JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
español

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Perfiles de microARN regulados por estrógeno en las células del cáncer de mama

Published: February 21, 2014
doi:
10.3791/51285
,
1Center for Nuclear Receptors and Cell Signaling, Department of Biology and Biochemistry,University of Houston

Summary

Molecular señalización a través de estrógeno y microRNAs son fundamentales en el desarrollo y el crecimiento del cáncer de mama. El estrógeno activa los receptores de estrógeno, que son factores de transcripción. Muchos factores de transcripción pueden regular la expresión de microRNAs, y microARN regulados por estrógenos se puede perfilar el uso de diferentes técnicas a gran escala.

Abstract

El estrógeno juega un papel vital en el desarrollo de la glándula mamaria y la progresión del cáncer de mama. Es media su función mediante la unión a y la activación de los receptores de estrógenos (RE), ERα, y ERß. ERα es upregulated frecuencia en el cáncer de mama y las unidades de la proliferación de células de cáncer de mama. Las exigencias ambientales funcionan como factores de transcripción y regulan la expresión génica. Mientras la regulación de ERα de genes codificadores de proteínas está bien establecida, la regulación de las no codificantes microARN (miARN) es menos explorado. miRNAs juegan un papel importante en la regulación post-transcripcional de genes, la inhibición de su traducción o degradación de su ARNm. miRNAs pueden funcionar como oncogenes o supresores tumorales y también son prometedores biomarcadores. Entre los ensayos de los genes miARN disponibles, microarrays y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR) se han utilizado ampliamente para detectar y cuantificar los niveles de los genes miARN. Para identificar miRNAs regulados por la señalización de los estrógenos en el cáncer de mama, thexpresión eir en líneas celulares de cáncer de mama ERα-positivos se compararon antes y después de los estrógenos-activación utilizando tanto los microarrays μParaflo-microfluidos y doble etiquetado sondas arrays de baja densidad. Los resultados fueron validados utilizando qPCR ensayos específicos, aplicando tanto tinte basado Cyanine y doble etiquetado química basada en sondas. Además, se utilizó un ensayo de punto de tiempo para identificar las regulaciones a través del tiempo. Ventajas de la utilización del ensayo miRNA utilizado en este estudio es que permite una detección rápida de los reglamentos madura miARN en numerosas muestras, incluso con cantidades de muestra limitados. La disposición, incluidas las condiciones específicas para el cultivo de células y el tratamiento con estrógenos, biológicos y técnicos repeticiones, y el cribado a gran escala seguida por confirmaciones en profundidad el uso de técnicas diferentes, garantiza una detección robusta de las regulaciones miARN, y elimina los falsos positivos y otros artefactos. Sin embargo, los miRNAs mutados o desconocidos, o regulaciones de la leve transcrito primario y precursorl, no será detectado. El método presentado aquí representa una investigación a fondo de la regulación de los genes miARN mediada por estrógenos.

Introduction

El estrógeno es una hormona que es importante durante el desarrollo de la glándula mamaria. El estrógeno también juega un papel importante en el desarrollo, el mantenimiento, el riesgo y el tratamiento del cáncer de mama 1. El estrógeno ejerce su función mediante la unión a las exigencias ambientales, que son factores de transcripción y regulan los genes diana específicos. De las dos variantes del receptor, ERα es esencial para la proliferación dependiente de estrógenos de células de cáncer de mama. La mayoría de los cánceres de mama son ERα-positivo y depende de los estrógenos para crecer. Esto ha hecho que la señalización de estrógenos y ERα un objetivo para el tratamiento en-receptor de la hormona del cáncer de mama positivo. Entender el mecanismo subyacente de ERα es importante para mejorar los resultados del tratamiento, vencer la resistencia al tratamiento, y entender cómo se desarrolla el cáncer de mama.

miRNAs juegan un papel crítico en las funciones celulares, debido a su gran impacto en la post-transcripcional regulación de genes. miRNAs son 19-24 nucleótidos corta, de cadena sencilla, RNAs no codificantes que se transcriben primero por la ARN polimerasa II en transcripciones primarias miARN (pri-miARN). Ellos se procesan en el núcleo por Drosha en precursoras-miRNAs-horquilla corta (pre-miARN) y luego procesados ​​por Dicer y se separaron en cadenas sencillas para formar miRNAs maduros en el citoplasma. Los miRNAs maduros de una sola hebra se transfieren a las proteínas Argonaute para formar complejo RISC. Entonces, los miRNAs pueden hibridar con las regiones 3 'no traducidas (3'-UTR) de un ARNm diana, lo que lleva a la regulación post-transcripcional mediante el bloqueo de la traducción o degradar el ARNm diana 2.

Debido al importante papel que tanto estrógeno como miRNAs juegan en la progresión tumoral, la identificación de miRNAs asociados con la señalización normal o alterado el estrógeno es importante con el fin de mejorar nuestra comprensión del desarrollo y mejorar el tratamiento del cáncer de mama. Si bien existe una buena comprensión de cómo ERα regula los genes codificadores de proteínas, la extensióny los detalles de los reglamentos de ARN no codificante queda por investigar a fondo. Los primeros estudios con el objetivo de aclarar la regulación ERα de miRNA en líneas celulares de cáncer de mama han arrojado resultados contradictorios, aún cuando la misma línea celular se ha analizado 3-6. Esto puede ser el resultado de tratamientos diferentes, variaciones biológicas, el uso de diferentes técnicas, y el hecho de que el pequeño tamaño de miRNAs los hacen difíciles de analizar. Aquí, un protocolo que controla las variaciones y artefactos método se describe.

Para identificar qué miRNAs están reguladas por los estrógenos, el perfil de un modelo de cáncer de mama bien definido de la actividad ERα es un primer paso. Varias líneas de células han sido generados a partir de los tumores de cáncer de mama humano ERα-positivo, que son dependientes de los estrógenos similar a la mayoría de los cánceres de mama clínicos. Las propiedades moleculares de dos de estas líneas celulares, T47D y MCF7, incluyendo la expresión de ERα y su diana aguas abajo,el receptor de la hormona de progesterona (PR), una falta de expresión de receptor de membrana de HER2, junto con la expresión de los genes de diferenciación de estrógeno-sensibles y-luminales epiteliales, las hace adecuadas como modelos para el subtipo luminal de los tumores de mama 7-10. 17β-estradiol (E2) es la forma dominante de estrógeno, y las concentraciones y puntos de tiempo para la activación transcripcional óptima de ERα se han caracterizado en múltiples estudios. En este protocolo de tratamiento 10 nM E2 durante 24 horas se usa y T47D y MCF7 como modelos para la actividad ERα en células de cáncer de mama 1. Además, las regulaciones miARN dependientes del tiempo se pueden analizar específicamente en un intervalo de tiempo de, por ejemplo 1-72 horas.

En segundo lugar, el análisis de miRNA tiene retos diferentes, en parte debido a sus tamaños cortos. miRNAs no están bien conservados en la preparación de ARN total cuando se realizan guanidinio thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol precipitaciones regulares de ARN, o cuando erse utilizan purificaciones de columna Andard. Precauciones especiales deben tomarse para mantener o enriquecer la fracción más pequeña de ARN. Al aumentar el volumen de isopropanol, disminuyendo la temperatura antes de la centrifugación (-80 ° C), y omitiendo el lavado en etanol al 70%, la retención de miRNAs se puede mejorar durante la precipitación. O, columnas y tampones específicos para una preparación de alta calidad y robusto de ARN total que contiene los genes miARN-pueden ser utilizados. También para el análisis en sí, sus tamaños cortos crean retos. Para el cribado miRNA de todo el genoma, hay tres miRNA comunes técnicas de perfiles para elegir: microarrays, qPCR, y la secuenciación de próxima generación. Cada técnica se puede realizar utilizando varias plataformas diferentes, y se requieren diferentes preparaciones de muestras, cada una con diferentes riesgos de introducción de artefactos. En miARN microarrays, una diapositiva es descubierto o sintetizado con miles de oligonucleótidos. Estos oligonucleótidos se utilizan como sondas, y cada uno de la sondas está diseñado para hibridar con una secuencia de los genes miARN en particular. La preparación de la muestra para microarrays, como se realizó en este estudio, primero enriquece para miRNAs y luego introduce el etiquetado Cy5 y Cy3 en los miRNAs. Microarray da la oportunidad de observar los niveles relativos de expresión de un gran número de genes simultáneamente, es rápido y adecuado para el cribado de gran número de muestras, pero sólo puede analizar las secuencias presentes en el microarray y por ejemplo no detectar cambios en la desconocida o mutado miRNAs. Análisis de microarrays como se realizó en este protocolo también requiere cantidades relativamente grandes, de aproximadamente 5 microgramos, de ARN total por muestra para el análisis. De baja densidad qPCR miARN perfiles requiere menos material (700 ng / muestra y replicar), y permite la detección y cuantificación de miRNAs. Los niveles de transcripción pueden ser determinados, y la cantidad puede ser una cantidad absoluta o una cantidad relativa. análisis qPCR requiere en primer lugar la conversión de miRNA en cDNA, aquí mediante el uso de un buclecartilla para cada miARN específicas que garanticen el análisis de sólo madurar miRNA. Esto genera una plantilla ya que puede amplificarse utilizando un cebador directo-miARN específica y un cebador inverso universal, complementaria a la secuencia de bucle, y puede albergar la inclusión de una sonda de doble etiquetado para la especificidad. qPCR se puede utilizar en un formato de baja densidad donde cientos de miRNAs se pueden detectar en paralelo usando una o varias placas de 384 pocillos con pares de cebadores individuales en cada pocillo 11. Secuenciación de próxima generación, en cambio, es la única de estas técnicas que permiten el descubrimiento de la novela, miRNAs mutados o editados, ya que todos los ARN en una muestra pueden ser secuenciados 11. Esta técnica, sin embargo, requiere de múltiples medidas para enriquecer ARN pequeños y producir una pequeña biblioteca de ARN mediante varios pasos de la ligadura de enlazador y purificaciones con posteriores mejorados riesgos de la modulación de los niveles de expresión relativa entre las muestras. También requiere bioinformati significativasanálisis cs. Dadas las diversas técnicas para miARN perfiles, la técnica más apropiada depende de las aplicaciones. Microarrays son los más adecuados cuando el material es relativamente abundante y el interés es definir la expresión diferencial de miRNAs ya conocidos. De baja densidad matrices qPCR son los más adecuados cuando una cantidad limitada de muestra está disponible y se requiere una alta sensibilidad de miRNAs bajos expresó. La secuenciación es más adecuado cuando se requiere el análisis de miRNAs desconocidos, mutado o diferentes isoformas de un miARN.

En el estudio de miRNAs regulados por estrógenos en el cáncer de mama, se utilizan dos líneas de células modelo, T47D y MCF7, donde grandes cantidades de ARN están fácilmente disponibles. Cada línea celular se analizó en cultivos de células replicadas utilizando diferentes pasajes, cada uno en repeticiones técnica de tratamiento. Esto permite la detección robusta de reproducible, miRNAs regulados ERα. Los niveles relativos de expresión de miARN se compararon utilizando tanto miARN microarrays yLas sondas marcadas dobles – arrays de baja densidad (DLP-LDA) y validaron los resultados con la PCR cuantitativa utilizando tanto tinte Cyanine y químicas DLP. reglamentos miARN fueron analizadas más en el tiempo de la serie para definir su regulación exacta con el tiempo, lo que puede ayudar a diferenciar las variaciones aleatorias o circadianos de las regulaciones inducidos por estrógeno, e indicar los efectos primarios de los efectos secundarios. Comparaciones bioinformatical con estudios de unión a la cromatina de ERα pueden ayudar aún más en la diferenciación de primaria frente a los efectos secundarios. El ensayo dio lugar a una evaluación fiable de la normativa miARN donde se podría establecer que, después de tratamiento E2 24 hr codificación de proteínas transcripciones fueron reguladas fácilmente pero miRNAs maduros no fueron afectados 1. Sin embargo, es posible que los miRNAs están regulados en los puntos de tiempo posteriores, como se demuestra en el análisis de series de tiempo de miRNAs seleccionados 1. Los detalles deben estudiarse más a fondo y el protocolo presentado aquí proporciona una robust manera de estudiar la regulación hormonal de miRNAs maduros en líneas celulares de cáncer de mama.

Protocol

1. Preparación de Cultivo Celular Medios Para T47D línea celular medios de cultivo: Mezclar 500 ml de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con 500 ml F12 [DMEM/F12 (01:01)] en un autoclave de 1 l botella. Añadir 50 ml de suero fetal bovino (esto hace que 5% de FBS), y luego 10 ml de penicilina estreptomicina (esto hace que 1% de plagas). Mezcle el contenido completo. Almacenar a 4 ° C. Para MCF7 línea celular medios de cultivo: Mezclar 500 ml de DMEM con 25 ml de FBS (5% de FBS), y luego 5 ml de penicilina estreptomicina (1% de plagas). Almacenar a 4 ° C. Por medio de cultivo reducido en suero: Para T47D: Mezclar 500 ml de fenol DMEM libre de rojo con F12 500 ml (1:1) en un autoclave de 1 l botella, y añadir 50 ml de la tratado con carbón vegetal (DCC) de FBS recubierto con dextrano para 5% DCC-FBS. Hacer una botella separada con 5 ml DCC-FBS 0,5% DCC-FBS. A continuación, añadir 10 ml de la plaga (1% PEST) a cada botella. Mezcle el contenido completo, store a 4 ° C. Para MCF7: Mezclar 500 ml de fenol DMEM libre de rojo con 5 ml de 100x L-glutamina (200 mM de concentración final). Añadir 25 ml de DCC-FBS (5% DCC-FBS). Hacer una botella separada con 2,5 ml DCC-FBS (0,5% DCC-FBS). A continuación, añadir 5 ml de la plaga (1% PEST) a cada botella. Mezcle el contenido por completo, se almacenan a 4 ° C. Para solución salina solución tamponada con fosfato (PBS): Llene una botella de vidrio tratada en autoclave de 1 l con agua potable y en agua destilada. Añada una tableta de PBS y agitar de vez en cuando hasta que la tableta se haya disuelto. Autoclave solución de PBS y se almacena a temperatura ambiente. Preparación de las poblaciones de ligandos: Preparar una solución madre 100 mM de E2 por disolución de 2,72 mg de 17β-estradiol en 100 l de etanol o DMSO en un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 ml, y mezclar el contenido suavemente. Girar brevemente y hacer diluciones en serie (1:10) para dar 10 mM, 1 mM, y 0,1 mM de stock Concentrnes que utilizan el disolvente. Guarde todas las soluciones madre E2 a -20 ° C. Preparar una solución madre 100 mM de ICI por disolución de 6,07 mg de ICI 182.780 en 100 l de EtOH o DMSO en un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 ml, y mezclar el contenido suavemente. Girar brevemente y hacer diluciones en serie (1:10) para dar 10 mM, 1 mM, 0,1 mM concentraciones de archivo utilizando el disolvente. Guarde todas las soluciones madre ICI a -20 ° C. El vehículo es el disolvente (etanol o DMSO). Coloque 0,5-1 ml de etanol al 100% o DMSO en un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 ml, y se almacena a -20 ° C. 2. Cultivo de células y Tratamiento Realizar cada tratamiento en placas dobles o triplicados para técnicos repeticiones. Repita el procedimiento de cultivo celular y el tratamiento mediante un pasaje diferente de la misma línea celular, que serviría como una réplica biológica de esta línea celular. Repita el procedimiento con una línea celular diferente replicar resultados en más de una línea celular. Todas las técnicas de cultivo celular deben realizarse en condiciones estériles en una campana de flujo laminar. Inicio del cultivo celular Calentar los medios de comunicación a 37 ° C en un baño de agua caliente estéril. Descongelar un vial congelado de células T47D o MCF7. Limpie el exterior del vial y de la botella de medios con etanol al 70%, y luego se coloca tanto vial y la botella en campana de flujo laminar estéril. Etiquete un estéril matraz T-75 en consecuencia (en la campana). Añadir 12-15 ml de medios de comunicación apropiados en el matraz con una pipeta serológica estéril (asegúrese de que la superficie está completamente cubierta con los medios de comunicación). Transferencia de las células del vial al matraz, y mezclar suavemente. Colocar el frasco en una incubadora a 37 ° C, se suministra con 5% de CO 2. Preparación de las células para el tratamiento Tome células de la incubadora y observar bajo un microscopio para asegurar que las células son al menos 80% de COnfluent. Esto es para asegurar que hay suficientes células para el experimento. Traslado matraz para campana estéril. Retire el medio de matraz utilizando una pipeta Pasteur estéril conectado a un vacío. Lave suavemente las células unidas dos veces con PBS. Añadir 1 ml de tripsina-EDTA caliente al matraz, y poner matraz en la incubadora durante 2 min. Esto es para hacer que las células se desprenden del matraz. Añadir aproximadamente 3-4 ml de medio cálidos apropiadas al matraz y triturar las células separadas utilizando una pipeta serológica de 5 ml. Se tritura mediante la adopción de las células en la pipeta serológica y la liberación de las células con la punta de la pipeta se coloca contra la parte inferior del frasco para aumentar la presión. Esto es para romper las células aparte en células individuales. Contar las células, por ejemplo, utilizando un contador de células, según el protocolo del fabricante. Etiquetar las placas de 100 mm (según sea necesario) y añadir aproximadamente 10 ml de medio a las placas. Placa de aproximadamente 2,0 x 10 6 células / placa. Distribuir células por GEntle remolinos de las placas. Se incuban las células durante 24-48 horas, hasta aproximadamente el 80% de confluencia. Al 80% de confluencia, lavar las células dos veces con PBS, y agregar los 5% medios DCC-FBS apropiados. Entonces, incubar las células durante 24 horas. Después de 24 horas, lavar las células dos veces con PBS, y agregar los 0.5% de medios DCC-FBS apropiados. A continuación, se incuban las células durante 48 horas más. Célula de tratamiento Después de 48 horas, lavar las células dos veces con PBS. Asegúrese de extraer la mayor cantidad de PBS como sea posible. En un tubo cónico de 15 ml, añadir 10 ml de 0,5% de medios DCC-FBS apropiados. Luego, añadir 1 l de ligando de stock 0,1 mM (E2 o ICI) para una concentración final de 10 nM. Además, añadir 1 l de vehículo a 10 ml de medio en un tubo separado para el experimento de control. Mezcle el contenido en el tubo con cuidado y añadir a las células de la placa. Esto debería ser un ligando por placa. Se incuban las células para el punto de tiempo elegido (0-72 hr). <p class = "jove_title"> 3. La extracción de RNA y Control de Calidad La extracción de RNA Después de terminar el tratamiento para el período de tiempo deseado, lavar las células dos veces con PBS, luego añadir aproximadamente 1-2 ml de solución de tiocianato de guanidinio-fenol a las células en la placa. PRECAUCIÓN: solución de tiocianato-fenol Guanidinium es tóxico por contacto con la piel o los ojos, por inhalación o ingestión. Use ropa protectora adecuada, guantes y protección para los ojos / la cara, y el uso de campana de humos. Asegúrese de que el volumen de las células es no más de 10% del volumen de solución de tiocianato de guanidinio-fenol, y que la placa se cubre con la solución y dejar reposar durante 1 min. Entonces, raspar las células utilizando una espátula de goma y transferir a un tubo de microcentrífuga. Las células se pueden almacenar en esta solución a -80 ° C durante semanas. Extraer y purificar el ARN total de cada tratamiento utilizando el método de tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio seguido de purificación en columna giratoria y DNasaMétodo de degradación que el ADN de células animales. Después de la extracción, las células se eluyen en 60 l de agua libre de RNasa. Alícuota de 1-2 l de ARN para el análisis de la cuantificación y la tienda de ARN a -80 ° C. Mida las concentraciones de ARN utilizando 1 l de ARN y aspectrophotometer. Asegúrese de que hay un espacio en blanco se toma antes de realizar cualquier medición. También, limpie completamente el tiempo de alcance espectrofotómetro se toma una medida. Las concentraciones se muestran normalmente en ng / l. Guardar los resultados que muestran las concentraciones de ARN. Control de la calidad del ARN Tome unos 100 ng de ARN de cada muestra y colocar en un tubo de microcentrífuga. Medir la integridad del ARN usando un Bioanalyzer. Por lo general, 12 muestras se pueden ejecutar al mismo tiempo en un bioanalizador. Ejecute lo general toma alrededor de 25 min. Comparar los resultados con la escalera de ARN para asegurar que el ARN es buena para el experimento. Guardar e imprimir los resultados. 4. Confirmación de Treatción: qPCR de genes codificadores de proteínas síntesis de ADNc Tome 500 ng o 1 g de ARN total (de cada muestra) y lo puso en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Llevar el volumen de cada tubo de hasta 10 l utilizando RNasa libre de agua. Añadir 2 l de 50 mM hexamer cebadores aleatorios y tubos de calor a 70 ° C durante 10 min. Transferir los tubos en hielo durante 5 min. Para cada muestra, añadir 4 l de 5x tampón de primera cadena, 1 l de 0,1 M DTT, 1 mM l de dNTPs 10, 0,5 l de superíndice III, y 1,5 l de agua libre de RNasa. Colocar los tubos en un bloque C de calor de 25 ° o baño de agua durante 10 min. Tubos de transferencia a un bloque de calor 46 ° C durante 1 hora. A continuación, los tubos de transferencia a un bloque de calor a 70 ° C durante 15 minutos para detener la reacción. Diluir el cDNA a un 5 ng / l de stock (calculado mediante la entrada de ARN total) usando RNasa libre de agua para las diluciones y se almacena a -20 ° C. qPCR Obtener cebadores para los genes de los genes de interés y de referencia. Los cebadores pueden ser fácilmente diseñados utilizando la herramienta de diseño de imprimación sobre el programa de Primer-BLAST del NCBI 12. Esto generalmente genera un cebador directo y inverso para cada gen de interés. Los cebadores deben ser 18-22 pb de longitud, tienen una temperatura de fusión de 52-58 ° C, tiene un contenido de GC de 40-60%, y una longitud amplicón de 100-180 pb. Para cada reacción de qPCR bien, añadir 10 ng de ADNc (2 l de concentración madre del paso 4.1.7), 1 pmol de cada uno de los cebadores directo e inverso del gen de interés (del paso 4.2.1), y 5 l de tinte mezcla maestra de PCR 2x Cyanine. La reacción para cada pocillo debe tener un volumen de reacción final de 10 l. Asegúrese de que no pocillos por triplicado para cada muestra para cada gen (por técnicos repeticiones). Una placa de reacción de 96 pocillos se puede utilizar. En el software del sistema QRT-PCR, asigne el reportero y destino, introduzca volumen de reacción, seleccione la comparativamétodo de ciclo umbral (ΔΔCt), y definir los pocillos de muestra. Asegúrese de realizar el análisis de la curva de fusión de todas las corridas de tinte Cyanine para confirmar la amplificación de un fragmento específico. Ejecute placas utilizando la configuración predeterminada para la carrera. Guardar los resultados después de ejecución, y los datos de exportación (especialmente los valores de Ct a MS Excel). análisis de qPCR datos utilizando la fórmula ΔΔCT El cambio en la expresión relativa de ARNm se puede calcular como pliegue cambio con respecto al control en Excel para cada muestra utilizando los siguientes pasos: Todos los resultados de exportación de la qPCR arriba deben tener los valores de Ct incluidos. Calcular el valor? Ct utilizando la siguiente fórmula: ? Ct = CT (gen diana) – CT (gen de referencia) Esto se debe hacer para cada muestra. El objetivo es el gen o los genes miARN de interés. A continuación, calcular la desviación estándar total (SD) para cada muestra. En primer lugar calcularla SD para el gen de referencia y luego calcular la SD para el gen diana (esto se puede hacer en Excel usando la función Volatilidad en los valores CT). Luego calcule la SD total para cada muestra usando esta fórmula: SD Total = (SD2 (objetivo) + SD2 (referencia)) 1/2 Calcular la ΔΔCT de cada muestra dentro de un gen (de destino) por: ΔΔCT = ΔΔCT (muestra tratada / prueba) – ΔΔCT (control de muestra / calibrador) El calibrador de muestra es la muestra no tratada. Por último, el cálculo de los valores de veces de cambio (FC) de cada muestra mediante la fórmula: FC = 2-ΔΔCT El valor de cambio de plegado de cada muestra da la expresión relativa del gen / genes miARN que se ha normalizado al gen de referencia y la muestra de control. La prueba t de Student se puede utilizar para el análisis estadístico utilizando la distribución de dos colas y dos muestras varianza desigualParámetros: (P <0,001 (***), P <0,01 (**), y P <0,05 (*)). Esto se puede lograr en Excel. Confirme que el tratamiento dio lugar a la regulación de los objetivos conocidos antes de proceder con miARN perfiles. 5. Análisis de perfiles de miARN microarrays miARN Tome 5 mg de ARN aislado de las células tratadas con vehículo o ligando, y colocar en un tubo de microcentrífuga. Ajuste el volumen en el tubo de 20 l. Cada comparación se debe realizar por duplicado o triplicado. Lleve a cabo los microarrays miARN utilizando las muestras de ARN arriba. los perfiles de expresión de microarrays miARN deben determinarse utilizando microarrays miARN humana de dos colores muestra de matriz por μParaflo Microfluidic Tecnología Biochip (Sanger miRBase Release 14.0) 13. Los resultados deben mostrar miRNAs expresados ​​diferencialmente. Considere la posibilidad de expresiones de genes miARN significativas cuando p <0.05.p-valor <0,10 también puede ser considerado para una mayor cooperaciónanálisis nfirmatory utilizando qPCR. Guarde esta lista miARN para su posterior validación con qPCR. perfiles de miARN: DLP-LDA Cada muestra deberá analizarse por duplicado o triplicado. Tome 700 ng de ARN total de las células tratadas con vehículo o ligando, y colocar en un tubo de microcentrífuga. Ajuste el volumen en el tubo de 3 l. Lleve a cabo la síntesis de ADNc utilizando el método de ensayo de sondas miRNA doble etiquetado y los 10x cebadores RT. Volumen total para cada reacción debe ser 7,5 l. Coloque el tubo de reacción en el sistema termociclador PCR, y se puso a parámetros recomendados como se indica en el doble etiquetado método de ensayo Sondas miRNA. Inicie la carrera. Esto generará ADNc. Tenga en cuenta que el ADNc se puede almacenar a -20 ° C durante al menos 1 semana. Si bien la reacción de RT se está ejecutando, sacar las placas de DLP-LDA y deje reposar a temperatura ambiente. Cada placa matriz contiene 384 pozos que contienen cebadores miARN únicas y cebadores de control. Take 6 l del cDNA (desde 5.2.3), y meterlo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 450 l de la mezcla principal Sondas 2x PCR Universal doble etiquetado y añadir 444 l de agua libre de RNasa. Invierta el tubo cerca de seis veces para mezclar el contenido y centrifugar brevemente. Cuando la placa de DLP-LDA ha alcanzado la temperatura ambiente, la carga de 100 l en cada uno de los ocho 'Rellene el puerto' de la placa. A continuación, se centrifuga la placa matriz. Abra el sistema QRT-PCR y compruebe que el bloque es el de la placa de 384 pocillos. Configurar ejecución utilizando el software SDS. Seleccione la cuantificación relativa (Ct), seleccione el número de bien y tipo de matriz, y entrar en la descripción de la muestra para definir los pozos. Ejecute matriz mediante los ciclos térmicos condiciones predeterminadas. Cuando se termina de ejecución, guardar los resultados y la exportación a MS Excel y guardar para su posterior análisis mediante la fórmula ΔΔCT (paso 4.3). 6. Confirmación de Regulaciones de miARN utilizando separadaAnálisis qPCR Tinte Cyanine análisis qPCR Cebadores de diseño para el análisis de miRNA deseada. Secuencia de la miARN maduro, que es igual al cebador directo, puede obtenerse a partir de mirbase.org 14. Convertir todo 'U' en 'T'. Preparar cDNA: Tomar 1 g de ARN total y lugar en un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Siga las instrucciones para polyA cola y la síntesis de ADNc de primera hebra de miRNA de un protocolo de síntesis de cDNA y QRT-PCR miRNA primera cadena. Diluir el cDNA resultante (1:10) y se almacena a -20 ° C. Obtener una placa de reacción de 96 pocillos. Para cada reacción de miARN qPCR bien, añadir 16 ng de ADNc de poliA (de la etapa 6.1.2), 2 pmol de cada uno de el cebador directo específico (de la etapa 6.1.1) y el cebador universal (del kit de la etapa 6.1.2 ), y 5 l de mezcla maestra 2x qPCR. Volumen de reacción final es de 10 l / pocillo. Asegúrese de que no pocillos por triplicado para cada muestra por cada miRNA (para técnicos repeticiones). También, Asegúrese de que un gen de referencia (normalmente U6 snRNA) está incluido. En el software del sistema QRT-PCR, asigne el reportero y destino, introduzca volumen de reacción, seleccione la comparativa ciclo umbral (ΔΔCT) método, y definir los pocillos de muestra. Ejecute placas utilizando la configuración predeterminada para la carrera. Asegúrese de realizar el análisis de la curva de fusión de todas las corridas de tinte Cyanine. Cada curva de fusión debe mostrar sólo un pico específico para confirmar la amplificación de un fragmento específico. Si se observa más de un pico o ningún pico claro, los cebadores no son específicos y los datos no se pueden utilizar. Guardar los resultados después de ejecución, y los datos de exportación (especialmente los valores de Ct a MS Excel). Sondas análisis qPCR Etiquetada Dual Tome 10 ng de cada ARN total, cada uno en un volumen de 5 l y colocar en 0,2 ml tubo de microcentrífuga. Siga las instrucciones del protocolo sobre la realización de la transcripción inversa (RT) utilizando el doble etiquetado sondas MicroARN de la transcriptasa inversa Kit de 15. Cada volumen total de reacción debe ser de 15 l. Tenga en cuenta que para las reacciones de RT sondas doblemente marcadas, hay primers específicos para cada miARN para ser estudiados. Lugar tubo de reacción en el sistema de termociclador de PCR, y establecer los parámetros de acuerdo con el protocolo indicado en el paso 6.2.2 arriba. Inicie la carrera. Se debe tomar alrededor de 70-80 min. Después de la reacción de RT, se diluye la muestra de ADNc en una relación de 1:05, y almacenar todos los ADNc en la oscuridad a -20 º C. Obtener una placa de reacción de 96 pocillos. Para cada reacción de miRNA qPCR bien, agregue el siguiente: 10 l de sondas doblemente marcadas 2x PCR Universal Master Mix (mismo reactivo que paso 5.2.5), 7,67 l de RNasa libre de agua, 1 l de 20 × imprimación ensayo en tiempo real (específico para cada miARN), y 1,33 l de cDNA a partir de la etapa 6.2.4 arriba. Este debe ser un volumen final de reacción de 20 l. Mezcle el contenido con cuidado, y centrifugar brevemente. Asegúrese de que there son pocillos por triplicado para cada muestra para cada miARN (para técnicos repeticiones). Además, asegúrese de que un gen de referencia (normalmente U6 snRNA) está incluido. En el software del sistema QRT-PCR, asigne el reportero (FAM) y el extintor (NFQ-MGB) para cada miARN (target) de interés, introduzca volumen de reacción, seleccione la comparativa ciclo umbral (ΔΔCt) método, y definir los pocillos de muestra. Siga las instrucciones para configurar los parámetros para la qPCR Ejecutar en el protocolo de ensayo Sondas microRNA doble etiquetado. A continuación, iniciar la carrera. Guardar los resultados después de ejecución, y los datos de exportación (especialmente los valores de Ct a MS Excel).

Representative Results

Una visión general de este enfoque se presenta en la Figura 1 y una comparación de las diversas preparaciones de muestras y modificaciones de ácido nucleico requeridos para cada técnica se visualiza en la Figura 2. La condición y el medio ambiente de las células antes del tratamiento con una hormona es importante para determinar los efectos reales de la hormona 16. Algunos medio y suero contienen factores de crecimiento que pueden afectar a los resultados, por lo que las células son suero de hambre para asegurar que todos los efectos hormonales se han reducido a un mínimo. Por lo tanto, cuando el tratamiento con E2, hay más certeza de que los efectos observados están asociados-E2. Un factor importante es la confluencia de las células, lo que influye en contacto célula-célula y comportamientos tales como la señalización célula-célula y proliferación. Las células se dejaron a ser 80% confluentes (Figura 3A) y bien unidos para permitir el crecimiento y evitar la pérdida de células durante el posterior lavado y medios de comunicación CHange. Las condiciones durante la extracción y almacenamiento de ARN son importantes para la calidad del ARN y el análisis posterior. También se sabe que el número de células, el método de extracción, y el contenido de GC de los genes miARN pueden afectar el rendimiento y la calidad de ambos mRNAs y miRNAs 17. Por lo tanto, es necesario para llevar a cabo la extracción de ARN durante las condiciones de RNasa-libres y para comprobar la calidad del ARN antes de proceder con los experimentos. Después de la extracción, la cuantificación del ARN proporciona información sobre la concentración del ARN total (que contiene tanto los mRNAs y miRNAs), que permite la observación de rendimiento. También proporciona una representación gráfica de los resultados como se ve en la Figura 3B, y esto permite la observación de la pureza de la muestra (por lo general indicada por un pico, panel superior). Malo rendimiento de ARN no produciría ningún específica de absorción a 260 nm (Figura 3B, panel inferior). Para determinar si el ARN es de alta calidad, el ARNSe midió la integridad. Un número de la integridad del ARN (RIN) de entre 9-10 garantiza que el ARN no se degrada y es de calidad óptima. Además, se debe observar la representación gráfica de la ARN, y el 18S y 28S rRNA debe tener picos, como se muestra en la Figura 4 (panel central). Comparación con la escalera (Figura 4, panel superior) identifica el tamaño de los picos. Un ARN degradado tendría picos menos claros y una cantidad relativa reducida de la 18S y 28S rRNA (Figura 4, panel inferior). La fracción de los pequeños RNAs más se puede asegurar mediante el Small RNA Kit Agilent. Se recomienda para validar la respuesta de estrógeno después del tratamiento, en las condiciones experimentales especificadas, antes de proceder a la detección de los genes miARN. Un qPCR se puede realizar en un gen diana ER conocida como PS2 o SPINK4 18, utilizando la plantilla de ADNc. Estos genes están regulados por incremento general en 1-24 horas después del tratamiento E2. Una vez que la calidad del ARN y la respuesta de estrógenoha sido evaluado, más experimento puede llevarse a cabo. Microarray es todavía una técnica ampliamente utilizada para el cribado a gran escala para la expresión de los genes miARN en las células. Por ejemplo, los microarrays miARN vez usado contenía 894 miRNAs maduros y 50 controles sondas únicos en cuatrillizos 1. Las hibridaciones se realizaron en los duplicados con procedimiento de tinte de intercambio. Los resultados de microarrays miARN son generalmente gráficamente representados por mapas de calor. Figura 5A muestra un mapa de calor, que representa los datos de un miARN microarrays comparación entre el vehículo y las muestras tratadas E2. El color rojo indica que el miRNA es aumentada en la muestra tratada con E2 (mayor expresión), mientras que el verde indica regulación a la baja de los genes miARN (menor expresión). La selección de los genes miARN por lo general depende de su importancia en la expresión, y por lo general un valor de p inferior a 0,05 se consideró significativo. Los miRNAs que se indican que se expresó diferencialmente deben ser validados más with qPCR, para distinguirlos de los falsos positivos. La matriz DLP-LDA, por otra parte, utiliza un método basado en PCR cuantitativa para detectar miRNAs reguladas en un formato de 384 pocillos. Por lo general, dos placas de 384 pocillos (tarjetas) se proporcionan, piscinas A y B. Grupo A por lo general contiene una mejor caracterizado y más altamente expresado miRNAs que la piscina B. El nivel relativo de cada miRNA son determinados por qPCR, donde se analiza un miRNA por así (Figura 5B). Un mayor valor Ct indica menor expresión de miARN. Al igual que los microarrays miARN, los resultados obtenidos desde el DLP-LDA deben ser validados más para asegurar la exactitud. Validaciones se pueden realizar utilizando qPCR. Aquí, dos métodos de detección de qPCR se describen para evitar sesgo del método y para permitir la confirmación exhaustiva investigación y de regulaciones de los genes miARN. El Cyanine base de tinte química de detección funciona diferente que DLP porque el perfilado DLP-LDA se basa en, y es adecuado para confirmarfines ación. Puede ser menos específico, ya que detecta todo el ADN de doble hebra amplificado, pero la homogeneidad de la muestra se puede evaluar mediante la realización de un análisis de fusión de la curva. Figura 6A (panel izquierdo) muestra el análisis de fusión de la curva de un miARN, y un pico uniforme claramente definido puede ser visto. Se observaron múltiples picos de si el cebador es no específicos o cantidades significativas de cebador-dímero se forma (Figura 6A, panel derecho). Ensayos DLP miARN, por otro lado, es más específico, ya que sólo la amplificación de la diana se detecta miRNA. Gráficas de amplificación de cada uno de los genes miARN objetivo se pueden observar, como se ejemplifica en la Figura 6B. La opción para el control de la aparición de múltiples productos de amplificación utilizando el análisis de curva de fusión es, sin embargo, no está disponible con esta química y colorante de cianina qPCR es menos costoso. Ensayos de tinte de cianina y DLP qPCR veces pueden generado resultados ligeramente diferentes. Para ambos ensayos de qPCR, comparación con un refeSe requiere gen rencia para determinar la expresión relativa de los genes entre dos muestras. El gen de referencia, también conocido como gen de mantenimiento, debe ser un gen cuya expresión no se cambia y que se expresa en niveles similares como el gen de interés. Un ejemplo de un gen de referencia adecuado en estas líneas celulares de cáncer de mama es ARHGDIA, un inhibidor de la disociación de GDP-Rho que funciona reacciones de intercambio de GDP / GTP de las proteínas Rho. Como se observa en la Figura 6C (parte superior), el nivel de mRNA de ARHGDIA no se cambia entre el vehículo y las muestras de ligando-tratada. El 18S rRNA también se puede utilizar, aunque su alta expresión requiere una dilución 1:500 separada de la población de ADNc y por lo tanto es menos adecuado. Para el análisis de miRNA, todavía hay un debate sobre un gen de referencia bien definido. Hasta ahora, la U6 snRNA es un gen de referencia que es ampliamente aceptada para el análisis de miRNA. U6 snRNA es el ~ 110 nucleótidos de largo no codificante ARN pequeño, nuclear que funciona en nuclear pre-mRNA splla formación de hielo 19. Como se observa en la Figura 6C (abajo), los niveles de expresión U6 son aproximadamente los mismos en todas las muestras que se muestran, lo que permite el cálculo de los diferentes niveles de miRNA. Una representación gráfica de un resultado miARN qPCR para una comparación entre el vehículo y las células tratadas con E2 que se han normalizado a la U6 de referencia se puede observar en la Figura 6D. Esto ilustra un miRNA que se detectaron como no reguladas después del tratamiento E2 24 horas, pero que alberga sitios de unión a la cromatina-ER cercanas a su localización genómica y análisis de series temporales identificada regulación significativa de 72 horas después del tratamiento. Figura 1. Una visión general del método empleado para la detección de la regulación hormonal de miRNA en células de cáncer de mama. </strong> Proceso se inicia con la cultura y el tratamiento de células, seguido de gran escala de perfiles de miARN para identificar miRNAs expresadas diferencialmente posiblemente, y termina con validaciones QRT-PCR de resultados de la matriz. Figura 2. Comparación de las diversas preparaciones de muestras y manipulaciones de ácido nucleico para cada técnica de detección de los genes miARN. (A) miARN microarray utilizando el método de la tecnología μParaflo incluye el enriquecimiento, la poli-A de relaves y el etiquetado de ligación. (B) la preparación de muestras de tecnología DLP y método de detección incluye un cDNA síntesis del cebador en bucle que se extiende después de la etapa de desnaturalización y proporciona un fragmento más largo que alberga el preparación de la muestra cebador inverso y la secuencia de la sonda. (C) la tecnología de tinte Cyaniney el método de detección incluye poli A-colas, y la síntesis de ADNc con cebadores oligo-dT, incluyendo una secuencia universal de 5. Figura 3. Cultivo de células y la extracción de RNA. (A) Las células cultivadas a 80% de confluencia ilustran necesaria antes del tratamiento con ligando. (B) Representación gráfica de la concentración de ARN y la pureza después de la extracción. Cada pico representa una muestra y un proceso de extracción con éxito produce ARN puro (panel superior). Un ARN extraído mal muestra ningún pico de absorción a 260 nm clara (panel inferior). Figura 4. & #160, el control de la calidad del ARN Los resultados de análisis de integridad ARN que muestra la representación gráfica de la escalera (arriba), un ARN de buena calidad (en el centro) y una muestra de ARN degradado (abajo).. Figura 5. Una ilustración de miARN perfiles de resultados. (A) Un mapa de calor representación de miARN microarrays resultados para miRNAs expresados ​​diferencialmente. miR-A, B, C son upregulated en la muestra tratada E2 como se indica en rojo, mientras que el miR-D, E, F, G se downregulated en la muestra tratada con E2 como se indica en verde. (B) gráficas de amplificación para cada uno miRNA de los resultados DLP-LDA. miARN detectado se amplifican como se indica por el aumento en el valor Rn. <img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/51285/51285fig6highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51285/51285fig6.jpg" /> Figura 6. qPCR análisis de las regulaciones del miRNA. (A) Análisis de fusión de la curva para un miRNA analizados usando la detección de tinte Cyanine, mostrando homogeneidad de todas las muestras analizadas (izquierda) y la amplificación de múltiples fragmentos (derecha). (B) parcelas de amplificación para cada muestra para un miRNA. Esto puede ser de tinte de cianina o DLP métodos de detección. (C) Representación gráfica de barras de genes de referencia adecuados para el análisis de ARNm ARHGDIA (arriba) y para el análisis de miRNA U6 snRNA (abajo), que no muestran expresión diferencial significativa entre las muestras. (D) resultados miRNA qPCR para ilustrar la comparación de los niveles de expresión relativa de miR-135a durante un transcurso de tiempo. Figura 6D es reimpreso de Katchy et al. 1, con permiso de Elsevier. Los valores son por lo general el promedio de exper separadaiments (duplicados biológicos) ± SD. La prueba t de Student se utiliza para demostrar la significación: * p <0,05.

Discussion

Determinar el mecanismo de regulación hormonal de miRNA en células de cáncer de mama puede servir de plataforma para la comprensión de esta enfermedad y puede proporcionar un tratamiento potencial para el cáncer de mama. El cultivo de estas células para proporcionar la condición óptima para la acción de la hormona es muy importante. Aquí, un protocolo que se asegura de que se excluyó la hormona de interés (estrógeno) antes del tratamiento y de que se utilizó una dosis óptima de E2 durante un tiempo apropiado durante el tratamiento se ha descrito. Otros efectos de los factores hormonales y de crecimiento se mantuvieron a un mínimo mediante la reducción gradual de los niveles de suero y utilizando DCC-FBS, que es de FBS que se han despojado de la mayor parte de su hormona, citoquinas, y factores de crecimiento. El fenol medios de comunicación libre de rojo se utiliza, además, para reducir al mínimo otros efectos no hormonales, dado que el rojo de fenol se ha informado que tienen actividad estrogénica y afectar a ciertas funciones en líneas celulares 20,21. El tiempo de exposición de las células a la hormona es de gran importancia. Para la regulación de estrógenos asociada de los genes, se ha demostrado previamente que el 24-hrexposure producir respuesta significativa de los genes diana directos en las células de cáncer de mama 1,18. Desde miRNAs son transcritos por la ARN polimerasa II, como ARNm, es concebible que este es un punto de tiempo adecuado para detectar la regulación directa también de miRNAs. Es aún por determinar si y cómo estos miRNAs afectan a la expresión de estos objetivos ER conocidos en células de cáncer de mama.

de perfiles de expresión de miARN puede ser un reto debido al pequeño tamaño relativo del miRNA, el hecho de que la secuencia de los genes miARN madura se puede encontrar también en el pri-miRNA y el pre-miRNA, y debido a la heterogeneidad en su contenido de GC 22. Varias técnicas de perfilado y químicas se han utilizado para superar esta dificultad. Entre ellas se encuentran los diferentes enfoques de microarray y análisis qPCR (Figura 2). Aunque microarrays es ampliamente aceptado para toda anal genomalisis, puede proporcionar falsos negativos y no existen diferencias entre las plataformas disponibles, que van desde la química a la tecnología de impresión 23. También el proceso de normalización constituye un reto en el análisis de los relativamente pocos genes miARN, que se cuentan en miles en comparación con las decenas de miles de transcripciones de ARNm. qPCR, por otra parte, es más sensible, y se aplica mejor cuando menos genes han de ser consideradas. Sin embargo, cuando se realiza en grandes placas de 384 pocillos, con una sola técnica de reproducir por placa, múltiples placas deben ser analizados para cada muestra de lo que hace el análisis costoso. Además, en nuestras manos, se obtuvieron resultados negativos más falsos utilizando el análisis de DLP-LDA en comparación con el microarray. Dado que la secuencia de los genes miARN maduro está presente en la pri-genes miARN y las secuencias de pre-miARN, es de interés para diferenciar entre estas transcripciones utilizando técnicas de PCR 24. Sondas DLP están disponibles también para pre-miRNAs, y specific cebadores también se pueden diseñar para excluir diferente maduro o precursor de colorante de cianina usando variantes de la tecnología de la qPCR.

qPCR es un estándar de oro para la validación de la expresión diferencial de los perfiles de los resultados. La eficacia de la qPCR, sin embargo, depende de varios parámetros, incluyendo la extracción de RNA, la integridad del ARN (calidad), la síntesis de ADNc, el diseño del cebador, método de detección (química), y el gen de referencia para la normalización de datos 1,22,25. Las opciones para el diseño de cebadores para el análisis de miRNA es muy limitada, ya que la corta longitud de la secuencia de los genes miARN no da margen para mucho diseño alternativo de imprimación, y sólo un cebador pueden ser albergados en esta corta secuencia. Por lo tanto, la necesidad de manipulaciones alternativos como se ilustra en la Figura 2. Técnico repeticiones son importantes para validar la robustez del método de amplificación y el proceso empleado. Se requieren repeticiones biológicos para una representación de la Variatio biológica en generaln, incluyendo la respuesta variable para ligando tratamiento, y para demostrar que los efectos observados en una célula son reproducibles. Basándonos en nuestra experiencia, pueden ocurrir variaciones en la expresión de miRNA entre cultivos celulares. Por lo general, estas diferencias son menos de 1,3 veces, y el promedio de los valores y la correspondiente SD identifica la variación natural y tecnológico. Esta variación puede ser el resultado de diversos factores, entre ellos, la densidad celular y el hecho de que las funciones celulares podrían cambiar de paso a paso. Identificar expresiones estadísticamente significativos resultantes del tratamiento ligando, un significado ampliamente aceptado es cuando el valor de p es menor que 0.05. En este caso, se han utilizado la prueba t de un estudiante en los biológicos y técnicos repeticiones utilizando la distribución de dos colas y dos muestras parámetros de varianza desigual. Existen otros parámetros t-test, y la elección depende de la configuración experimental 26.

Un protocolo detallado en la evaluación de las regulaciones hormonales de madura MIRNA en células de cáncer de mama se ha proporcionado. Tecnologías importantes y de la química en los perfiles y validación de estos miARN expresiones se han explicado con claridad. La tecnología elegida para el estudio de miRNA en células de cáncer de mama depende en última instancia de lo que exactamente se está investigando.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Estamos muy agradecidos con el Dr. Xiaolian Gao, de la Universidad de Houston, para asesorar a la plataforma de microarrays LC Ciencias miRNA, el Dr. Karin Edvardsson, Instituto Karolinska, de Suecia, y el Dr. Eylem Aydogdu de la Universidad de Houston, por compartir sus conocimientos miRNA . Las investigaciones realizadas en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de la Salud con el número Premio R01CA172437. El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. Este trabajo también fue apoyado por subvenciones del Fondo de Tecnología Emergente de Texas, bajo el Acuerdo no. 300-9-1958.

Materials

DMEM Life Technologies 11885092
F12 Life Technologies 11765054
FBS Sigma-Aldrich F0926-500ML
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140122
phenol red-free DMEM  Life Technologies 11054020
Ultrapure Water EMD Millipore Specific equipment
DCC-FBS Sigma-Aldrich F6765-500ML
100X L-glutamine Life Technologies 25030081
PBS tablet Medicago, Accurate chemicals Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100)
17β-estradiol Sigma-Aldrich E2758
ICI 182,780  Sigma-Aldrich I4409
Ethanol Sigma-Aldrich E7023-600ML
T47D or MCF7 cells lines American Type Culture Collection (ATCC) T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22)
T-75 flask  VWR International LLC BD353136 (vented cap)
Trypsin-EDTA Life Technologies 25300062
Serological pipet VWR International LLC 53300. For 5mL (53300-421)
Countess Cell Counting chamber Life Technologies C10228
Countess Automated Cell Counter Life Technologies C10227
100 mm plates  VWR International LLC 25382-166
Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol) Life Technologies 15596026
Rubber cell scraper  VWR International LLC 82050-470
Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol) Qiagen 217004
Rnase-Free DNase I  kit (DNA degradation) Qiagen 79254
RNase-free water (Nuclease-free water) Thermoscientific SH30538.02
Nanodrop 1000 Spectrophotometer  Thermoscientific ND-1000
Agilent RNA 6000 Nano Assay kit Agilent 5067-1512
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent G2938C and for software (G2946)
All primers (except TaqMan primers) Integrated DNA Technologies Specific per order for each gene/miRNA
First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit)  Life Technologies 18080085
MicroAmp Fast 96-Well reaction plate  Life Technologies 4346906
Fast Optical Adhesive Covers Life Technologies 4311971
2X SYBR green PCR master mix (Cyanine dye) Life Technologies 4385612
7500 Fast Real-Time PCR System and software Life Technologies 4351106
μParaflo Microfluidic Biochip Technology  LCSciences MRA-1001 and AS-2001(for result analysis)
DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set) Life Technologies 4400928
Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit  Life Technologies 4366596
GeneAmp PCR System 9700 thermocycler Life Technologies 4310899
Dual Labeled Probes (TaqMan) 2X Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG Life Technologies 4324018
7900HT Fast Real-Time PCR system Life Technologies 4329001
SDS and RQ manager softwares Life Technologies 4444202
NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit Life Technologies MIRC-50
10X DPL (TaqMan) RT primers Life Technologies Specific for each miRNA
20X DPL (TaqMan) real-time assay primer  Life Technologies Specific for each miRNA
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Katchy, A., Edvardsson, K., Aydogdu, E., Williams, C. Estradiol-activated estrogen receptor alpha does not regulate mature microRNAs in T47D breast cancer cells. J. Steroid Biochem. Mol Biol. 128 (3-5), 145-153 (2012).
  2. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  3. Wickramasinghe, N. S., Manavalan, T. T., Dougherty, S. M., Riggs, K. A., Li, Y., Klinge, C. M. Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells. Nucleic Acids Res. 37 (8), 2584-2595 (2009).
  4. Bhat-Nakshatri, P., Wang, G., Collins, N. R., Thomson, M. J., Geistlinger, T. R., Carroll, J. S., Brown, M., Hammond, S., Srour, E. F., Liu, Y., Nakshatri, H. Estradiol-regulated microRNAs control estradiol response in breast cancer cells. Nucleic Acids Res. 37 (14), 4850-4861 (2009).
  5. Klinge, C. M. miRNAs and estrogen action. Trends Endocrinol. Metab. 23 (5), 223-233 (2012).
  6. Gupta, A., Caffrey, E., Callagy, G., Gupta, S. Oestrogen-dependent regulation of miRNA biogenesis: many ways to skin the cat. Biochem. Soc. Trans. 40 (4), 752-758 (2012).
  7. Kao, J., et al. Molecular profiling of breast cancer cell lines defines relevant tumor models and provides a resource for cancer gene discovery. PLoS One. 4 (7), e6146 (2009).
  8. Lacroix, M., Leclercq, G. Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update. Breast Cancer Res. Treat. 83 (3), 249-289 (2004).
  9. Ross, D. T., Perou, C. M. A comparison of gene expression signatures from breast tumors and breast tissue derived cell lines. Dis. Markers. 17 (2), 99-109 (2001).
  10. Neve, R. M., et al. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes. Cancer Cell. 10 (6), 515-527 (2006).
  11. Baker, M. MicroRNA profiling: separating signal from noise. Nat. Methods. 7 (9), 687-692 (2010).
  12. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
  13. Zhou, X., et al. MicroRNA profiling using microParaflo microfluidic array technology. Methods Mol. Biol. 822, 153-182 (2012).
  14. Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Res. 34, 140-144 (2006).
  15. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).
  16. Ruedl, C., Cappelletti, V., Coradini, D., Granata, G., Di Fronzo, G. Influence of culture conditions on the estrogenic cell growth stimulation of human breast cancer cells. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 37 (2), 195-200 (1990).
  17. Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Mol. Cell. 46 (6), 893-895 (2012).
  18. Williams, C., Edvardsson, K., Lewandowski, S. A., Strom, A., Gustafsson, J. A. A genome-wide study of the repressive effects of estrogen receptor beta on estrogen receptor alpha signaling in breast cancer cells. Oncogene. 27 (7), 1019-1032 (2008).
  19. Yu, Y. T., Maroney, P. A., Darzynkiwicz, E., Nilsen, T. W. U6 snRNA function in nuclear pre-mRNA splicing: a phosphorothioate interference analysis of the U6 phosphate backbone. RNA. 1 (1), 46-54 (1995).
  20. Wesierska-Gadek, J., Schreiner, T., Maurer, M., Waringer, A., Ranftler, C. Phenol red in the culture medium strongly affects the susceptibility of human MCF-7 cells to roscovitine. Cell Mol. Biol. Lett. 12 (2), 280-293 (2007).
  21. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Mol. Cell. Endocrinol. 57 (3), 169-178 (1988).
  22. Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50 (4), 244-249 (2010).
  23. Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).
  24. Schmittgen, T. D., Jiang, J., Liu, Q., Yang, L. A high-throughput method to monitor the expression of microRNA precursors. Nucleic Acids Res. 32 (4), e43 (2004).
  25. Setiawan, A. N., Lokman, P. M. The use of reference gene selection programs to study the silvering transformation in a freshwater eel Anguilla australis: a cautionary tale. BMC Mol. Biol. 11, 75 (2010).
  26. Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. Statistical analysis of real-time PCR data. BMC Bioinform. 7, 85 (2006).

Tags

EstrogenEstrogen ReceptorBreast CancerMiRNAMicroarrayQPCRGene ExpressionPost-transcriptional RegulationOncogeneTumor SuppressorBiomarker

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Katchy, A., Williams, C. Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells. J. Vis. Exp. (84), e51285, doi:10.3791/51285 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image