Usando RNA-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos
Summary
In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.
Abstract
Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.
Introduction
Neste protocolo, descrevemos métodos eficientes para inibir genes em linhagens de células de rato macrófagos utilizando siRNAs e monitorar os efeitos desses tratamentos sobre a resposta imune inata. Estes procedimentos são realizados no formato de 96 poços, permitindo para telas de ARNi em forma de médio ou alto rendimento.
Em resposta a infecção, os humanos montar uma resposta imune inata imediata e uma resposta imune adaptativa mais lento, mas mais específico. Esta resposta imune inata rápida envolve o recrutamento e activação de células imunitárias inatas fagocíticas incluindo macrófagos 1. Classicamente macrófagos activados são envolvidos em respostas inflamatórias agudas e produzem proteínas antimicrobianas e compostos, citocinas e quimiocinas, e apresentam antígenos 2,3. Alternativamente macrófagos activados desempenham um papel na regulação da imunidade, manutenção da tolerância, a reparação de tecidos, a cicatrização de feridas e 4-8. Devido à sua ampla gama de funções, Os macrófagos podem desempenhar um papel em numerosas doenças, incluindo a aterosclerose, artrite, cancro e 9. Assim, o estudo dos macrófagos tem sido uma importante área de pesquisa por algum tempo em uma grande variedade de campos de doença.
Apesar da sua importância na resposta imune inata, os macrófagos podem ser um desafio células para trabalhar. Em particular, é difícil a obtenção de transfecção eficiente, utilizando reagentes de lípidos nos macrófagos sem toxicidade associada 10,11. Além disso, mesmo quando siRNA é eficientemente entregues aos macrófagos, a robustez do gene induzida por ARNi knockdown pode muitas vezes ser bastante moderado e pode variar de gene para gene.
Para superar estes desafios técnicos, nós otimizamos transfecção e técnicas knockdown 16/12 em duas linhas de células de rato macrófagos, RAW264.7 17 e 18 J774A.1. Esta abordagem utiliza o Sistema de Transporte de 96 poços Amaxa Nucleofector para transfecção; este sistemautiliza uma combinação de reagentes e electroporação para transfectar células especializadas em formato de 96 poços 19. Após transfecção, descrevemos métodos para maximizar a recuperação e viabilidade celular e para maximizar subseqüente knockdown gene induzida por siRNA. Para ilustrar a utilidade desta abordagem, os autores descrevem um protocolo para a entrega de siRNA para estas linhas celulares de macrófagos, estimular essas células com lipopolissacarídeo (LPS), e monitorizar a resposta imune inata no nível de produção de várias citocinas pró-inflamatórias. Nós fornecemos os dados da amostra em que têm como alvo a família de receptores Toll-like (TLR), cujos membros sentem LPS e outros padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), para regular a imunidade inata.
Protocol
Representative Results
Discussion
Numerosos estudos têm sido publicados em que genes individuais têm sido alvo de siRNA em macrófagos murinos. Enquanto a transfecção mediada por lípidos foi usado para entregar siRNA para linhas celulares de macrófagos, numa base individual, estes métodos sofrem de efeitos potenciais sobre a viabilidade, knockdown gene limitada, e variabilidade de gene para gene. Para desenvolver ensaios mais robustos que poderiam ser usados para direcionar genes na forma de médio ou de alto rendimento, nós otimizamos té…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Thanks to Brad Lackford for assistance optimizing some of the techniques described in this manuscript.
Materials
| Amaxa nucleofector 96-well shuttle system | Lonza | AAM-1001S | |
| Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit | Lonza | V4SC-2096 | |
| RAW264.7 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-71 | |
| J774A.1 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-67 | |
| siGenome smartpool siRNA | Dharmacon | varies depending on gene | |
| Non-targeting control siRNA pool | Dharmacon | D-001206-13-20 | |
| Block-iT fluorescent oligo for electrooration | Invitrogen | 13750062 | |
| Ultrapure E. coli O111:B4 LPS | List Biological Laboratories | 421 | |
| DMEM, high glucose | Invitrogen | 11995-065 | |
| RPM1-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution (Pen/Strep) | Fisher | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| 96 well tissue culture plates | Fisher | 07-200-89 | |
| 96 well round bottom sterile plates (not coated) | Fisher | 07-200-745 | |
| Mouse IL-6 Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY406 | |
| Mouse TNFa Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY410 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| RLT Bufer | Qiagen | 79216 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74134 | |
| Vybrant Phagocytosis Assay Kit | Invitrogen | V-6694 |
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