Использование РНК-интерференции по расследованию врожденного иммунного ответа у мышей макрофагов
Summary
In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.
Abstract
Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.
Introduction
В этом протоколе, мы опишем эффективные методы для подавления генов в линиях мыши макрофагов клеток, используя миРНК и мониторинга последствий такого лечения на врожденного иммунного ответа. Эти процедуры выполняются в формате 96-луночного, что позволяет РНК-интерференции экраны в средне- или высокой пропускной моды.
В ответ на инфекцию, люди монтировать немедленного врожденный иммунный ответ и более медленный, но более конкретные адаптивного иммунного ответа. Этот быстрый врожденного иммунного ответа включает вербовку и активацию фагоцитирующих врожденных иммунных клеток, включая макрофаги 1. Классически активированные макрофаги участвуют в острых воспалительных реакций и производить антибактериальных белков и соединений, цитокинов и хемокинов, и представить антигены 2,3. Кроме того, активированные макрофаги играют роль в регуляции иммунитета, поддержания толерантности, восстановление тканей и заживление ран 4-8. Из-за их широкого спектра функций, Макрофаги могут играть определенную роль в многочисленных заболеваний, включая атеросклероз, артрит, рак и 9. Таким образом, изучение макрофагов является ключевым направлением исследований в течение некоторого времени в самых разнообразных областях заболевания.
Несмотря на их важность в врожденного иммунного ответа, макрофаги могут быть сложные клетки, чтобы работать с. В частности, трудно получить эффективную трансфекцию с использованием липидных реактивов в макрофагах без ассоциированного токсичности 10,11. Более того, даже когда миРНК эффективно доставлены в макрофагах, надежность RNAi-индуцированного гена нокдаун часто может быть довольно умеренными и могут варьироваться в зависимости от гена к гену.
Чтобы преодолеть эти технические проблемы, мы оптимизировали трансфекции и нокдаун методы 12-16 в двух клеточных линий мыши макрофагов, RAW264.7 17 и J774A.1 18. Этот подход использует Amaxa Nucleofector Shuttle System 96-а для трансфекции; эта системаиспользует комбинацию специализированных реагентов и электропорации для трансфекции клеток в формате 96-луночного 19. После трансфекции мы опишем методы, чтобы максимизировать восстановление и жизнеспособность клеток и для максимального последующее миРНК вызванной генной нокдаун. Чтобы проиллюстрировать полезность этого подхода, мы опишем протокол для миРНК доставки этих макрофагов клеточных линий, стимулируют эти клетки с липополисахарида (ЛПС), и следить за врожденный иммунный ответ на уровне производства нескольких провоспалительных цитокинов. Мы предоставляем образцы данных, в которой мы нацелены на Toll-подобный рецептор (TLR) семья, члены которой чувствуют LPS и другие патогенные ассоциированные молекулярные паттерны (PAMPs), регулировать врожденный иммунитет.
Protocol
Representative Results
Discussion
Многочисленные исследования были опубликованы в которой отдельные гены были мишенью миРНК в макрофагах мышей. В то время как липидный опосредованной трансфекции был использован для доставки миРНК для макрофагов клеточных линий на индивидуальной основе, эти методы страдают от потенц…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Thanks to Brad Lackford for assistance optimizing some of the techniques described in this manuscript.
Materials
| Amaxa nucleofector 96-well shuttle system | Lonza | AAM-1001S | |
| Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit | Lonza | V4SC-2096 | |
| RAW264.7 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-71 | |
| J774A.1 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-67 | |
| siGenome smartpool siRNA | Dharmacon | varies depending on gene | |
| Non-targeting control siRNA pool | Dharmacon | D-001206-13-20 | |
| Block-iT fluorescent oligo for electrooration | Invitrogen | 13750062 | |
| Ultrapure E. coli O111:B4 LPS | List Biological Laboratories | 421 | |
| DMEM, high glucose | Invitrogen | 11995-065 | |
| RPM1-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution (Pen/Strep) | Fisher | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| 96 well tissue culture plates | Fisher | 07-200-89 | |
| 96 well round bottom sterile plates (not coated) | Fisher | 07-200-745 | |
| Mouse IL-6 Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY406 | |
| Mouse TNFa Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY410 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| RLT Bufer | Qiagen | 79216 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74134 | |
| Vybrant Phagocytosis Assay Kit | Invitrogen | V-6694 |
References
- Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. . The innate immune response to infection. , (2004).
- Adams, D. O., Hamilton, T. A. The cell biology of macrophage activation. Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).
- Fujiwara, N., Kobayashi, K. Macrophages in inflammation. Current drug targets. Inflammation and allergy. 4, 281-286 (2005).
- Gordon, S., Martinez, F. O. Alternative activation of macrophages: mechanism and functions. Immunity. 32, 593-604 (2010).
- Martinez, F. O., Helming, L., Gordon, S. Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective. Annual review of immunology. 27, 451-483 (2009).
- Fairweather, D., Cihakova, D. Alternatively activated macrophages in infection and autoimmunity. Journal of autoimmunity. 33, 222-230 (2009).
- Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. Journal of immunology. 181, 3733-3739 (2008).
- Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. Macrophage polarization comes of age. Immunity. 23, 344-346 (2005).
- Burke, B., Lewis, C. E. . The macrophage. , (2002).
- Lee, G., Santat, L. A., Chang, M. S., Choi, S. RNAi methodologies for the functional study of signaling molecules. PloS one. 4, (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. Journal of biomolecular screening. 14, 151-160 (2009).
- Alper, S., et al. Identification of innate immunity genes and pathways using a comparative genomics approach. ProcNatl Acad Sci USA. 105, 7016-7021 (2008).
- De Arras, L., et al. An evolutionarily conserved innate immunity protein interaction network. J. Bio. Chem. , 1967-1978 (2013).
- Yang, I. V., et al. Novel regulators of the systemic response to lipopolysaccharide. Am J Respir Cell Mol Biol. 45, 393-402 (2011).
- Yang, I. V., et al. Identification of novel innate immune genes by transcriptional profiling of macrophages stimulated with TLR ligands. Molecular immunology. 48, 1886-1895 (2011).
- Yang, I. V., et al. Identification of novel genes that mediate innate immunity using inbred mice. Genetics. 183, 1535-1544 (2009).
- Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell. 15, 261-267 (1978).
- Ralph, P., Moore, M. A., Nilsson, K. Lysozyme synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines. The Journal of experimental medicine. , 1528-1533 (1976).
- Zumbansen, M., et al. First siRNA library screening in hard-to-transfect HUVEC cells. Journal of RNAi and gene silencing. 6, 354-360 (2010).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
- Aliprantis, A. O., et al. Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2. Science. 285, 736-739 (1999).
- Alexopoulou, L., Holt, A. C., Medzhitov, R., Flavell, R. A. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature. 413, 732 (2001).
- Conforti, R., et al. Opposing effects of toll-like receptor (TLR3) signaling in tumors can be therapeutically uncoupled to optimize the anticancer efficacy of TLR3 ligands. Cancer Res. 70, 490-500 (2010).
- Fernandez-Botran, R., Větvička, V. . Methods in Cellular Immunology. 8, 8 (2001).
