Lineage reprogrammation de cellules pericyte dérivés du cerveau humain adulte en neurones induits
Summary
Cibler les cellules du cerveau-résident pour la lignée reprogrammation directe offre de nouvelles perspectives pour la réparation du cerveau. Nous décrivons ici un protocole de la façon de préparer les cultures enrichies en péricytes du cerveau-résident de l'adulte cortex cérébral humain et les convertir en neurones induits par l'expression de retrovirus de facteurs de transcription Sox2 et Ascl1.
Abstract
Direct lignage reprogrammation des cellules non-neuronales en neurones induits (INS) peut fournir des indications sur les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la neurogenèse et de nouvelles stratégies pour la modélisation in vitro ou la réparation du cerveau malade. Identifier les types de cellules cérébrales-résident non-neuronales qui se prêtent à la conversion directe dans INS pourraient permettre de lancer une telle approche in situ, c'est à dire dans le tissu cérébral endommagé. Nous décrivons ici un protocole mis au point pour tenter d'identifier des cellules dérivées du cerveau humain adulte qui remplissent cette hypothèse. Ce protocole consiste à: (1) la mise en culture de cellules humaines à partir du cortex cérébral obtenu à partir de biopsies du cerveau humain adulte; (2) l'expansion in vitro (ce qui nécessite environ 2-4 semaines) et la caractérisation de la culture par immunocytochimie et cytométrie de flux; (3) l'enrichissement en cellules activé par fluorescence (FACS) en utilisant des anti-récepteur de PDGF-β et d'anticorps anti-CD146;(4) la transduction rétrovirale médiée par la transcription des facteurs Sox2 neurogène et ASCL1; (5) et, enfin, la caractérisation des neurones résultantes de péricytes dérivé induits (PdiNs) par immunocytochimie (14 jours à huit semaines suivant transduction rétrovirale). A ce stade, l'INS peut être sondé pour leurs propriétés électriques par l'enregistrement de patch-clamp. Ce protocole prévoit une procédure hautement reproductible pour la conversion in vitro de la lignée des péricytes du cerveau-résident en ins humaines fonctionnelles.
Introduction
Par opposition à la reprogrammation des cellules somatiques dans des cellules souches pluripotentes induites (CISP), qui à leur tour sont équipés d'une multitude de potentiels de différenciation, une reprogrammation directe vise à conversion directe d'un type de cellule spécifique dans une autre. En ce qui concerne leur application dans le contexte de la modélisation des maladies et des thérapies à base de cellules potentiels, deux approches de reprogrammation ont des avantages et des inconvénients spécifiques. Reprogrammation en CSPi (i) fournit une source quasi infinie de cellules; (Ii) permet de génie génétique; (Iii) confère un potentiel de différenciation presque illimitée. Cependant, les inconvénients majeurs de iPSCs comportent le risque de tumorigénicité des cellules indifférenciées (formation de tératome in vivo) et la nécessité d'une culture ex vivo et la transplantation subséquente si ces cellules doivent être utilisées pour les thérapies à base de cellules. A l'inverse, la lignée-reprogrammation directe est limitée par le faible rendement des cellules désiréesqui est en corrélation directe avec le nombre de cellules ciblées de la population de départ, mais possède l'avantage que des cellules de la lignée-reprogrammé semblent présenter aucun risque lors de la transplantation tumorigène 1,2; en outre, la reprogrammation directe peut même être réalisée in situ, c'est à dire dans l'organe où ces cellules seraient nécessaires, ce qui évite le besoin d'une transplantation.
Dans cet esprit, notre laboratoire a poursuivi la possibilité des cellules du cerveau-résident lignagères reprogrammation en ins comme une nouvelle approche vers des thérapies à base de cellules de maladies neurodégénératives. Les cellules du cerveau-résident qui peuvent être potentiellement considérés comme des cibles cellulaires pour lignage reprogrammation comprennent différents types de macroglie (astrocytes, des cellules NG2 et oligodendrocytes), la microglie et les cellules microvasculaires associées (cellules endothéliales et péricytes). Nous avons beaucoup étudié le potentiel de reprogrammation in vitro de astroglia du cor cérébraletex de souris postnatale précoce 3-5. A la recherche de sources de cellules de la même lignée appropriés pour reprogrammation directe dans le cerveau humain adulte, nous avons rencontré une population de cellules qui peuvent être reprogrammé avec succès dans tenants et les caractéristiques d'exposition des péricytes. Nous décrivons ici un protocole de façon à récolter les cellules à partir de biopsies du cerveau humain adulte, d'élargir et d'enrichir ces cellules in vitro, et, enfin, de reprogrammer avec succès une fraction substantielle de ces cellules in vitro en expansées (dans la plage de 25 à 30%) dans Ins. La reprogrammation peut être obtenue par retrovirus co-expression simultanée de deux facteurs de transcription, et Sox2 ASCL1. Ces PdiNs ont été trouvés à acquérir la capacité d'action répétitive tir potentiel et de servir de cibles synaptiques d'autres neurones indiquant leur capacité d'intégration dans les réseaux de neurones. Notre protocole prévoit une procédure simple pour la conversion de l'isolement et de la lignée des péricytes adultes du cerveau humain dans Ins. </p>
Protocol
Representative Results
Discussion
Le présent protocole décrit l'expansion in vitro et l'enrichissement des cellules péricytes dérivé après l'isolement de l'adulte cortex cérébral humain et la conversion ultérieure en ins par l'expression de retrovirus de la transcription neurogène facteurs Sox2 et Ascl1. Ce protocole prévoit une expérimentation dans le système in vitro pour étudier la lignée de conversion des cellules du cerveau résident dans les neurones et potentiellement les cellules glia…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants envers le Dr Magdalena Götz pour sa contribution au cours de l'élaboration de ce protocole. Nous remercions le Dr Marius Wernig (Stanford University) pour généreusement nous fournir la séquence codante de Sox2. Nous sommes également très reconnaissants envers le Dr Alexandra Lepier pour la production de virus. Ce travail a été financé par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) et le BMBF (01GN1009A) à BB, et le ministère bavarois des Sciences, de la Recherche et des Arts à MK et BBCS reçu des fonds du SYSTHER binational INREMOS Institut virtuel (ministères fédéral allemand et slovène de l'éducation et de la recherche) et la DFG (SFB 824).
Materials
| anti-CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | use 1:100 |
| anti-CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | use 1:100 |
| anti-CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | use 1:100 |
| anti-CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | use 1:100 |
| anti-PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | use 1:200 |
| anti-CD146 | Abcam | Ab75769 | use 1:400 |
| anti-NG2 | Millipore | AB5320 | use 1:400 |
| anti-SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | use 1:400 |
| anti-βIII-tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | use 1:400 |
| anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | use 1:200 |
| anti-GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | use 1:600 |
| anti-GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | use 1:1000 |
| anti-RFP | Chromotek | 5F8 | use 1:500 |
| anti-S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | use 1:300 |
| anti-NeuN | Millipore | MAB377 | use 1:200 |
| anti-GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | use 1:500 |
| anti-Calretinin | Millipore | AB5054 | use 1:500 |
| anti-vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | use 1:1000 |
| Rat IgG1 isotype control FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | use 1:100 |
| Rat IgG1 isotype control APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | use 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10106-169 | perform heat inactivation by incubation at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) | Invitrogen | 24020-091 | |
| Dulbecco's PBS without CaCl2 and MgCl2 (D-PBS, 1×; Invitrogen, cat. no. 14190) | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| PFA (paraformaldehyde) | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI (4′,6-Diamidin-2-phenylindole) dilactate | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Polypropylene round-bottom tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Polystyrene round-bottom tubes with cell-strainer cap | BD Biosciences | 352235 | |
| 24-well plates | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 culture flasks | Greiner Bio-One | 690175 | |
| Disposable pipettes 10 ml | Sarstedt | ######### | |
| Glass Pasteur pipettes (150 mm) | Fisherbrand | FB50251 | |
| Glass coverslips 12 mm diameter | Menzel | CB00120RA1 | |
| Surgical disposable scalpels | B. Braun | 5518083 | |
| Tissue culture dishes | Greiner Bio-One | 633180 | |
| Conical tubes 15ml | BD Biosciences | 352095 | |
| Laminar flow hood | |||
| Centrifuge and swing-out rotor with adapters for 15 ml and 50 ml tubes | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| Flow cytometry cell sorter: FACSAria l with FACSDiva software | BD Biosciences | ||
| Humified cell culture incubator | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| Wather bath at 37 °C | |||
| FACSFlow sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| Epifluorescence microscope BX61 | Olympus | ||
| Confocal microscope LSM710 | Zeiss |
References
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