Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma
Summary
In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.
Abstract
Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.
Introduction
Bu protokol, biz siRNA'ları kullanarak fare makrofaj hücre hatlarında genleri inhibe ve doğal immün yanıt üzerindeki bu tedavilerin etkilerinin izlenmesi için etkin yöntemler açıklanmaktadır. Bu prosedürler, orta ya da yüksek verimli bir şekilde RNAi ekranlar için izin veren, 96-kuyu formatında gerçekleştirildi.
Enfeksiyona yanıt olarak, insanlar hemen doğuştan gelen bağışıklık tepkisini daha yavaş olan ancak daha özel bir uyum sağlayıcı bağışıklık tepkisi. Bu hızlı doğal immün yanıt makrofajlar 1 olmak üzere fagositik doğuştan gelen bağışıklık hücreleri toplanmasını ve aktivasyonunu içerir. Klasik olarak aktif makrofajlar, akut enflamatuar yanıtlarda rol oynayan ve antimikrobiyal proteinlerin ve bileşiklerin, sitokinler ve kemokinleri ve antijenlerini 2,3 üretirler. Alternatif aktive makrofajlar hoşgörüyü, doku onarımı bakımı, bağışıklık düzenlenmesinde rol oynar ve 4-8 yara iyileşmesi. Çünkü işlevleri onların geniş dizi, Makrofajlar ateroskleroz, arterit, kanser ve 9 da dahil olmak üzere pek çok hastalıkta önemli bir rol oynayabilir. Bu nedenle, makrofajların çalışma hastalık alanları arasında bir yelpazede bir süre için bir araştırma anahtar alanı olmuştur.
Doğuştan gelen bağışıklık tepki olarak önemine rağmen, makrofajlar ile çalışmak için hücreler zor olabilir. Özellikle, toksisitesi, 10,11 makrofajların lipid reaktifler kullanılarak verimli transfeksiyona elde etmek zordur. Ayrıca, siRNA verimli makrofajlar teslim olduğunda bile, genellikle demonte RNAi neden geninin sağlamlığı oldukça ılımlı olabilir ve gen için gen arasında değişebilir.
Bu teknik zorlukları aşmak için, iki fare makrofaj hücre hatları, RAW264.7 17 ve J774A.1 18 transfeksiyonuna ve demonte teknikleri 12-16 optimize ettik. Bu yaklaşım, transfeksiyon için Amaxa Nucleofector 96 oyuklu Servisi Sistemi kullanır; bu sistemin96-çukurlu formatta 19 hücreleri transfekte etmek için özel reaktifler ve elektroporasyon bir kombinasyonunu kullanır. Transfeksiyondan ardından, yöntem hücresi geri kazanımı ve canlılığı maksimize etmek ve daha sonra, siRNA ile uyarılan gen demonte üst düzeye çıkarmak için tarif etmektedir. Bu yaklaşımın faydasını göstermek için, lipopolisakkarit (LPS) ile bu hücreleri uyarır ve çeşitli pro-enflamatuar sitokinlerin üretim düzeyinde doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin izlenmesi, aşağıdaki makrofaj hücre hatlarına siRNA taşınması için bir protokol açıklar. Biz üyeleri LPS ve diğer patojen ilişkili moleküler şekilleri (üzerine durmaktadır) duygusu, doğuştan gelen bağışıklık düzenleyen Toll-benzeri reseptör (TLR) ailesi, hangi hedef örnek veri sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çok sayıda çalışma, burada tek tek genler sıçangil makrofaj siRNA tarafından hedef alınmıştır yayınlanmıştır. Lipit aracılı transfeksiyon bireysel olarak makrofaj hücre hatlarına siRNA teslim etmek için kullanılmış olsa da, bu yöntemler, bir genden genine canlılığı, sınırlı gen demonte ve değişkenlik olası etkileri muzdarip. Orta veya yüksek verimli bir şekilde genlerin hedeflenmesi için kullanılabilecek daha sert tahlilleri geliştirmek için, gen demonte içinde daha fazla kıvam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Thanks to Brad Lackford for assistance optimizing some of the techniques described in this manuscript.
Materials
| Amaxa nucleofector 96-well shuttle system | Lonza | AAM-1001S | |
| Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit | Lonza | V4SC-2096 | |
| RAW264.7 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-71 | |
| J774A.1 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-67 | |
| siGenome smartpool siRNA | Dharmacon | varies depending on gene | |
| Non-targeting control siRNA pool | Dharmacon | D-001206-13-20 | |
| Block-iT fluorescent oligo for electrooration | Invitrogen | 13750062 | |
| Ultrapure E. coli O111:B4 LPS | List Biological Laboratories | 421 | |
| DMEM, high glucose | Invitrogen | 11995-065 | |
| RPM1-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution (Pen/Strep) | Fisher | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| 96 well tissue culture plates | Fisher | 07-200-89 | |
| 96 well round bottom sterile plates (not coated) | Fisher | 07-200-745 | |
| Mouse IL-6 Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY406 | |
| Mouse TNFa Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY410 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| RLT Bufer | Qiagen | 79216 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74134 | |
| Vybrant Phagocytosis Assay Kit | Invitrogen | V-6694 |
References
- Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. . The innate immune response to infection. , (2004).
- Adams, D. O., Hamilton, T. A. The cell biology of macrophage activation. Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).
- Fujiwara, N., Kobayashi, K. Macrophages in inflammation. Current drug targets. Inflammation and allergy. 4, 281-286 (2005).
- Gordon, S., Martinez, F. O. Alternative activation of macrophages: mechanism and functions. Immunity. 32, 593-604 (2010).
- Martinez, F. O., Helming, L., Gordon, S. Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective. Annual review of immunology. 27, 451-483 (2009).
- Fairweather, D., Cihakova, D. Alternatively activated macrophages in infection and autoimmunity. Journal of autoimmunity. 33, 222-230 (2009).
- Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. Journal of immunology. 181, 3733-3739 (2008).
- Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. Macrophage polarization comes of age. Immunity. 23, 344-346 (2005).
- Burke, B., Lewis, C. E. . The macrophage. , (2002).
- Lee, G., Santat, L. A., Chang, M. S., Choi, S. RNAi methodologies for the functional study of signaling molecules. PloS one. 4, (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. Journal of biomolecular screening. 14, 151-160 (2009).
- Alper, S., et al. Identification of innate immunity genes and pathways using a comparative genomics approach. ProcNatl Acad Sci USA. 105, 7016-7021 (2008).
- De Arras, L., et al. An evolutionarily conserved innate immunity protein interaction network. J. Bio. Chem. , 1967-1978 (2013).
- Yang, I. V., et al. Novel regulators of the systemic response to lipopolysaccharide. Am J Respir Cell Mol Biol. 45, 393-402 (2011).
- Yang, I. V., et al. Identification of novel innate immune genes by transcriptional profiling of macrophages stimulated with TLR ligands. Molecular immunology. 48, 1886-1895 (2011).
- Yang, I. V., et al. Identification of novel genes that mediate innate immunity using inbred mice. Genetics. 183, 1535-1544 (2009).
- Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell. 15, 261-267 (1978).
- Ralph, P., Moore, M. A., Nilsson, K. Lysozyme synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines. The Journal of experimental medicine. , 1528-1533 (1976).
- Zumbansen, M., et al. First siRNA library screening in hard-to-transfect HUVEC cells. Journal of RNAi and gene silencing. 6, 354-360 (2010).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
- Aliprantis, A. O., et al. Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2. Science. 285, 736-739 (1999).
- Alexopoulou, L., Holt, A. C., Medzhitov, R., Flavell, R. A. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature. 413, 732 (2001).
- Conforti, R., et al. Opposing effects of toll-like receptor (TLR3) signaling in tumors can be therapeutically uncoupled to optimize the anticancer efficacy of TLR3 ligands. Cancer Res. 70, 490-500 (2010).
- Fernandez-Botran, R., Větvička, V. . Methods in Cellular Immunology. 8, 8 (2001).
