Молекулярная сигналов через эстрогена и микроРНК являются критическими в развитии рака молочной железы и роста. Эстроген активирует рецепторы эстрогена, которые транскрипционные факторы. Многие транскрипционные факторы могут регулировать экспрессию микроРНК, и эстроген-регулируется микроРНК можно профилировать с использованием различных методов масштабные.
Эстроген играет жизненно важную роль в развитие молочных желез железы и прогрессирования рака молочной железы. Это посредником свою функцию путем связывания и активации рецепторов эстрогена (ERS), ERα и ER-. ERα часто активируется в рака молочной железы и приводит пролиферацию клеток рака молочной железы. ЭКР функционировать как факторы транскрипции и регулируют экспрессию генов. В то время как регулирование ERα в белок-кодирующих генов хорошо известна, ее регулирование некодирующих микроРНК (микроРНК) меньше изучены. микроРНК играют важную роль в пост-транскрипционной регуляции генов, подавляя их перевод или ухудшения качества их мРНК. микроРНК может функционировать в качестве онкогенов или опухолевых супрессоров и также подтверждаете биомаркеров. Среди микроРНК анализов имеющихся, микрочипов и количественный реальном времени полимеразной цепной реакции (КПЦР) широко используется для обнаружения и количественного определения уровней микроРНК. Для идентификации микроРНК регулируются сигнализации эстрогена в рака молочной железы, тыс.EIR выражение в ERα-позитивных клеток рака молочной железы линий сравнивали до и после эстроген-активация с использованием как μParaflo-микрофлюидных микрочипов и Dual меченых зондов-низкой плотности массивы. Результаты были проверены с использованием конкретных КПЦР анализов, применения как органического красителя в основе и Dual меченых зондов на основе химии. Кроме того, временной точке анализа была использована для выявления положения с течением времени. Преимущества анализа подхода микроРНК, используемые в этом исследовании является то, что она позволяет быстрый скрининг правил зрелые микроРНК в многочисленных образцов, даже при ограниченных количествах образцов. Макет, в том числе конкретных условий для культивирования клеток и лечения эстроген, биологических и технических повторах, и крупномасштабного скрининга с последующим углубленные подтверждения с использованием отдельных методов, обеспечивает надежное обнаружение правил микроРНК, и устраняет ложные срабатывания и другие артефакты. Правда, мутировавший или неизвестных микроРНК или правилам, на первичном и предшественника транскриптов Левел, не будут обнаружены. Метод, представленный здесь представляет собой тщательное расследование эстроген-опосредованной регуляции микроРНК.
Эстроген является гормоном, который важно при разработке молочной железы. Эстроген также играет важную роль в разработке, обслуживании, риска и лечения рака молочной железы 1. Эстроген оказывает свою функцию путем связывания с ЧН, которые транскрипционные факторы и регулируют конкретные гены-мишени. Из двух вариантов рецептора, ERα имеет важное значение для эстроген-зависимой пролиферации клеток рака молочной железы. Большинство рака молочной железы являются ERα-положительных и зависит от эстрогена для роста. Это сделало сигнализации эстрогена и ERα цель для лечения в гормон-рецепторного положительный рак молочной железы. Понимание основной механизм ERα важно улучшить результаты лечения, преодолеть сопротивление к лечению, и понять, как развивается рак молочной железы.
микроРНК играют важную роль в клеточных функций в связи с их большое влияние в регулировании посттранскрипционной генов. микроРНК являются 19-24 нуклеотидов короче говоря, одноцепочечной, Некодирующих РНК, которые сначала транскрибируются РНК-полимеразы II в первичных транскриптов микроРНК (PRI-микроРНК). Они обрабатываются в ядре по Drosha в короткие шпильки предшественников-микроРНК (предварительно микроРНК) и затем обрабатываются Dicer и сформировать отдельные пряди, чтобы сформировать зрелые микроРНК в цитоплазме. Одноцепочечной зрелые микроРНК передаются Argonaute белками с образованием RISC комплекс. Затем микроРНК может гибридизоваться с 3'-нетранслируемой области (3'-UTR) от мРНК-мишени, что приводит к пост-транскрипционной регуляции путем блокирования или перевод деградации мРНК-мишени 2.
В связи с той важной роли, что и эстроген и микроРНК играют в опухолевой прогрессии, выявления микроРНК, связанных с нормальной или нарушенной сигнализации эстрогена важно в целях повышения наше понимание развития и улучшения лечения рака молочной железы. Хотя есть хорошее понимание того, как ERα регулирует белок-кодирующих генов, расширениеи подробная информация о некодирующих РНК правила еще предстоит тщательно расследованы. Первоначальные исследования, направленные на выяснение ERα регулирование микроРНК в рак молочной железы клеточных линий дали противоречивые результаты, даже когда тот же клеточная линия была проанализирована 3-6. Это может быть результатом различных методов лечения, биологические колебания, использования различных методов и на то, что небольшой размер микроРНК сделать их сложно анализировать. Здесь это протокол, который контролирует для вариаций и методов артефактов описывается.
Чтобы определить, какие микроРНК регулируются эстрогена, профилирование четко определенной модели рака молочной железы из ERα деятельности является первым шагом. Несколько клеточные линии были получены от опухолей молочной железы человека ERα-положительных, которые зависят от эстрогена, аналогичной большинства клинических случаев рака молочной железы. Молекулярные свойства двух из этих клеточных линий, T47D и MCF7, в том числе экспрессии ERα и ее ниже по потоку цели,рецептор гормона прогестерона (PR), отсутствие экспрессии мембранного рецептора HER2, наряду с выражением эстроген-чувствительных и просвета-эпителиальных генов дифференцировки, сделать их пригодными в качестве моделей для просвета подтипа опухолей молочной железы 7-10. 17β-эстрадиол (Е2) является доминирующей формой эстрогена, а концентрации и временные точки для оптимального активации транскрипции из ERα были охарактеризованы в нескольких исследованиях. В этом протокол 10 нМ E2 лечения в течение 24 ч используется и T47D и MCF7 в качестве моделей для ERα деятельности в клетках рака молочной железы 1. Кроме того, зависимые от времени правила микроРНК может быть специально анализировали в интервале времени, например 1-72 часов.
Во-вторых, анализ микроРНК имеет отдельные проблемы, отчасти из-за своих коротких размеров. микроРНК не очень хорошо сохраняются в общей подготовке РНК когда обычные гуанидиния thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol РНК осадков выполняются, или когда йAndard очищения столбцов используются. Особые меры предосторожности должны быть приняты для поддержания или обогатить для меньшего фракции РНК. При увеличении объема изопропанола, понижение температуры перед центрифугированием (-80 ° C) и опуская промывку в 70% этаноле, удерживающий микроРНК может быть повышена во время осаждения. Или, конкретные столбцы и буферы для высококачественной и надежной подготовке микроРНК-содержащих общей РНК могут быть использованы. Кроме того, для самого анализа, их короткие размеры создают проблемы. Для генома микроРНК скрининга, есть три общих микроРНК профилирования методов на выбор: микрочипы, КПЦР и следующего поколения секвенирования. Каждый метод может быть выполнена с использованием нескольких различных платформ, а также различные препараты образца требуется, каждый с различными рисков введения артефактов. В микроРНК микрочипов, слайд имеются пятна или синтезированы с тысячами олигонуклеотидов. Эти олигонуклеотиды использовали в качестве зондов, и каждый из зондас предназначен для гибридизации с определенной последовательности микроРНК. Подготовка образца для микрочипов, как в ходе данного исследования, в первую обогащает для микроРНК, а затем вводит Cy5 и Cy3 маркировку на микроРНК. Микрочипов дает возможность наблюдать относительные уровни экспрессии большого числа генов одновременно, быстро и подходит для скрининга большого количества образцов, но может только анализировать последовательности присутствует на микрочипе и например не обнаружить изменения в неизвестной или мутировал микроРНК. Микрочипов анализ проводили, как в данном протоколе также требует относительно больших количеств, около 5 мкг, из общей РНК в образце для анализа. Низкая плотность КПЦР микроРНК профилирования требуется меньше материала (700 нг / образец и повторить), и позволяет для обнаружения и количественного определения микроРНК. Уровни транскриптов может быть определен, а количество может быть абсолютным или количество относительное количество. Анализ КПЦР сначала требуется преобразование микроРНК в кДНК, здесь с помощью петельчатуюгрунт для каждого конкретного микроРНК, обеспечивающих анализ только зрелые микроРНК. Это создает более длинный шаблон, который может быть усилен с использованием конкретных микроРНК прямого праймера и универсальный обратного праймера, комплементарного последовательности петлей, и могут содержать включение двойной меченым зондом для специфичности. КПЦР могут быть использованы в формате низкой плотности, где сотни микроРНК могут быть обнаружены в параллель с использованием одного или нескольких пластин 384-луночный с отдельными пар праймеров в каждую лунку 11. Секвенирование следующего поколения, с другой стороны, это единственный из этих методов, что позволяет для открытия новых, мутированных или отредактированных микроРНК, поскольку все РНК в образце можно секвенировать 11. Этот метод, однако, требует нескольких шагов, помогут малые РНК и производят небольшую библиотеку РНК с помощью нескольких шагов компоновщика лигирования и операции очистки с последующими усовершенствованных рисков модуляции их относительные уровни экспрессии между образцами. Он также требует значительных bioinformatiCS анализ. Учитывая различные методы для микроРНК профилирования, наиболее подходящий метод зависит от приложений. Microarrays являются наиболее подходящими, когда материал является относительно изобилии, и интерес, чтобы определить дифференциальное выражение уже известных микроРНК. Низкая плотность КПЦР массивы являются наиболее подходящими, когда ограниченное количество образца доступен и высокая чувствительность с низким выразил микроРНК требуется. Секвенирование является наиболее подходящим, когда анализ неизвестных микроРНК, мутировавших или различных изоформ в микроРНК требуется.
При изучении регулируемых эстрогенами микроРНК при раке молочной железы, два модели клетки линии используются, T47D и MCF7, где большое количество РНК легко доступны. Каждая ячейка линия была проанализирована в культурах реплицированными клеток с использованием различных отрывков, каждый в технических повторах лечения. Это позволяет для надежной обнаружения воспроизводимо, ERα регулируемых микроРНК. Относительные уровни экспрессии микроРНК были сравнены с использованием как микроРНК микрочипов иДвойные меченых зондов – массивы низкой плотности (DLP-LDA) и подтверждено результаты с определенной количественной ПЦР с использованием как органического красителя и DLP химии. правила микроРНК были затем дополнительно проанализированы в временных рядов, чтобы определить их точное регулирование с течением времени, что может помочь дифференцировать случайные или циркадные вариации от эстроген-индуцированной правил, и указать первичные эффекты от вторичных эффектов. Bioinformatical сравнения с хроматин-связывания исследований ERα может способствовать помощь в дифференциации первичной против вторичных эффектов. Анализ привело к надежной оценки правил микроРНК, где он может быть установлено, что после 24 часов лечения E2 белок-кодирующих транскриптов легко регулируется, но зрелые микроРНК не были затронуты 1. Тем не менее, не исключено, что микроРНК регулируются на более поздних временных точках, как показано в порядке временной последовательности анализа выбранных микроРНК 1. Детали должны быть дополнительно изучены и протокол, представленные здесь обеспечивает Robusт способ изучения гормональной регуляции зрелых микроРНК в линиях клеток рака молочной железы.
Определение механизма гормональной регуляции микроРНК в клетках рака молочной железы может послужить платформой для понимания этой болезни и может обеспечить потенциальную обработку для рака молочной железы. Культивирование этих клеток, чтобы обеспечить оптимальные условия для действия гормонов является очень важным. Здесь это протокол, который гарантирует, что гормон интерес (эстроген) был исключен до лечения и что оптимальная доза Е2 был использован в течение соответствующего времени в процессе лечения было описано. Другие гормональные и роста эффекты факторов были сведены к минимуму путем постепенного снижения сывороточные уровни и с помощью DCC-FBS, который FBS, которые были лишены большей части своей гормона, цитокинов и факторов роста. Фенолового красного носители дополнительно используется, чтобы минимизировать другие негормональной эффектов, при условии, что фенол красный, как сообщается, имеют эстрогенной активностью и влиять на определенные функции в клеточных линиях 20,21. Время обработки клеток на гормон имеет большое значение. Для эстроген-связана регуляции генов, было ранее показали, что 24-hrexposure производить значительную реакцию прямых генов-мишеней в раковых клетках молочной железы 1,18. С микроРНК транскрибируются РНК-полимеразы II, как мРНК, можно предположить, что это подходящая точка времени, чтобы обнаружить прямое регулирование также микроРНК. Это еще предстоит определить, если и как эти микроРНК влияют на экспрессию этих известных целей ER в клетках рака молочной железы.
микроРНК выражение профилирование может быть сложным из-за относительной небольшой размер микроРНК, на то, что последовательность зрелого микроРНК можно найти также в PRI-микроРНК и предварительной микроРНК, и из-за неоднородности в их содержании 22 ГК. Несколько методов профилирования и химические были использованы для преодоления этой трудности. Среди них различные подходы микрочипов и анализа КПЦР (рис. 2). Хотя микрочипов широко принята для всей генома анальныйлиз, она может обеспечить ложные негативы и существуют различия между доступных платформах, начиная от химии к технологии печати 23. Также процесс нормализации представляет собой проблему при анализе сравнительно мало генов микроРНК, которые учитываются в тысячах сравнению с десятками тысяч транскриптов мРНК. КПЦР, с другой стороны, является более чувствительным, а лучше меньше применяется, когда гены должны быть рассмотрены. Однако, когда выполняется в больших пластин 384-а, только с одним технической репликации за тарелку, несколько плиты должны быть проанализированы для каждого образца, что делает анализ дорогостоящим. Кроме того, в наших руках, многие больше ложных отрицательных результатов были получены с использованием анализа DLP-LDA сравнению с микрочипом. Учитывая, что последовательность зрелого микроРНК присутствует в PRI-микроРНК и последовательностей предварительно микроРНК, представляет интерес для различения этих транскриптов с использованием методов ПЦР 24. DLP зонды доступны также для предварительного микроРНК и зрecific праймеры также могут быть разработаны, чтобы исключить различные зрелые или предшественник варианты использования органического красителя технологии КПЦР.
КПЦР является золотым стандартом для проверки дифференциального выражения от профилирования результаты. Эффективность кПЦР, однако, зависит от нескольких параметров, включая выделения РНК, целостности РНК (качество), синтеза кДНК, грунтовки дизайна, способа обнаружения (химия), и опорного гене данных нормализации 1,22,25. Опции для дизайна праймеров для анализа микроРНК очень ограничен, так как короткая длина последовательности микроРНК не дает места для большого альтернативной конструкции праймера, и только один праймер можно питал в этой короткой последовательности. Таким образом, потребность в альтернативных манипуляций, как показано на рисунке 2. Технические повторов важны для проверки надежности способа амплификации и используемого способа. Биологических повторяет требуются для представления общей биологической вариациейп, в том числе переменную ответ на лиганд лечение, и показать, что эффекты, наблюдаемые в клетке воспроизводимы. Основываясь на нашем опыте, изменения в микроРНК выражения между культурами клеток может произойти. Обычно эти различия меньше, чем в 1,3 раза, а средняя значений и соответствующих SD идентифицирует природных и техногенных изменений. Это изменение может быть результатом различных факторов, включая, плотности клеток и тем, что функции клетки может изменить от пассажа к пассажу. Для выявления статистически значимых выражений в результате лечения лиганда, широко распространенным значимость, когда значение р меньше 0,05. Здесь были использованы Т-тест студента на биологических и технических повторов с помощью двустороннее распределение и Двухвыборочная неравные параметры дисперсии. Другие параметры Т-тест существуют, и выбор зависит от экспериментальной установки 26.
Подробный протокол в оценке гормональные правила зрелой микроРНКН.А. в раковых клетках молочной железы была оказана. Важные технологии и химии в профилирования и подтверждение этих микроРНК выражения были четко объяснены. Выбранная технология для изучения микроРНК в клетках рака молочной железы в конечном счете зависит от того, что именно находится в стадии расследования.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарны доктору Xiaolian Гао, Университете Хьюстона, за консультирование микрочипов платформы LC наук микроРНК, доктора Карин Edvardsson, Каролинского института, Швеция, и д-р Eylem Aydogdu, Университете Хьюстона, для обмена своим опытом микроРНК . Исследования сообщили в настоящей публикации при поддержке Национального института рака из Национального института здоровья в рамках премии Количество R01CA172437. Содержание является исключительной прерогативой авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здравоохранения. Эта работа также была поддержана грантами от Техаса Emerging Technology Fund, в рамках Соглашения не. 300-9-1958.
DMEM | Life Technologies | 11885092 |
F12 | Life Technologies | 11765054 |
FBS | Sigma-Aldrich | F0926-500ML |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 |
phenol red-free DMEM | Life Technologies | 11054020 |
Ultrapure Water | EMD Millipore | Specific equipment |
DCC-FBS | Sigma-Aldrich | F6765-500ML |
100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 |
PBS tablet | Medicago, Accurate chemicals | Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100) |
17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
ICI 182,780 | Sigma-Aldrich | I4409 |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-600ML |
T47D or MCF7 cells lines | American Type Culture Collection (ATCC) | T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22) |
T-75 flask | VWR International LLC | BD353136 (vented cap) |
Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300062 |
Serological pipet | VWR International LLC | 53300. For 5mL (53300-421) |
Countess Cell Counting chamber | Life Technologies | C10228 |
Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | C10227 |
100 mm plates | VWR International LLC | 25382-166 |
Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol) | Life Technologies | 15596026 |
Rubber cell scraper | VWR International LLC | 82050-470 |
Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol) | Qiagen | 217004 |
Rnase-Free DNase I kit (DNA degradation) | Qiagen | 79254 |
RNase-free water (Nuclease-free water) | Thermoscientific | SH30538.02 |
Nanodrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND-1000 |
Agilent RNA 6000 Nano Assay kit | Agilent | 5067-1512 |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938C and for software (G2946) |
All primers (except TaqMan primers) | Integrated DNA Technologies | Specific per order for each gene/miRNA |
First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit) | Life Technologies | 18080085 |
MicroAmp Fast 96-Well reaction plate | Life Technologies | 4346906 |
Fast Optical Adhesive Covers | Life Technologies | 4311971 |
2X SYBR green PCR master mix (Cyanine dye) | Life Technologies | 4385612 |
7500 Fast Real-Time PCR System and software | Life Technologies | 4351106 |
μParaflo Microfluidic Biochip Technology | LCSciences | MRA-1001 and AS-2001(for result analysis) |
DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set) | Life Technologies | 4400928 |
Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit | Life Technologies | 4366596 |
GeneAmp PCR System 9700 thermocycler | Life Technologies | 4310899 |
Dual Labeled Probes (TaqMan) 2X Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG | Life Technologies | 4324018 |
7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 |
SDS and RQ manager softwares | Life Technologies | 4444202 |
NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit | Life Technologies | MIRC-50 |
10X DPL (TaqMan) RT primers | Life Technologies | Specific for each miRNA |
20X DPL (TaqMan) real-time assay primer | Life Technologies | Specific for each miRNA |