Kaynaklı Nöronlar içine Yetişkin İnsan Beyninin perisit türetilmiş Hücreler Lineage yeniden programlama
Summary
Doğrudan soy-yeniden programlama için beyin-yerleşik hücreleri hedef beyin onarımı için yeni perspektifler sunuyor. Burada yetişkin insan serebral korteks beyin-yerleşik perisitlerden için zenginleştirilmiş kültürleri hazırlamak ve Sox2 ve Ascl1 faktörleri transkripsiyon retrovirüs aracılı ifade tarafından uyarılan nöronların bu dönüştürmek için nasıl bir protokol açıklar.
Abstract
Uyarılan nöronların (INS) içine non-nöronal hücrelerin doğrudan soy-yeniden programlama nörogenezi altında yatan moleküler mekanizmaları içgörü sağlamak ve in vitro modelleme veya hastalıklı beyin tamiri için yeni stratejiler etkinleştirebilirsiniz. Ins içine doğrudan dönüşüm için müsait belirlenmesi beyin-yerleşik olmayan nöronal hücre tipleri hasarlı beyin dokusu içinde, yani yerinde böyle bir yaklaşımı başlatılması için izin verebilir. İşte bu öncül yerine yetişkin insan beyninden türetilen hücrelerin teşhis etmek için bir girişimde gelişmiş bir protokol açıklar. Bu protokol şunları içerir:, yetişkin insan beyin biyopsileri elde serebral korteks, insan hücreleri (1) kültürlenmesini; (2) in vitro (yaklaşık 2-4 hafta gerektiren) genleşme ve immunositokimya ile kültür karakterizasyonu ve akış sitometrisi; (3) anti-PDGF reseptörü β-ve anti-CD146 antikorları kullanılarak (FACS) floresan-aktive edilmiş hücre ile zenginleştirme;(4), nörojenik transkripsiyonuna retrovirüs aracılı iletim ve Sox2 ascl1 faktörleri; (5) ve son olarak, bağışıklık kimyası edilen perisit türetilmiş kaynaklı nöron (PdiNs) 'nin karakterizasyonu (8 hafta için 14 gün retroviral iletimini sonra). Bu aşamada, ins yama kelepçe kayıt kendi elektriksel özellikleri için tanınacak. Bu protokol, fonksiyonel insan ins içine beyin yerleşik perisitler in vitro soy dönüşüm için son derece tekrarlanabilir prosedürü sağlar.
Introduction
Da farklılaşma potansiyel bir bolluk ile donatılmış bulunmaktadır uyarılmış pluripotent kök hücreleri içine somatik hücreler (iPSCs), yeniden programlamayı aksine, doğrudan yeniden programlama başka içine belirli bir hücre tipi düz dönüşüm için amaçlanmıştır. Hastalık modelleme ve potansiyel hücre bazlı terapiler bağlamında kendi uygulama ile ilgili olarak, her ikisi de yeniden programlama yaklaşımlar belirli avantajları ve dezavantajları vardır. IPSCs (i) yeniden programlama hücrelerin neredeyse sonsuz bir kaynak içerir; (Ii) genetik mühendisliği için izin verir; (Iii) a, neredeyse sınırsız farklılaşma potansiyele sahip endows. Bu hücreler, hücre bazlı terapiler için kullanılacak olan, ancak, iPSCs önemli dezavantajları farklılaşmamış hücreleri (in vivo teratoma formasyonu) tümöre neden olması ve ex vivo yetiştirme ve müteakip transplantasyon için ihtiyaç risk taşımaktadır. Buna karşılık, direkt soy yeniden programlama arzu edilen hücrelerin düşük verim tarafından kısıtlanırBaşlangıç nüfusun hedef hücrelerin sayısı ile doğrudan ilişkili, ancak soy programlanabilir hücre nakli 1,2 üzerinde herhangi bir tümör oluşturucu bir risk sergilemek için görünür avantajına sahiptir ki; ayrıca, doğrudan yeniden programlama da örneğin, bu hücrelerin bu şekilde nakli ihtiyacını ortadan kaldırmak, gerekli olacaktır organ içinde, in situ sağlanabilir.
Bu düşünceyle, bizim laboratuvar nörodejeneratif hastalıkların hücre bazlı terapiler yönelik yeni bir yaklaşım olarak ins içine soy-yeniden programlanması beyin yerleşik hücrelerinin olasılığını izlemiştir. Potansiyel olarak soy tekrar programlanması için, hücresel hedefler olarak kabul edilebilir Brain yerleşik hücreler farklı macroglia türleri (astrositler, NG2 hücreleri ve oligodendrosit), mikroglia ve mikrovasküler ilişkili hücrelerin (endotelyal hücreler ve perisitler) içerir. Biz kapsamlı serebral kor astroglial in vitro yeniden programlama potansiyel inceledikErken doğum sonrası farelerin 3-5, tex. Yetişkin insan beyninde doğrudan soy-yeniden programlama için benzer uygun hücre kaynakları arayışı içinde, başarıyla INS ve perisitlerin sergi işaretlerinden içine programlanabilir bir hücre popülasyonu karşılaştı. Burada genişletmek ve in vitro olarak bu hücreleri zenginleştirmek ve son olarak da başarılı bir şekilde içine (% 25-30 aralığında), bu in vitro genişletilmiş hücreleri önemli bir kısmını yeniden programlamak için, yetişkin insan beyni biyopsilerinden bu hücrelerin hasat için nasıl bir protokol açıklar INS. Tekrar-iki transkripsiyon faktörleri, Sox2 ve ascl1 eşzamanlı retrovirüs aracılı ko-ifade ile elde edilebilir. Bu PdiNs tekrarlayan aksiyon potansiyeli ateşleme yeteneğini kazanmak ve sinir ağları içine entegre kabiliyetlerini gösteren diğer nöronlar gibi sinaptik hedeflere hizmet bulundu. Bizim protokol ins içine yetişkin insan beyni perisitler izolasyon ve soy dönüşüm için basit bir prosedürü sağlar. </p>
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol in vitro genişlemesi ve zenginleştirme perisit türetilen hücrelerin yetişkin insan serebral korteksinden izole takip eden ve nörojenik transkripsiyon retrovirüs aracılı ifade tarafından INS içine sonraki dönüşüm ve Sox2 Ascl1 faktörleri açıklamaktadır. Anılan protokol, sonuçta yetişkin beyninin in vivo ortam haline doğrudan dönüşüm yaklaşımı çevirmek için akılda hedefi ile, potansiyel olarak da glia nöronların içine beyin-yerleşik hücrelerinin soy-dön?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz bu protokolün geliştirilmesi sırasında onu girişi için Dr Magdalena Götz minnettarız. Biz cömertçe Sox2 kodlama dizisi ile bize sağlamak için Dr Marius WERNIG (Stanford Üniversitesi) teşekkür ederim. Biz de virüs üretimi için Dr Alexandra Lepier için çok müteşekkiriz. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (4182/2-2 BE) ve BMBF (01GN1009A) BB, ve Bavyera Bilimler Devlet Bakanlığı, Araştırma ve MK ve BBCs için Sanatları uluslu SYSTHER-fon alınan hibe ile desteklenmiştir INREMOS Sanal Enstitüsü (Eğitim ve Araştırma Alman ve Sloven Federal Bakanlıklar) ve DFG (SFB 824).
Materials
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1×; Invitrogen, cat. no. 14190) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | ######### | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
References
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
- Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
- Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
- Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
- Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
- Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
- Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
- Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
- Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
- Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).
