النسب-إعادة برمجة الخلايا المشتقة من خلية حوطية الدماغ البشري الكبار في الخلايا العصبية المستحثة
Summary
استهداف الخلايا المقيمين في الدماغ لإعادة برمجة المباشر النسب-يقدم آفاقا جديدة للإصلاح الدماغ. نحن هنا وصف بروتوكول لكيفية إعداد الثقافات المخصب لpericytes المقيمين في الدماغ من الكبار قشرة الدماغ البشري وتحويل هذه الخلايا العصبية إلى الناجمة عن الفيروس الارتجاعي بوساطة تعبير عن عوامل النسخ Sox2 وAscl1.
Abstract
مباشر النسب-إعادة برمجة الخلايا غير العصبية إلى الخلايا العصبية التي يسببها (INS) قد توفر نظرة ثاقبة لآليات الجزيئية الكامنة وراء تكوين الخلايا العصبية وتمكين استراتيجيات جديدة لنمذجة في المختبر أو إصلاح الدماغ المريضة. تحديد أنواع الخلايا غير العصبية المقيمين في الدماغ قابلة للتحويل المباشر في دائرة الهجرة والتجنيس قد تسمح لإطلاق مثل هذا النهج في الموقع، أي داخل أنسجة المخ التالفة. نحن هنا وصف بروتوكول وضعت في محاولة لتحديد الخلايا المشتقة من الدماغ البشري الكبار التي تلبي هذه الفرضية. هذا البروتوكول ينطوي على: (1) زراعة الخلايا البشرية من القشرة المخية التي تم الحصول عليها من الخزعات الدماغ البشري الكبار؛ (2) التوسع في المختبر (التي تتطلب حوالي 2-4 أسابيع) وتوصيف الثقافة التي كتبها كيمياء سيتولوجية مناعية والتدفق الخلوي؛ (3) إثراء من قبل الخلية مضان تنشيط الفرز (FACS) استخدام الألغام المضادة للPDGF مستقبلات β والأجسام المضادة للCD146؛(4) تنبيغ بوساطة الارتجاعي مع النسخ العصبية عوامل sox2 وascl1؛ (5) وأخيرا توصيف الخلايا العصبية الناتجة المشتقة من خلية حوطية يسببها (PdiNs) من قبل كيمياء سيتولوجية مناعية (14 يوما إلى 8 أسابيع بعد تنبيغ فيروسات). في هذه المرحلة، يمكن أن دائرة الهجرة والتجنيس سيتم بحثها لخصائصها الكهربائية عن طريق تسجيل التصحيح، المشبك. يوفر هذا البروتوكول إجراء تكرار للغاية لفي المختبر النسب تحويل pericytes المقيمين في الدماغ الإضافية الإنسان الوظيفية.
Introduction
بدلا من إعادة برمجة الخلايا الجسدية إلى خلايا الجذعية المحفزة (iPSCs)، والتي بدورها وهبوا مع مجموعة كبيرة من إمكانات التمايز، وتهدف إعادة برمجة المباشر للتحويل مباشرة من نوع واحد خلية معينة إلى أخرى. فيما يتعلق تطبيقها في سياق النمذجة المرض والعلاجات المستندة إلى الخلايا المحتملة، كلا النهجين إعادة برمجة لديها مزايا وعيوب محددة. إعادة برمجة في iPSCs (ط) يوفر مصدرا غير محدود تقريبا من الخلايا؛ (ب) يسمح للهندسة الوراثية؛ (ج) يمنح مع احتمال التمايز غير محدودة تقريبا. ومع ذلك، العيوب الرئيسية لiPSCs تنطوي على خطر tumorigenicity من خلايا غير متمايزة (تشكيل مسخي في الجسم الحي) والحاجة إلى فيفو السابقين زراعة وزرع اللاحقة إذا كانت هذه الخلايا هي لاستخدامها في العلاجات المستندة إلى الخلايا. على العكس، يقتصر المباشر النسب-إعادة برمجة من العائد أقل من الخلايا المطلوبوالذي يرتبط مباشرة مع عدد من الخلايا المستهدفة من السكان بدءا، ولكن تمتلك ميزة أن تظهر الخلايا التي أعيدت برمجتها النسب لعرض أي خطر على مكون للأورام زرع 1،2؛ علاوة على ذلك، يمكن حتى يتحقق إعادة برمجة مباشرة في الموقع، أي داخل الجهاز حيث ستلزم هذه الخلايا، وبالتالي تجنب الحاجة إلى الزرع.
مع هذا في الاعتبار، مختبرنا اتبعت إمكانية خلايا الدماغ مقيم إعادة برمجة النسب في دائرة الهجرة والتجنيس كما نهجا جديدا نحو العلاجات المستندة إلى الخلايا من أمراض الاعصاب. تتكون خلايا الدماغ المقيمين التي قد يحتمل اعتباره أهداف الخلوية لإعادة برمجة النسب-أنواع مختلفة من الدبق الكبروي (الخلايا النجمية، وخلايا NG2 و oligodendrocytes)، الخلايا الدبقية الصغيرة، وخلايا المرتبطة microvessel (الخلايا البطانية وpericytes). درسنا على نطاق واسع لإعادة برمجة المحتملة في المختبر من دبق نجمي الخلايا الدماغية من مجلس النوابتكس في وقت مبكر بعد الولادة الفئران 3-5. بحثا عن مصادر خلية مناسبة مماثلة لمباشرة النسب-إعادة برمجة الدماغ في الإنسان البالغ، ونحن اجه السكان الخلية التي يمكن برمجتها بنجاح في دائرة الهجرة والتجنيس والدمغات المعرض من pericytes. نحن هنا وصف بروتوكول لكيفية جني هذه الخلايا من الخزعات الدماغ البشري الكبار، لتوسيع وإثراء هذه الخلايا في المختبر، وأخيرا إعادة برمجة بنجاح جزء كبير من هذه الخلايا في المختبر الموسعة (في حدود 25-30٪) في دائرة الهجرة والتجنيس. لا يمكن أن يتحقق عن طريق إعادة برمجة وقت واحد بوساطة الارتجاعي شارك في التعبير عن اثنين من عوامل النسخ، sox2 وascl1. تم العثور على هذه PdiNs لاكتساب قدرة العمل المتكررة إطلاق إمكانات لخدمة أهداف ومتشابك أما الخلايا العصبية الأخرى مما يدل قدرتها على الاندماج في الشبكات العصبية. يوفر بروتوكول لدينا إجراءات واضحة لعزل ونسب التحويل من pericytes الدماغ البشري الكبار في دائرة الهجرة والتجنيس. </ع>
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول التوسع في المختبر وإثراء الخلايا المشتقة من خلية حوطية التالية بمعزل عن الكبار قشرة الدماغ البشري وتحويل اللاحقة في دائرة الهجرة والتجنيس من قبل بوساطة التعبير الارتجاعي من النسخ العصبية عوامل Sox2 وAscl1. يوفر هذا البروتوكول تجريبية في نظا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون للدكتور ماغدالينا غوتس لإدخال لها خلال تطوير هذا البروتوكول. نشكر الدكتور ماريوس Wernig (جامعة ستانفورد) لتزويدنا بسخاء مع تسلسل sox2 الترميز. ونحن أيضا ممتنون جدا للدكتور الكسندرا Lepier لإنتاج الفيروس. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من تلقى الفنون إلى MK [بكس] وبتمويل من SYSTHER-ثنائية القومية جمعية الألمانية للبحوث (BE 4182/2-2) وBMBF (01GN1009A) إلى BB، وزارة ولاية بافاريا للعلوم والبحوث و INREMOS المعهد الافتراضي (الألمانية والسلوفينية الوزارات الاتحادية للتعليم والبحوث) وDFG (SFB 824).
Materials
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1×; Invitrogen, cat. no. 14190) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | ######### | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
References
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Kim, J., et al. Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts. Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).
- Duan, B., et al. Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata. Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).
- Heinrich, C., et al. Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol. 8, (2010).
- Heinrich, C., et al. Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex. Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. , (2007).
- Karow, M., et al. Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells. Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).
- Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).
- Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9, 575-578 (2012).
- Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).
- Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts. J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).
- Lu, J., et al. Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts. Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).
- Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. Induced neuronal cells: how to make and define a neuron. Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).
- Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476, 220-223 (2011).
- Yoo, A. S., et al. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature. 476, 228-231 (2011).
- Son, E. Y., et al. Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).
- Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).
- Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).
- Najm, F. J., et al. Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells. Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).
