באמצעות RNA-התערבות לחקר התגובה החיסונית המולדת בהמקרופאגים עכבר
Summary
In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.
Abstract
Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.
Introduction
בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות יעילים כדי לדכא גנים בשורות תאי מקרופאג עכבר באמצעות siRNAs ולעקוב אחר ההשפעות של טיפולים אלה בתגובה החיסונית המולדת. נהלים אלה מתבצעים בפורמט 96-היטב, המאפשרים למסכי RNAi באופנה בינונית או תפוקה גבוהה.
בתגובה לזיהום, בני אדם הר תגובה מיידית של מערכת חיסון מולדת ותגובה חיסונית אדפטיבית איטית אבל יותר ספציפית. תגובה חיסונית מולדת מהירה זה כוללת את הגיוס והפעלה של תאים חיסוניים מולדים phagocytic כוללים מקרופאגים 1. מקרופאגים מופעלים קלסי מעורבים בתגובות דלקתיות חריפות ולייצר חלבונים אנטי-מיקרוביאלי ותרכובות, ציטוקינים וכמוקינים, והווה אנטיגנים 2,3. מקרופאגים מופעלים לחלופין למלא תפקיד בויסות חסינות, שמירה על סובלנות, תיקון רקמות, וריפוי פצעי 4-8. בגלל המגוון הרחב של פונקציות שלהם, מקרופאגים יכולים לשחק תפקיד במספר רב של מחלות, כולל טרשת עורקים, דלקת פרקים וסרטן 9. כך, המחקר של מקרופאגים היה אזור עיקרי של מחקר כבר כמה זמן במגוון רחב של תחומים מחלה.
למרות חשיבותם בתגובה החיסונית המולדת, מקרופאגים יכולים להיות מאתגרים תאים לעבוד איתו. בפרט, קשה להשיג transfection יעיל באמצעות ריאגנטים שומנים במקרופאגים ללא הרעלה כרוכה 10,11. יתר על כן, גם כאשר siRNA מועבר ביעילות למקרופאגים, על חוסנו של הגן מושרה RNAi מציאה לעתים קרובות יכול להיות מתון למדי ויכול להשתנות מגן לגן.
כדי להתגבר על אתגרים טכניים אלה, יש לנו מותאמים transfection וטכניקות מציאה 12-16 בשתי שורות תאי מקרופאג העכבר, RAW264.7 17 וJ774A.1 18. גישה זו עושה שימוש במערכת הסעות 96, גם Amaxa Nucleofector לtransfection; מערכת זומשתמש בשילוב של חומרים כימיים וelectroporation מיוחדים transfect תאים בפורמט 96-גם 19. בעקבות transfection, אנו מתארים שיטות למקסם את התאוששות תא כדאיות ועל מנת למקסם את מציאה גן מושרה siRNA שלאחר מכן. כדי להמחיש את התועלת של גישה זו, אנו מתארים פרוטוקול למסירת siRNA לשורות תאי מקרופאג אלה, לעורר תאים אלה עם lipopolysaccharide (LPS), ולנטר את התגובה החיסונית המולדת ברמת ייצור של כמה ציטוקינים פרו-דלקתיים. אנו מספקים נתונים לדוגמה שבה אנו ממקדים משפחת קולט Toll-like (TLR), שחבריה לחוש LPS ודפוסים אחרים הפתוגן הקשורים מולקולריים (PAMPs), להסדיר חסינות מולדת.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקרים רבים שפורסמו שבגנים בודדים היו ממוקדים על ידי siRNA במקרופאגים העכבריים. בעוד transfection תיווך שומנים נעשה שימוש כדי לספק siRNA לשורות תאי מקרופאג על בסיס אישי, שיטות אלה סובלים מהשפעות אפשריות על כדאיות, מציאה גן מוגבלת, ושונות מגן לגן. לפתח מבחני חזקים יותר שיכול לשמ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Thanks to Brad Lackford for assistance optimizing some of the techniques described in this manuscript.
Materials
| Amaxa nucleofector 96-well shuttle system | Lonza | AAM-1001S | |
| Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit | Lonza | V4SC-2096 | |
| RAW264.7 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-71 | |
| J774A.1 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-67 | |
| siGenome smartpool siRNA | Dharmacon | varies depending on gene | |
| Non-targeting control siRNA pool | Dharmacon | D-001206-13-20 | |
| Block-iT fluorescent oligo for electrooration | Invitrogen | 13750062 | |
| Ultrapure E. coli O111:B4 LPS | List Biological Laboratories | 421 | |
| DMEM, high glucose | Invitrogen | 11995-065 | |
| RPM1-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution (Pen/Strep) | Fisher | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| 96 well tissue culture plates | Fisher | 07-200-89 | |
| 96 well round bottom sterile plates (not coated) | Fisher | 07-200-745 | |
| Mouse IL-6 Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY406 | |
| Mouse TNFa Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY410 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| RLT Bufer | Qiagen | 79216 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74134 | |
| Vybrant Phagocytosis Assay Kit | Invitrogen | V-6694 |
References
- Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. . The innate immune response to infection. , (2004).
- Adams, D. O., Hamilton, T. A. The cell biology of macrophage activation. Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).
- Fujiwara, N., Kobayashi, K. Macrophages in inflammation. Current drug targets. Inflammation and allergy. 4, 281-286 (2005).
- Gordon, S., Martinez, F. O. Alternative activation of macrophages: mechanism and functions. Immunity. 32, 593-604 (2010).
- Martinez, F. O., Helming, L., Gordon, S. Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective. Annual review of immunology. 27, 451-483 (2009).
- Fairweather, D., Cihakova, D. Alternatively activated macrophages in infection and autoimmunity. Journal of autoimmunity. 33, 222-230 (2009).
- Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. Journal of immunology. 181, 3733-3739 (2008).
- Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. Macrophage polarization comes of age. Immunity. 23, 344-346 (2005).
- Burke, B., Lewis, C. E. . The macrophage. , (2002).
- Lee, G., Santat, L. A., Chang, M. S., Choi, S. RNAi methodologies for the functional study of signaling molecules. PloS one. 4, (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. Journal of biomolecular screening. 14, 151-160 (2009).
- Alper, S., et al. Identification of innate immunity genes and pathways using a comparative genomics approach. ProcNatl Acad Sci USA. 105, 7016-7021 (2008).
- De Arras, L., et al. An evolutionarily conserved innate immunity protein interaction network. J. Bio. Chem. , 1967-1978 (2013).
- Yang, I. V., et al. Novel regulators of the systemic response to lipopolysaccharide. Am J Respir Cell Mol Biol. 45, 393-402 (2011).
- Yang, I. V., et al. Identification of novel innate immune genes by transcriptional profiling of macrophages stimulated with TLR ligands. Molecular immunology. 48, 1886-1895 (2011).
- Yang, I. V., et al. Identification of novel genes that mediate innate immunity using inbred mice. Genetics. 183, 1535-1544 (2009).
- Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell. 15, 261-267 (1978).
- Ralph, P., Moore, M. A., Nilsson, K. Lysozyme synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines. The Journal of experimental medicine. , 1528-1533 (1976).
- Zumbansen, M., et al. First siRNA library screening in hard-to-transfect HUVEC cells. Journal of RNAi and gene silencing. 6, 354-360 (2010).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
- Aliprantis, A. O., et al. Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2. Science. 285, 736-739 (1999).
- Alexopoulou, L., Holt, A. C., Medzhitov, R., Flavell, R. A. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature. 413, 732 (2001).
- Conforti, R., et al. Opposing effects of toll-like receptor (TLR3) signaling in tumors can be therapeutically uncoupled to optimize the anticancer efficacy of TLR3 ligands. Cancer Res. 70, 490-500 (2010).
- Fernandez-Botran, R., Větvička, V. . Methods in Cellular Immunology. 8, 8 (2001).
