誘導された神経細胞への成人の脳の周皮細胞由来細胞の系統の再プログラミング
Summary
直接の系譜 – 再プログラミングのための脳常駐細胞を標的とすることは、脳の修復のための新たな視点を提供しています。ここでは、成人の大脳皮質から脳常駐周皮細胞について濃縮文化を準備し、転写因子Sox2のとASCL1のレトロウイルス媒介発現によって誘導神経細胞にこれらを変換する方法のプロトコルについて説明します。
Abstract
誘導された神経細胞（INS）への非神経細胞の直接系譜再プログラミングは、神経発生の基礎となる分子メカニズムへの洞察を提供し、in vitroでのモデル化や病気の脳を修復するための新たな戦略を可能にすることができる。 INSへの直接変換の影響を受けやすい脳常駐非神経細胞型、 すなわち損傷した脳組織の中に、 その場でこのようなアプローチを起動可能にするかもしれません識別する。ここでは、この前提を満たすヒト成人脳由来の細胞を同定する試みで開発されたプロトコルを記述します。このプロトコルは、含まれます。成人の脳生検から得た大脳皮質からのヒト細胞の（1）を培養し; （2）in vitroでの拡大（約2〜4週間を要する）と、免疫細胞による文化の特性評価およびフローサイトメトリー; （3）（FACS）を蛍光活性化細胞ソーティングによる濃縮を、抗PDGF受容体-βおよび抗CD146抗体を用いた;（4）神経原性転写因子SOX2とASCL1とレトロウイルス媒介形質導入を。 （5）、最後に免疫細胞化学（レトロウイルス形質導入後8週間〜14日間）による結果の周皮細胞由来の誘発性神経細胞（PdiNs）の特徴付けを。この段階では、INSは、パッチクランプ記録により、その電気的特性のためにプローブすることができる。このプロトコルは、機能的なヒトINSに脳常駐周皮細胞のin vitro系統の変換のため、再現性の高い手順を説明します。
Introduction
次に、分化能の過多に恵まれている人工多能性幹細胞（iPS細胞）中に体細胞の再プログラミングとは対照的に、直接再プログラミングは、他に一つの特定の細胞型の直変換を目指す。疾患モデリングおよび電位細胞ベースの治療の文脈におけるそれらの適用に関しては、両方の再プログラミングのアプローチは、特定の利点及び欠点を有する。 iPS細胞に再プログラミング（i）は、細胞の事実上無限の源を提供する; （II）遺伝子工学を可能にし; （III）は、ほぼ無限の分化能を賦与。これらの細胞は細胞ベースの治療のために使用される場合は、iPS細胞の主要な欠点は、未分化細胞（ インビボでのテラトーマ形成）の腫瘍形成性および ex vivo培養およびその後の移植の必要性の危険性を伴う。逆に、直接の系譜再プログラミングは、所望の細胞の低収量によって制限されている出発集団の標的とされた細胞の数と直接相関するが、系統再プログラムされた細胞は、移植の1,2に何ら腫瘍形成のリスクを示さないように見える利点を有している。さらに、直接の再プログラミングにも従って、移植の必要性を回避する、 すなわち、これらの細胞が必要とされる器官内の、 その場で達成することができる。
これを念頭において、私たちの研究室では、神経変性疾患の細胞ベースの治療に向けた新たなアプローチとして、INSに、系統再プログラミング脳常駐細胞の可能性を追求してきた。脳常駐系統再プログラミングのための細胞標的は大膠細胞（アストロサイト、NG2細胞およびオリゴデンドロサイト）の異なるタイプを含むように、潜在的に考慮することができる細胞、小膠細胞、および微小血管に関連する細胞（内皮細胞および周皮細胞）。私たちは、脳CORのアストログリアのin vitro再プログラミングの可能性を徹底的に研究している生後初期のマウス3-5の TEX。成人の脳内での直接の系統再プログラミングについても同様に適切な細胞源を求めて、我々が正常にインと周皮細胞の展示ホールマークに再プログラムすることができる細胞集団を検出しました。ここでは、拡張し、in vitroでこれらの細胞を豊かにし、最終的に成功してに（25から30パーセントの範囲）これらのin vitro増殖した細胞のかなりの割合を再プログラムするために、成人の脳生検から、これらの細胞を採取する方法のプロトコルを記述INS。再プログラミングは、2つの転写因子、およびSOX2 ASCL1の同時レトロウイルス媒介性の同時発現によって達成することができる。これらPdiNs、反復活動電位発火の能力を獲得するためにニューラルネットワークへの統合の彼らの能力を示す他のニューロンのためのシナプス標的として役立つことが分かった。我々のプロトコルは、INSに成人のヒト脳ペリサイトを単離および系統変換のための簡単な手順を説明します。 </P>
Protocol
Representative Results
Discussion
この議定書は、成人の大脳皮質からの分離と神経性転写因子Sox2のとASCL1のレトロウイルス媒介発現によるINSへのその後の変換次の周皮由来細胞のin vitroでの拡大と充実を説明しています。このようなプロトコルは、最終的には成人の脳のin vivoの設定に、この直接変換方式を変換する念頭に置いて目標に、神経細胞に脳常駐細胞の系譜変換を研究し、潜在的にグリアするin vitro<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、このプロトコルの開発中に、彼女の入力のための博士マグダレナゲッツに感謝しています。我々は寛大にSOX2コード配列を我々に提供するために博士マリウスWernig（スタンフォード大学）に感謝。また、ウイルス産生のための博士アレクサンドラLepierに非常に感謝しています。この作品は、ドイツ学術振興（4182/2-2 BE）とBMBF（01GN1009A）BBに、科学のバイエルン州立省、研究、MKとBBCSへの芸術が二国SYSTHER-から資金提供を受けたの補助金によって支えられてINREMOS仮想研究所（ドイツ語、スロベニア語、連邦教育研究省）およびDFG（SFB 824）。
Materials
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1×; Invitrogen, cat. no. 14190) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | ######### | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
References
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
- Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
- Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
- Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
- Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
- Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
- Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
- Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
- Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
- Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).
