Mit RNA-Interferenz, um die angeborene Immunantwort in Makrophagen der Maus Untersuchen
Summary
In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.
Abstract
Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.
Introduction
In diesem Protokoll beschreiben wir effiziente Verfahren, um Gene in Maus-Makrophagen-Zelllinien unter Verwendung von siRNAs zu hemmen und die Wirkung dieser Behandlungen auf die angeborene Immunantwort zu überwachen. Diese Verfahren werden in 96-Well-Format durchgeführt, so dass für RNAi-Screens in Mittel- oder Hochdurchsatz-Mode.
In Reaktion auf eine Infektion, montieren Menschen sofort angeborenen Immunantwort und eine langsamere, aber bestimmte adaptive Immunantwort. Diese schnelle angeborenen Immunantwort beinhaltet die Rekrutierung und Aktivierung von phagozytierenden angeborenen Immunzellen einschließlich Makrophagen ein. Klassisch aktivierte Makrophagen sind im akuten Entzündungsreaktionen beteiligt und produzieren antimikrobielle Proteine und Verbindungen, Zytokine und Chemokine, und präsentieren Antigene 2,3. Alternativ aktivierte Makrophagen spielen eine Rolle bei der Regulierung der Immunität, die Aufrechterhaltung der Toleranz, die Gewebereparatur und Wundheilung 4-8. Aufgrund ihrer breiten Palette von Funktionen, Makrophagen eine Rolle bei zahlreichen Krankheiten, darunter Arteriosklerose, Arthritis und Krebs 9 spielen. Somit hat das Studium der Makrophagen für einige Zeit in einer Vielzahl von Krankheitsfelder ein Schlüsselbereich der Forschung.
Trotz ihrer großen Bedeutung in der angeborenen Immunantwort kann Makrophagen werden herausfordernde Zellen, mit zu arbeiten. Insbesondere ist es schwierig, eine effiziente Transfektion mit Lipidreagenzien in Makrophagen ohne assoziierte Toxizität 10,11 erhalten. Außerdem, selbst wenn siRNA wirksam an Makrophagen geliefert, die Robustheit der RNAi-induzierten Gens oft Knockdown kann ziemlich moderat sein und kann von Gen zu Gen variieren.
Um diese technischen Herausforderungen zu überwinden, haben wir Transfektion und Zuschlagsverfahren 12-16 in zwei Maus-Makrophagen-Zelllinien, RAW264.7 17 und J774A.1 18 optimiert. Dieser Ansatz nutzt die Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System zur Transfektion; Dieses Systemverwendet eine Kombination von Spezialreagenzien und Elektroporation von Zellen in 96-well Format 19 transfizieren. Nach der Transfektion beschreiben wir Methoden zur Zellgewinnung und Lebensfähigkeit zu maximieren und die anschließende siRNA-induzierte Gen Knockdown zu maximieren. Um den Nutzen dieses Ansatzes zu verdeutlichen, beschreiben wir ein Protokoll für siRNA auf diese Makrophagen-Zelllinien, diese Zellen zu stimulieren mit Lipopolysaccharid (LPS) und überwachen die angeborene Immunantwort auf der Ebene der Produktion von mehreren pro-inflammatorischen Zytokinen. Wir stellen Beispieldaten, in denen wir den Toll-like Rezeptor (TLR) Familie, deren Mitglieder spüren LPS und andere Erreger associated molecular patterns (PAMPs), um angeborene Immunität regulieren Ziel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es wurden zahlreiche Studien veröffentlicht, in denen einzelne Gene von siRNA in murinen Makrophagen gezielt worden. Während Lipid-vermittelte Transfektion wurde verwendet, um siRNA zur Makrophagenzelllinien auf einer individuellen Basis zu liefern, leiden diese Verfahren unter potentiellen Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit, begrenzte Knock-down, und die Variabilität von Gen zu Gen. Um robustere Assays, die verwendet werden könnten, um Gene in Mittel- oder Hochdurchsatzverfahren zielen entwickeln optimierten wir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Thanks to Brad Lackford for assistance optimizing some of the techniques described in this manuscript.
Materials
| Amaxa nucleofector 96-well shuttle system | Lonza | AAM-1001S | |
| Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit | Lonza | V4SC-2096 | |
| RAW264.7 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-71 | |
| J774A.1 mouse macrophage cell line | ATCC | TIB-67 | |
| siGenome smartpool siRNA | Dharmacon | varies depending on gene | |
| Non-targeting control siRNA pool | Dharmacon | D-001206-13-20 | |
| Block-iT fluorescent oligo for electrooration | Invitrogen | 13750062 | |
| Ultrapure E. coli O111:B4 LPS | List Biological Laboratories | 421 | |
| DMEM, high glucose | Invitrogen | 11995-065 | |
| RPM1-1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution (Pen/Strep) | Fisher | SV30010 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| 96 well tissue culture plates | Fisher | 07-200-89 | |
| 96 well round bottom sterile plates (not coated) | Fisher | 07-200-745 | |
| Mouse IL-6 Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY406 | |
| Mouse TNFa Duoset ELISA kit | R&D Biosystems | DY410 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma-Aldrich | F7378 | |
| RLT Bufer | Qiagen | 79216 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74134 | |
| Vybrant Phagocytosis Assay Kit | Invitrogen | V-6694 |
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