза химотрипсин показан конкретный шаблон расщепления расщепляющей после ароматический аминокислотных остатков фенилаланина и тирозина. В противоположность этому, сериновой протеазы трипсин расщепляет преимущественно после основных остатков лизина или аргинина. Использование мутантных человеческих γENaC конструкции, сгенерированные с помощью сайт-направленного мутагенеза, функционально соответствующие сайты расщепления в ENaC гетерологично выраженные в системе экспрессии ооцитов могут быть определены 8-13.

Вводя кРНК для трех субъединиц (ENaC αβγ) в изолированных ооцитов, ENaC могут быть функционально выражены в этих клеток и активность каналов, присутствующих на плазматической мембране может быть измеренас помощью метода фиксации двух электродов. При использовании мочегонное амилорид, специфический ингибитор ENAC, в ENaC-опосредованную текущий компонент цельноклеточной амилорид-чувствительных (А ^ ами) может быть отделена от неспецифических токов утечки или от токов, проводимых других ионных каналов. Таким образом, значения А ^ ами отражать общую активность ENaC и может быть определен путем вычитания цельноклеточная токов, измеренных в присутствии амилорид из соответствующих токов целых клеток, записанных в отсутствие амилорид. Чтобы проверить, есть ли у протеазы стимулирующий эффект на ENAC, А ^ ами измеряется дважды в том же ооцита, т.е. до и после инкубации ооцит в раствор, содержащий протеазы. Увеличение А ^ AMI от первого до второго измерения свидетельствует об активации протеолитической ENaC. Химотрипсин или трипсин, как известно, максимально стимулировать ENaC в системе экспрессии ооцитов 2,14 и может быть использован для уверенностью регт, что протеолитический активации ENaC обнаруживается в данной партии ооцитов.

Параллельно с измерениями тока цельноклеточных, биотинилирование подход 9 был использован для расследования ли обнаружены увеличение А ^ ами при воздействии ооцитов в протеаз коррелирует с появлением ENaC расщеплению фрагменты на поверхности клетки. Белки на поверхности клетки помечены биотином и может быть отделена от внутриклеточных белков путем связывания биотинилированных белков, меченных Neutravidin агарозных гранулах. В биотинилированные белки могут быть анализировали при помощи вестерн-блоттинга. γENaC фрагменты расщепления на поверхности клетки могут быть обнаружены с использованием специфического антитела, направленного против эпитопом в С-конце γENaC. Для идентификации функционально соответствующий сайт (ы) расщепления, предсказал сайты расщепления могут быть мутации с использованием сайт-направленного мутагенеза. Дикого типа и мутантные каналы сравнению в параллельных экспериментах с использованием ооцитов от сAme партия.

С этой методологический подход было показано впервые, что протеолитический активации ENaC-опосредованных целых клеток токов коррелирует с зависящим от времени появления ENaC расщепление фрагментов на поверхности клетки. Эти результаты показывают, причинную связь между расщеплением канала и активации канала. Кроме того, с помощью сайт-направленного мутагенеза предполагаемых сайтов расщепления в комбинации с техникой два электрода напряжения зажим, функционально соответствующих сайтов расщепления для плазмина, химотрипсин 13 и катепсина S-8 были идентифицированы.

Protocol

1. Выделение Xenopus ооцитов и микроинъекции кРНК Получить ооцитов от взрослых женщин Xenopus Laevis. Анестезировать животных в 0,2% MS222 и резекцию яичников долей через небольшой разрез брюшной стенки. Изолировать ооцитов из яичников долях путем ферментативного пищеварения при 19 ° С в течение 3-4 ч с 600-700 ед / мл 2 типа коллагеназы из Clostridium histolyticum растворенных в кальция растворе без OR2 (рецепт в таблице 1). Для выбора, поместите defolliculated ооциты в чашку Петри под бинокулярным микроскопом в высокой натрия, содержащего решение (ND96: рецепт в таблице 1). Выберите этап V-VI ооцитов и разместить их в другом чашку Петри с помощью пипетки Пастера. ПРИМЕЧАНИЕ: Блант пипетки Пастера пламенем для предотвращения травм ооцитов. Введите ооциты с кРНК (например, 0,2 нг на αβγENaC подразделения). Растворите CRNAs в РНКазы без воды. ПРИМЕЧАНИЕ: ВсегоОбъем вводят в каждой яйцеклетки составляет 46 NL. Магазин вводили ооцитов при 19 ° С в растворе натрия низкой, чтобы предотвратить загрузку натриевую ооцитов (ND9: рецепт в таблице 1). Дополнение раствор пенициллина 100 ед / мл натрия и 100 мкг / мл стрептомицина сульфата, чтобы предотвратить бактериальный рост. Аккуратно обращайтесь ооциты, чтобы ограничить количество поврежденных или мертвых ооцитов и поддерживать их в отдельных небольших групп в 12-хорошо пластины скважин, заполненных промывочной ванны решение в течение двух дней после кРНК инъекции. 2. Выполнение Двухэлектродная фиксации потенциала эксперименты Измерить ооциты через два дня после инъекции. Наполните одну шприц в самотечных системы перфузии раствором ND96 и другой шприц с раствором ND96 содержащего амилорид (2 мкм). Гора шприцы 50 см выше ооцитов ванны камеры. ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация ингибитора ENaC амилорида был выбран, чтобы быть в 20 раз выше, чем его IC 50 </суб> (100 нМ). Поверните на 150 Вт галогенные источника холодного света и настроить его на 10 см выше ооцитов ванны камеры, позволяющей хорошую видимость с бинокулярного микроскопа. Затем повернуть на всасывании и регулировки всасывающей трубки на конце ооцита ванны камеры. Найдите Шнорхель напротив суперфузии трубки 'адаптер ввода ооцитов ванну. ПРИМЕЧАНИЕ: Мощность всасывания должна быть достаточной, чтобы поддержать непрерывный поток раствора superfusing яйцеклетки. Регулировка скорости суперфузии каждого решения до 3-5 мл / мин с помощью управления потоком IV тяжести устройства. Подключите суперфузии трубки с адаптером к ооцитов ванны камеры. Потяните стеклянные капилляры с микропипетки съемник для получения диаметры оконечности <1 мкм. Затем заполните капилляры до ~ 1/4 с 3 М KCl. ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что хлорированная часть серебряной проволоки из держателя электрода погружают в раствор хлорида калия. Проверка на воздушных пузырьков в кончике капилляра. Пузырьки воздуха ухудшают measuдежного измерения за счет увеличения сопротивления паразитной емкости. Вставьте капилляры в электродные держателей текущий и электродом напряжения и поместить их в ND96 содержащий амилорид (2 мкМ) в растворе с использованием микро-манипуляторов. 3. Измерение Амилорид чувствительных цельноклеточная токов Нулевой потенциал электрода электрода напряжения (V м) и текущего электрода (V е), регулируя V м и V е смещение кнопок ПРИМЕЧАНИЕ:. Сопротивление должно быть 1-2 МОм для электрода для измерения V м и 0,5 -1 МОм для текущего электрода инъекции. Поместите ооцит в ванну камеру в непосредственной близости от чувствительного электрода напряжение. ПРИМЕЧАНИЕ: Не повредить яйцеклетку во время любого из этих стадиях процесса. Используйте пипетки Пастера перенести яйцеклетки. Во избежание повреждения яйцеклетки края пипетки следует притупляются пламенем. Прокалывание ооциты осторожно обеими микроэлектродов. Установите удерживающий потенциал в усилителе до -60 мВ и включите самописца. Включите амилорид (2 мкМ), содержащей раствор. ПРИМЕЧАНИЕ: ток должен быть около 0 ± 0,5 мкА. Большие токи утечки указывают вытекающей сажание на кол. Таким образом, эти ооциты должны быть отклонены. Кроме того, токи утечки, измеренные в присутствии амилорид (2 мкМ) должны быть одинаковыми по αβγ-WT выражения ооцитов к измеренным в αβγ-мутант ENaC выражения ооциты. Это указывает на то, что мутации не влияют на амилориду чувствительность канала. Начало записи. При необходимости регулировки усиления. После измеряемый ток достигнет стабильного плато, изменить, чтобы амилорида без решения. Примечание: Нисходящий ток отклонения в текущих следов соответствуют внутрь токов, т.е. движением положительного заряда (Na +) из внеклеточной части в клетку. Мтер тока плато достигается (после ~ 60 сек), переключите суперфузии обратно в амилорида содержащий решения. После того, как ток яйцеклетки достигает начальный базовый ток, выключите зажим напряжения и аккуратно снять электроды. Чтобы разрешить восковые колпачки с точными плазматической мембраны в местах сажание на кол, поместите яйцеклетки в одну лунку 96-луночного планшета, содержащего 100-150 мкл протеазы бесплатно решения ND96. Через 5 мин к передаче ооцит протеазы, содержащей раствор или с контрольным раствором без протеазы в течение 30 мин инкубационного периода. ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации зависит от протеазы и изучаемого канала. После стадию инкубации повторить измерения тока (см. п. 3.2 и далее). ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно измерить> 90% ооцитов после инкубации в раствор протеазы. 4. Биотинилирование Анализ Выберите и отбросить дефектных яйцеклеток под бинокулярным микроскопом. ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте инъецироватьред ооцитов из одной партии для измерения тока и для биотинилирования экспериментов. Держите биотин при комнатной температуре в течение не менее 20 мин до его использования в эксперименте. Подготовка решения: ND96 и ND96 содержащий соответствующий протеазы. Подготовка Пипетки Пастера, присваивая им метки и кратко пылающий их советы, чтобы избежать травм ооцитов. Примечание: Здесь, протеаза химотрипсин 2 мкг / мл в ND96 используется. Лечить каждую группу с отдельной пипетки, чтобы избежать перекрестного загрязнения решений. Заполните каждую лунку 6-луночный планшет с 2,5 мл контроля ND96 или ND96 содержащей протеазу при комнатной температуре. Затем на хранение 30 ооцитов на лунку и инкубировали их в течение 30 мин при комнатной температуре. Примечание: В последующих процедур важно сохранить образцы на льду в любое время. Все стадии центрифугирования которые в проводили при 4 ° С. Заполните каждую лунку новой пластинки 6-а с 2,5 мл ND96 (каждая группа нуждается в 3 скважины для этапов промывки) и взвесить биотин. ПРИМЕЧАНИЕ: 2,5 мг биотин рER хорошо (1 мг / мл) не требуется. Растворить биотин в буфере биотинилирования (т.е. 25 мг биотина (10 групп) в 25 мл биотинилирования буфера (рецептов в таблице 1). Трансфер каждую группу ооцитов в хорошо наполнен 2,5 мл ND96. Передача ооцитов последовательно в двух дополнительных скважин с ND96 смыть оставшийся протеазы. Инкубируйте ооцитов в течение 5 мин в ND96. Передача ооциты в лунку, содержащую 2,5 мл раствора биотина и инкубировать их при осторожном перемешивании ("шейкер") в течение 15 мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Свернуть переданного ND96 с пипетки, чтобы избежать разбавления раствора биотина. Передача каждую группу ооцитов в лунку, содержащую 2,5 мл буфера быстрого охлаждения (рецептов в Таблице 1), чтобы остановить реакцию биотинилирования. Затем перенесите каждую группу ооцитов во вторую, содержащей также 2.5 мл буфера гашения и инкубировать в течение 5 мин при осторожном перемешивании. Удалить поврежденные или мертвые ооцитов. ПРИМЕЧАНИЕ:Выберите такое же количество ооцитов на группу для следующей процедуры. Передача каждую группу ооцитов к 1,5 мл пластиковую пробирку микроцентрифужных. ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизировать количество охлаждающей буфер, который передается. Впоследствии лизировать ооциты, пропуская их через иглу 27 G в 1 мл лизирующего буфера (рецепт см. таблицу 1) с добавлением ингибиторов протеазы. Центрифуга лизатов течение 10 мин при 1500 х г. Аспирируйте супернатант и перенести его на 1,5 мл микроцентрифужных пробирку, содержащую 0,5% Triton-X-100 и 0,5% NP40. Откажитесь от оставшегося осадка. ПРИМЕЧАНИЕ: Верхний слой содержит биотинилированное плазменные мембранные белки и небиотинилированного внутриклеточные белки. Инкубируйте микроцентрифужных пробирок в течение 20 мин на льду. Неоднократно вихрь трубы в этот период до полного растворения белков в NP40 и Тритон-Х-100. Центрифуга 100 мкл агарозы в ооцитов группы течение 3 мин при 1500 х г. После того, какцентрифугирования удалить супернатант из раствора бисером и мыть три раза буфером для лизиса, чтобы уравновесить шарики с буфером. Пипетка 100 мкл промытых шариков в каждой микроцентрифужных пробирку, содержащую белок-моюще-раствор, приготовленный в 4,13 разрешить связывание биотинилированных белков с гранулами. Выдержите микроцентрифужных пробирок с верхним вращения O / N при 4 ° С. Центрифуга микроцентрифужных пробирок для 3 мин при 1500 х г. Затем трансфер супернатант в новую пробирку. ПРИМЕЧАНИЕ: внутриклеточных белков не помечены биотином. Супернатант можно хранить при температуре -20 ° С. Не аспирации бусинки. 5. Обнаружение ENaC Расщепление фрагментов на клеточной поверхности методом Вестерн-блоттинга Промыть Шарики три раза буфером для лизиса и добавить 100 мкл 2х SDS-PAGE образца буфера. Примечание: Образцы могут храниться при -20 ° С или сразу же готов к Вестерн-блоттинга. Варить сные примеры течение 5 мин при 95 ° С, а затем поместить труб на льду. Центрифуга образцов течение 3 мин при 20000 х г и пипетки супернатант в новую пробирку микроцентрифужных. Примечание: Этот супернатант содержит биотинилированных белков плазматической мембраны из клеточной поверхности ооцита. Анализ 30 мкл этого супернатанта методом вестерн-блоттинга, чтобы исследовать фрагменты расщепления на поверхности клетки. Отдельные биотинилированных белков в ПААГ-ДСН (сульфат электрофореза в полиакриламидном геле додецилсульфатом натрия) с использованием соответствующего гель (8%, 10%, 12% в зависимости от молекулярной массы фрагментов расщепления исследованных). Передача белки поливинилидендифторидную (PVDF) мембранах с помощью полусухого блоттинга. Зонд мембрану с конкретным антителом против человеческого γENaC, направленной против эпитопа в С-конце (см. фиг.3 и 13). Использование пероксидазой хрена помечены козьего анти-кроличьего антитела анти качестве вторичноготело. Обнаружение хемилюминесцентные сигналы.

Representative Results

Для исследования, может ли серинпротеазой плазмин, включите ENaC-опосредованных токи, А ^ ами отдельных ENaC экспрессирующих ооцитов была определена до и после 30 мин инкубации ооцитов в протеазы без (контроль) (рис. 2А) или плазмин, содержащий раствор (рис. 2B), используя двухэлектродной метода фиксации (см. рисунок 1). Воздействие плазмин увеличился А ^ ами в каждом яйцеклетки измерить. В противоположность этому, в контрольных опытах, 30 мин инкубации экспрессирующих ENaC ооцитов у протеазы раствора без имел незначительный эффект (фиг. 2, г). Таким образом, с помощью этого метода стимуляции ENaC-опосредованной тока плазмином могут быть обнаружены. Для изучения влияния мутации предполагаемые сайты расщепления при активации ENaC-опосредованных токов, а также при расщеплении канала, эффект химотрипсина на WT-ENaC сравнивали с помутант ENaC с мутантным prostasin и сайтов расщепления плазмина (γ RKRK178AAAA; K189A). Временной ход активации канала по химотрипсина, а также появления ENaC продукты расщепления на клеточной поверхности была исследована с помощью различных раз протеазы инкубации (рис. 4а). Было показано, что мутантные задержки канала и уменьшает активацию ENaC-опосредованной тока химотрипсина. Это идет параллельно с задержкой появления более низкую молекулярную массу γENaC расщепления фрагмента 67 кДа, соответствующей полностью расщепленной субъединицы. Расщепления фрагменты были обнаружены с использованием антитела, направленного против γENaC эпитопом в С-конце (рис. 3). Этот методологический подход демонстрирует, что время, конечно протеолитической активации ENaC-опосредованных токов коррелирует с появлением продукта расщепления 67 кДа γENaC на клеточной поверхности (рис. 4 В, С). Это поддерживает концепциюпричинно-следственная связь между расщеплением протеолитический канала и активации 13 канала. Кроме того, путем объединения измерений тока и обнаружение γENaC фрагментов на поверхности клеток было показано, что мутантные сайты расщепления функционально отношение к активации протеолитического канала. Рисунок 1. Процедура определения стимулирующее действие протеазы по ENaC гетерологично, выраженного в Xenopus ооциты Laevis. ENaC активность оценивали путем измерения компонент цельноклеточной амилорид-чувствительный ток А ^ AMI. Рисунок 2. Плазмин стимулирует ENaC-опосредованных Currenц ооцитов, выражающих ENaC. (AD) ооциты, экспрессирующие человеческий ENaC инкубировали в течение 30 мин в протеазы, свободной от раствора (контроль) или в растворе, содержащем плазмин (10 мкг / мл). Для определения А ^ ами до (-) и после (+) инкубации ооциты были зажаты на проведения потенциал -60 мВ (A, B) четыре репрезентативных текущие следы целых клеток из одной партии ооцитов.. Амилорид (ами) присутствует в растворе ванны, чтобы специфически ингибируют ENaC, как показано черными полосками. (C) точек данных, полученных от отдельного ооцита соединены линией. (D) Резюме аналогичных экспериментах, как показано на C. столбцов представляют относительная стимулирующий эффект на А ^ ами рассчитывается как отношение А ^ ами, измеренной после минутной инкубации 30 (А ^ ами 30 мин) к исходному А ^ ами (А ^ ами начальной), измеренные до инкубации. Числа внутри колонн указываютколичество отдельных ооцитах измерить. N обозначает количество различных партий ооцитов. (Эта цифра была изменена с [Haerteis др. 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, DOI:. 10.1085/jgp.201110763]) Рисунок 3. Модель из субъединиц, показывающий сайтов расщепления γENaC для активации протеолитической и сайт связывания антитела использовали. Протеолитическое расщепление в Гольджи-ассоциированного конвертазы фурина важно для созревания ENaC в пути биосинтеза перед канал достигает плазматической мембране. После расщепления по Furin в 76 кДа фрагмент может быть обнаружен на клеточной поверхности с использованием подход биотинилирования и антитело против эпитопа в С-конца γ-субъединицы. Ключевая последний шаг в протеолитической ENа-С активации, вероятно, происходит на плазматической мембране, где γENaC расщепляется внеклеточных протеаз (например плазмина или химотрипсин) в области дистальнее сайте Furin в результате фрагмента расщепления 67 кДа. (Эта цифра была изменена с [Haerteis др. 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, DOI:. 10.1085/jgp.201110763]) Рисунок 4:. Mutating как плазмин (K189) и сайт расщепления prostasin (RKRK178) задерживает запуск ENaC-опосредованных токов и внешний вид продукта расщепления 67 кДа из γ-субъединицы канала Ооциты выражая WT (светлые символы) и γ RKRK178AAAA; инкубировали K189A ENaC мутант канал (закрытые символы) в течение 30 мин в протеазы, свободной от раствора (контроль) или в течение 5, 30, или 60 мин в растворе, содержащем химотрипсин (2 мкг / мл). (A) Чтобы определить, А ^ ами до и после инкубации ооциты были зажаты на проведения потенциал -60 мВ. Круги представляют отношение А ^ ами, измеренный после 5, 30 или 60 мин инкубации (А ^ ами мин) в исходное А ^ ами (А ^ ами начальной), измеренный до инкубации. Каждая точка данных представляет среднюю А ^ ами измеренную в 22-24 отдельных ооцитах четырех различных партий. (BD) Параллельно с обнаружением А ^ AMI, выражение биотинилированного γENaC на поверхности клетки анализировали с помощью SDS-PAGE. γENaC был обнаружен с антителом против эпитопа в С-концом человеческого γENaC. Типичные Вестерн-блоты из одной партии ооцитов показаны. (CE) Денситометрический анализ трех западных пятнами аналогичных тем, которые показаны на B или D. Для каждой дорожке, то сignals обнаруженные в регионах 76 кДа (открытых столбцов) и 67 кДа (серые столбики) были определены и нормированы на суммы общего обнаруженного сигнала. N обозначает количество различных партий ооцитов. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Discussion

В этой рукописи методологический подход, который был успешно применен для изучения механизмов, лежащих в основе активации ENaC протеазами описывается 8,13. Хорошо известно Xenopus Laevis система экспрессии ооцитов был использован для функционально экспресс ENaC. Функция ENaC оценивали с обычным двухэлектродной метода фиксации. Сайт-направленный мутагенез был использован для идентификации функционально соответствующие сайты расщепления протеазой. Биотинилирования эксперименты, проведенные параллельно с электрофизиологических измерений стало возможным соотнести появление ENaC продукты расщепления на поверхности клетки с протеолитической активации тока. Корреляция между временем ходе текущей активации и появлением протеолитических фрагментов расщепления на клеточной поверхности поддерживает концепцию активации протеолитической канала.

Двухэлектродная напряжения зажим записи требуют сажание на кол уплотнительногоocyte с двумя микроэлектродов. Эта процедура обычно выполняется только один раз в индивидуальном яйцеклетки. Тем не менее, это было возможно, чтобы удалить микроэлектродов после первоначального текущей записи целых клеток без видимых повреждений яйцеклетки. Действительно, плазматической мембраны в местах impalements по-видимому, запечатать в течение нескольких минут. Таким образом, после завершения первого из двух электродов измерения напряжения зажим, можно передать ооцит с экспериментальной потока камере установки напряжения зажима двух электродов к пробирке или лунке 96-луночного планшета, заполненной небольшой объем тестируемого или контрольного раствора. Затем, то же самое ооцитов могут быть переданы обратно в проточную камеру и может быть приколот снова провести повторный двухэлектродной измерение напряжения зажим. Примечательно, что ENaC-опосредованные токи не сильно различаются между первым и вторым измерением, когда ооцит выдерживали в растворе управления. В противоположность этому, инкубации ооцит в протеаз, содержащий зольution после первого измерения привело к увеличению ENaC-опосредованной тока во втором измерении (рис. 2). Эта находка свидетельствует об активации протеолитической канала.

Выполнение двух отдельных измерений тока в одном ооцит имеет то преимущество, что ооцит может подвергаться воздействию протеаз или других фармакологических агентов между двумя измерений для переменной длины времени в небольшом объеме тестируемого раствора. Это очень важно при использовании средств, которые являются дорогостоящими и / или недоступны в больших количествах, например очищенных препаратов протеазы. Ограниченная доступность агентов может сделать невозможным (или слишком дорогими), чтобы использовать их в непрерывных двухэлектродных фиксации потенциала записей из-за больших объемов исследуемого раствора, необходимого для постоянно superfusing ооциты с расходом нескольких миллилитров в минуту. Кроме того, непрерывные Двухэлектродная измерения напряжения зажим ограничены хорошо известным явленийEnon спонтанного изношенном канала также описано для ENaC 15. Напротив, выставляя ооцитов для тестирования решения между двумя отдельными измерениями до часа или больше обычно не представляет проблемы (см. рисунок 4А). Наконец, два последовательных измерений, выполненных в том же яйцеклетки позволяют парные наблюдения эффектов препарата. Это имеет преимущество перед непарных измерений от двух отдельных групп ооцитов (протеазы обращению и автомобиль обращению), потому что это уменьшает проблему высокой изменчивости между ооцитов, обычно наблюдаемых в выражении ионных каналов. С парных наблюдений, а также возможность для нормализации данных в первом измерении, меньше ооциты необходимы в экспериментальной группе, чтобы продемонстрировать значительное влияние фармакологического агента. Нормализация данных также позволяет легко обобщить данные из разных партий ооцитов с различным уровнем экспрессии ионных каналов и, следовательно, различных исходных токов (рис. 2D). Очевидно, контрольные эксперименты необходимы для такой подход, чтобы продемонстрировать, что ионный канал активность интерес остается стабильным в обработанных носителем ооцитов управления от первого до второго измерения (см. рисунок 2).

Чтобы продемонстрировать, что протеолитический активации тока коррелирует с появлением ENaC продукты расщепления на клеточной поверхности, биотинилирование подход первоначально описано Harris и соавт. 9 могут быть использованы. Эта процедура (как указано в разделе протокола и показано на рисунке 4) был адаптирован для демонстрации, что воздействие каналов к протеаз и последующей активации ENaC-опосредованных токов параллельно с нестационарной появления фрагментов расщепления. Метод биотинилирование также позволяет проводить анализ общего увеличения или уменьшения мембранных белков на поверхности клеток. Таким образом, этот метод подходит для изучения влияния протеаз и других фармацевmacological агенты при введении канала в плазменной мембране или при извлечении канала. Более того, вестерн-блот анализ биотинилированных белков плазматической мембраны позволяет обнаружение фрагментов белков (например, протеолитические фрагменты ENaC) или изменений в структуре гликозилирования, которые могут быть функционально уместным.

В заключение, сочетание методов исследовано стимулирующее действие протеаз на ENaC-опосредованных целых клеток токов и продемонстрировать корреляция с возникновением ENaC продукты расщепления на клеточной поверхности могут быть полезны для широкого круга применений. В частности, эти методы могут быть пригодны для решения подобные вопросы, связанные с регулированием других ионных каналов, транспортеров или трансмембранных рецепторов (например, протеазы активированных рецепторов PARS).

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The expert technical assistance of Céline Grüninger, Christina Lang, Sonja Mayer, and Ralf Rinke is gratefully acknowledged. We thank Dr. Morag K. Mansley for carefully reading the manuscript. This project was supported by a grant of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Grant SFB 423: Kidney Injury: Pathogenesis and Regenerative Mechanisms, to C. Korbmacher), grants of the Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (to S. Haerteis and M. Krappitz), the ELAN program (to S. Haerteis) of the Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, and the University Library of Erlangen-Nürnberg.

Materials

Bath Clamp Headstage for OC-725C-V Warner Instrument Corporation –
Cold light source – Schott KL 1500 LCD  Schott  #SCOC150200EU brightness 4; mechanical aperture: D; color temperature: 3000 K
E Series Electrode Holder (Str, Vent, Ag Wire, 1.2 mm) ADinstruments #ESW-F10v
left micromanipulator; MM-33L Warner Instrument Corporation #64-0055
LIH 1600 – computer interface HEKA –
magnetic valve system (ALA BPS-8) in combination with a TIB14 interface (HEKA) ALA Scientific Instruments, HEKA –
OC-725C amplifier for two-electrode voltage-clamp recordings Warner Instrument Corporation –
P-97 FLAMING/BROWN Micropipette Puller Sutter Instruments – heat=550; velocity=22; time=200 
right micromanipulator; MM-33R Warner Instrument Corporation #64-0056
Series Electrode Holder (45°, Vent, Handle, Ag Wire, 1.2 mm) ADinstruments #E45w-f10vh 
STAT 2 IV Gravity Flow Controller Conmed #P-S2V-60
vacuum generator ejector SEG – for suction to remove bath solution Schmalz –
Material
INFUJECT 60ml pump syringes for solutions Braun #22050
Injekt-F for lysing the oocytes Braun #9166033V
standard wall borosilicate tubing with filament  Sutter Instruments #BF150-86-10 outside diameter: 1.50 mm; inside diameter: 0.86 mm; length: 10 cm
Reagent
complete, Mini, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche Applied Science #11836170001
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin Thermo Scientific #21217
Horseradish peroxidase-labeled secondary goat anti-rabbit antibody  Santa Cruz Biotechnology #sc-2004
NeutrAvidin Agarose Thermo Scientific #29200 Neutravidin-labeled agarose beads
NP40 (Nonidet P-40) Sigma-Aldrich #I8896
Roti-Load 1 (2× SDS-PAGE sample buffer) Carl Roth #K929.2
SuperSignal West Femto Chemiluminescent Substrate for detection of chemiluminescent signals  Thermo Scientific #34095
Triton-X-100 Sigma-Aldrich #T8787
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kleyman, T. R., Carattino, M. D., Hughey, R. P. ENaC at the cutting edge: regulation of epithelial sodium channels by proteases. The Journal of Biological Chemistry. 284, 20447-20451 (2009).
  2. Rossier, B. C., Stutts, M. J. Activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by serine proteases. Annu Rev Physiol. 71, 361-379 (2009).
  3. Poirot, O., Vukicevic, M., Boesch, A., Kellenberger, S. Selective regulation of acid-sensing ion channel 1 by serine proteases. The Journal of Biological Chemistry. 279, 38448-38457 (2004).
  4. Vukicevic, M., Weder, G., Boillat, A., Boesch, A., Kellenberger, S. Trypsin cleaves acid-sensing ion channel 1a in a domain that is critical for channel gating. The Journal of Biological Chemistry. 281, 714-722 (2006).
  5. Clark, E. B., Jovov, B., Rooj, A. K., Fuller, C. M., Benos, D. J. Proteolytic cleavage of human acid-sensing ion channel 1 by the serine protease matriptase. The Journal of Biological Chemistry. 285, 27130-27143 (2010).
  6. Ossovskaya, V. S., Bunnett, N. W. Protease-activated receptors: contribution to physiology and disease. Physiological reviews. 84, 579-621 (2004).
  7. Garcia-Caballero, A., et al. Activation of the epithelial sodium channel by the metalloprotease meprin β-subunit. Channels (Austin. 5, 14-22 (2011).
  8. Haerteis, S., et al. Proteolytic activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by the cysteine protease cathepsin-S. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 353-365 (2012).
  9. Harris, M., Firsov, D., Vuagniaux, G., Stutts, M. J., Rossier, B. C. A novel neutrophil elastase inhibitor prevents elastase activation and surface cleavage of the epithelial sodium channel expressed in Xenopus laevis oocytes. The Journal of Biological Chemistry. 282, 58-64 (2007).
  10. Passero, C. J., Mueller, G. M., Rondon-Berrios, H., Tofovic, S. P., Hughey, R. P., Kleyman, T. R. Plasmin activates epithelial Na+ channels by cleaving the γ-subunit. The Journal of Biological Chemistry. 283, 36586-36591 (2008).
  11. Svenningsen, P., et al. Plasmin in nephrotic urine activates the epithelial sodium channel. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 20, 299-310 (2009).
  12. Patel, A. B., Chao, J., Palmer, L. G. Tissue kallikrein activation of the epithelial Na channel. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 303, (2012).
  13. Haerteis, S., Krappitz, M., Diakov, A., Krappitz, A., Rauh, R., Korbmacher, C. Plasmin and chymotrypsin have distinct preferences for channel activating cleavage sites in the γ-subunit of the human epithelial sodium channel. The Journal of General Physiology. 140, 375-389 (2012).
  14. Chraibi, A., Vallet, V., Firsov, D., Hess, S. K., Horisberger, J. D. Protease modulation of the activity of the epithelial sodium channel expressed in Xenopus oocytes. The Journal of General Physiology. 111, 127-138 (1998).
  15. Volk, T., Konstas, A. A., Bassalay, P., Ehmke, H., Korbmacher, C. Extracellular Na+ removal attenuates rundown of the epithelial Na+-channel (ENaC) by reducing the rate of channel retrieval. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 447, 884-894 (2004).

Tags

Proteolytic ActivationEpithelial Sodium Channel (ENaC)Two-electrode Voltage-clampAmiloride-sensitive CurrentProteolytic CleavageBiotinylationGamma-ENaC Fragment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Krappitz, M., Korbmacher, C., Haerteis, S. Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments. J. Vis. Exp. (89), e51582, doi:10.3791/51582 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image