分子通过雌激素和小分子RNA的信号是在乳腺癌的发展和增长的关键。雌激素激活的雌激素受体,它是转录因子。许多转录因子能调节微RNA的表达,而雌激素调节的微小RNA可以使用不同的大规模的技术来成型。
雌激素在乳腺发育和乳腺癌发展中起着至关重要的作用。它介导通过结合并激活雌激素受体(ERS),ERα和ERβ其功能。 ERα经常上调在乳腺癌和驱动乳腺癌细胞的增殖。雇员再培训计划作为转录因子和调节基因的表达。而蛋白质编码基因的雌激素受体α的调控是公认的,非编码小分子RNA(miRNA)的,其监管较少游客。微RNA在基因的转录后调控中发挥了重要作用,抑制其翻译或降低其mRNA的表达。的miRNA可以作为癌基因或抑癌基因,并且也有为的生物标志物。其中可用的miRNA的测定法,微阵列和实时定量聚合酶链式反应(定量PCR)已被广泛用于检测和定量miRNA水平。以识别的miRNA通过雌激素信号在乳腺癌,日规EIR表达ERα阳性的乳腺癌细胞系进行了对比之前和之后同时使用的μParaflo微流控芯片和双标记探针低密度阵列雌激素激活。结果使用特定的qPCR实验进行了验证,同时应用花青染料型和双标记探针为基础的化学反应。此外,一个时间点测定法用于鉴定规定时间的推移。在这项研究中所使用的miRNA的检测方法的优点是,它使成熟的miRNA法规快速筛选大量样品中,即使在有限的样品量。的布局,包括用于细胞培养的特定条件和雌激素治疗,生物技术和重复,并且大规模筛选随后深入的确认使用单独的技术,确保了韧性检测的miRNA的规定,并消除误报和其他伪影。然而,突变或未知的miRNA,或在小学和前体的转录LEVE法规升,将不会被检测到。这里介绍的方法代表了雌激素介导的miRNA调控了深入调查。
雌激素是一种激素,乳腺发育过程中是非常重要的。雌激素也在开发,维护,风险和治疗乳腺癌1中起着重要的作用。雌激素通过结合到急诊室,这是转录因子,调节特定靶基因发挥其功能。两个受体变异体,ERα是乳腺癌细胞的雌激素依赖性增殖是必不可少的。大多数乳腺癌是雌激素受体α阳性和依赖于雌激素生长。这使得雌激素信号和ERα治疗激素受体阳性乳腺癌的目标。了解ERα的基本机制是很重要的,以提高治疗效果,克服阻力的治疗,并了解乳腺癌的发展。
微RNA是由于转录后基因调控的影响主要在细胞功能的重要作用。 miRNA是19-24个核苷酸短的单链,非编码是首先通过转录RNA聚合酶II进入初级miRNA转录(初级miRNA)的RNA。它们是由Drosha酶在核内加工成短发夹前体的微RNA(miRNA前体),然后被Dicer加工,分离成单链,以形成在细胞质中成熟的miRNA。单链成熟miRNA被转移到Argonaute蛋白形成RISC复合物。然后,miRNA能够杂交到靶mRNA的3'-非翻译区(3'-UTR),导致转录后调节通过阻断翻译或降解靶mRNA 2。
由于这两种雌激素和微RNA在肿瘤进展中起,确定正常或破坏雌激素信号相关的miRNA的重要作用,以提高我们对发展的理解,提高乳腺癌的治疗是很重要的。虽然有一个很好的理解ERα如何调节蛋白编码基因,扩展和非编码RNA法规的细节还有待调查清楚。最初的研究目的是澄清的miRNA的ERα调节在乳腺癌细胞系中已经产生了相互矛盾的结果,即使在相同的细胞系进行了分析3-6。这可能是不同的治疗,生物变型中,使用不同的技术,而事实上,miRNA的小尺寸使它们具有挑战性的分析结果。在这里,一个协议,对变化和方法控制工件描述。
以确定哪些miRNA是由雌激素调节,ERα活性的良好定义的乳腺癌模型的分析是第一步。几个细胞系已经产生来自人ERα阳性乳腺癌肿瘤,这是依赖于雌激素相似,大多数临床乳癌。两个这些细胞系,T47D和MCF7,包括ERα和其下游靶的表达的分子性质,在孕激素受体 (PR),缺乏膜受体HER2表达的,随着雌激素反应和管腔上皮分化的基因表达,使它们适合作为乳腺肿瘤7-10的Luminal亚型车型。 17β-雌二醇(E2)是雌激素的主要形式,而浓度与时间点对ERα的最佳转录激活已经表征了在多个研究。在此协议为10nM E2处理24小时的使用和T47D和MCF7作为在乳腺癌细胞中雌激素受体α1活性的模型。另外,依赖于时间的miRNA的规定可以具体为例如 1-72小时的时间间隔进行分析。
其次,分析的miRNA具有独立的挑战,部分原因是他们的短尺寸。 miRNA是没有得到很好的保留在总RNA样品时经常胍thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol RNA沉淀执行,或当STandard柱纯化使用。特别的预防措施需要采取维持或富集RNA的小部分。通过增加异丙醇的体积,离心(-80℃),然后降低温度,并省略洗涤在70%乙醇中,miRNA的保持可以沉淀过程中得到增强。或者,特定列的缓冲器和一个高品质和鲁棒制备含有miRNA的总RNA,都可以使用。也为分析本身,他们的短尺寸来制作的挑战。对于全基因组miRNA的筛选,有三种常见的miRNA表达谱技术可以选择:芯片,定量PCR和新一代测序。每种技术可以使用多个不同的平台上进行,并且不同的样品准备工作是必需的,每个引入的工件不同的风险。在miRNA芯片,幻灯片有斑点或与成千上万的寡核苷酸的合成。这些寡核苷酸被用作探针,每个探针的s被设计用于杂交到一个特定的miRNA序列。对于芯片的样品制备,如本研究中进行,首先为丰富的miRNA,然后介绍的Cy5和Cy3标记标签上的miRNA。微阵列提供了机会,同时观察的大量基因的相对表达水平,速度快,适合于大量样品的筛选,但可以仅分析该序列存在于微阵列和将例如未发现变化,在未知的或突变的miRNA。如本方案进行微阵列分析也需要相对大量的每个样品的总RNA进行分析,大约5微克。低密度qPCR的miRNA表达谱,需要更少的材料(700毫微克/样品和复制),并且允许进行miRNA的检测和定量。转录水平可以被确定,并且数量可以是绝对量或相对量。定量PCR分析,首先需要转换的miRNA成cDNA,这里使用一个环形底漆为每个特定的miRNA确保只有成熟的miRNA分析。这会产生一个更长的模板,可以利用一个miRNA的特异性正向引物和一个通用反向引物互补的环状序列进行扩增,并能够携带进一个双标记探针的特异性。定量PCR可以在其中可以并行使用一种或以每孔11个别引物对几个384孔板进行检测数百miRNA的低密度的格式来使用。新一代测序,在另一方面,是唯一的这些技术,它允许新的,突变的或编辑的miRNA的发现,作为样品中所有的RNA可测序11。这种技术,但是,需要多个步骤来丰富的小RNA,并使用几个步骤接头连接反应和纯化的带有后续增强调制样品之间的相对表达水平的风险,产生小RNA文库。这还需要显著bioinformatiCS分析。给出的各种技术对于miRNA表达谱,最合适的技术取决于应用。芯片是最适合当材料是比较丰富的,而利息是确定的已知的miRNA表达差异。低密度的qPCR阵列是最适合当一个有限的样本量是可用和低表达的miRNA的高灵敏度是必需的。测序是当需要未知的miRNA,突变的或miRNA的不同同种型的分析最合适。
在乳腺癌中雌激素调节的miRNA研究中,2模型细胞系的使用,T47D和MCF7,其中是容易得到大量的RNA。每个细胞系中使用不同的通道,每个治疗技术重复复制的细胞培养物进行了分析。这使得强大的检测的可重复性,ERα调节的miRNA。同时使用miRNA芯片和相对miRNA的表达水平进行比较双标记探针 – 低密度阵列(DLP-LDA)和验证的结果与特定的qPCR同时使用花青染料和DLP化学品。 miRNA的法规,然后进一步在时间序列分析,以确定它们随时间的精确调节,能帮助雌激素诱导分化法规随机或昼夜变化,并表示从二次效应主要影响。与ERα的染色质结合生物信息学研究的比较可以在初级与次级效应的分化进一步帮助。该法导致了miRNA的法规在那里它可以建立,经过24小时的治疗E2蛋白编码转录物易于调节,但成熟的miRNA并没有受到影响1一个可靠的评估。然而,这是可能的,miRNA是调节在稍后的时间点,如在选定的miRNA 1的时间序列分析。细节需要进一步探讨和这里介绍的协议提供了一个ROBUS吨方式来研究成熟miRNA在乳腺癌细胞系中的激素调节。
确定机制miRNA在乳腺癌细胞激素调节可用于理解这种疾病提供了一个平台,并且可以提供用于乳腺癌的治疗潜力。培养这些细胞,以提供激素作用的最佳条件是非常重要的。这里,一个程序,即确保利益(雌激素)的激素被排除在治疗前和E2的最佳剂量是用于在治疗过程中的适当时间进行了说明。其它激素和生长因子的作用被逐渐降低的血清水平和使用DCC-FBS的,这是FBS已经剥离了其大部分激素,细胞因子和生长因子的保持在最低限度。无酚红培养基进一步用于减少其他非荷尔蒙的影响,因为酚红已被报道具有雌激素活性和细胞系20,21影响某些功能。将细胞暴露于激素的时间是非常重要的。对基因的雌激素相关的法规,它先前已经表明,24 hrexposure产生的乳腺癌细胞中1,18直接靶基因显著响应。由于miRNA是由RNA聚合酶II转录,mRNA的一样,可以设想,这是一个合适的时间点来检测直接调节也是的miRNA。它是尚未确定是否以及如何将这些miRNA的影响在乳腺癌细胞中这些公知的目标,ER的表达。
miRNA表达谱可以是由于miRNA的,但事实上,成熟miRNA序列可还发现,在初级miRNA和miRNA前体的相对小的尺寸具有挑战性的,因为异质其GC含量22。几种分析技术和化学已经被用来克服这一困难。其中有微阵列和qPCR分析的不同的方法( 图2)。虽然芯片被广泛接受的全基因组肛门ysis,它可以提供假阴性,且存在可用的平台之间的差异,从化学的印刷技术23。还分析了相对较少的miRNA基因,其中被计数以千比数以万计的mRNA转录物时,归一化处理是一个挑战。定量PCR,在另一方面,是更为敏感,并更好地应用于当较少的基因是要考虑的。然而,在大的384孔板中进行时,只有一个每板技术复制,多个板需要对每个样品使得分析成本进行分析。此外,在我们的手中,越来越多的假阴性结果采用DLP-LDA分析相比,基因芯片获得的。鉴于成熟miRNA序列是存在于初级miRNA和miRNA前体序列,它是感兴趣的这些转录物使用PCR技术24之间进行区分。 DLP探头也可用于预miRNA的,和SPecific引物也可以被设计来排除不同的成熟或前体变体使用花菁染料的定量PCR技术。
定量PCR是一个黄金标准的差异表达验证的评测结果。在定量PCR的效率,然而,依赖于几个参数,包括RNA提取,RNA的完整性(质量),合成cDNA,引物的设计,检测方法(化学),和参考基因对数据归一化1,22,25。引物设计的miRNA分析的选项是非常有限的,因为短期的miRNA序列的长度不给余地很大另类引物设计,只有一个引物可以在这短短的顺序进行包庇。因此,需要替代的操作, 如图2。技术复制是重要的,以验证扩增方法的鲁棒性和采用的工艺。生物复制所需的一般生物variatio的表示N,包括可变的反应配体处理,并表明在可见单元格的效果是可重复的。根据我们的经验,不同的细胞培养物之间的miRNA表达可发生。通常这些差异都小于1.3倍,和值的平均值和相应的SD标识自然和技术的变化。这种变化可能导致由各种因素,包括,细胞密度和事实,即细胞的功能可以由通道切换到通道。识别从配体治疗导致统计学显著表达式,一个广泛接受的意义是,当p值小于0.05。这里,对使用双尾分布和双样本方差不等参数的生物学和技术重复学生的t-试验已被使用。其他t-检验的参数存在,而选择依赖于实验装置26。
在评估成熟miR激素法规的详细协议适用于乳腺癌细胞中已经提供。在分析和验证这些miRNA的表达重要技术和化学已经解释清楚。选择了miRNA在乳腺癌细胞研究的技术最终取决于究竟正在调查中。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢孝廉高,休斯顿大学博士,为给LC科学miRNA芯片平台,提供咨询,卡琳爱德华松博士,卡罗林斯卡医学院,瑞典和Eylem Aydogdu博士,休斯顿大学,分享他们的专业知识的miRNA 。研究报告本出版物中得到了卫生部下奖号码R01CA172437国家研究院国立癌症研究所的支持。内容完全是作者的责任,并不一定代表美国国立卫生研究院的官方意见。这项工作也是由来自得克萨斯州的新兴科技基金,协议项下的任何资助。 300-9-1958。
DMEM | Life Technologies | 11885092 |
F12 | Life Technologies | 11765054 |
FBS | Sigma-Aldrich | F0926-500ML |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 |
phenol red-free DMEM | Life Technologies | 11054020 |
Ultrapure Water | EMD Millipore | Specific equipment |
DCC-FBS | Sigma-Aldrich | F6765-500ML |
100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 |
PBS tablet | Medicago, Accurate chemicals | Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100) |
17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 |
ICI 182,780 | Sigma-Aldrich | I4409 |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-600ML |
T47D or MCF7 cells lines | American Type Culture Collection (ATCC) | T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22) |
T-75 flask | VWR International LLC | BD353136 (vented cap) |
Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300062 |
Serological pipet | VWR International LLC | 53300. For 5mL (53300-421) |
Countess Cell Counting chamber | Life Technologies | C10228 |
Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | C10227 |
100 mm plates | VWR International LLC | 25382-166 |
Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol) | Life Technologies | 15596026 |
Rubber cell scraper | VWR International LLC | 82050-470 |
Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol) | Qiagen | 217004 |
Rnase-Free DNase I kit (DNA degradation) | Qiagen | 79254 |
RNase-free water (Nuclease-free water) | Thermoscientific | SH30538.02 |
Nanodrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND-1000 |
Agilent RNA 6000 Nano Assay kit | Agilent | 5067-1512 |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938C and for software (G2946) |
All primers (except TaqMan primers) | Integrated DNA Technologies | Specific per order for each gene/miRNA |
First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit) | Life Technologies | 18080085 |
MicroAmp Fast 96-Well reaction plate | Life Technologies | 4346906 |
Fast Optical Adhesive Covers | Life Technologies | 4311971 |
2X SYBR green PCR master mix (Cyanine dye) | Life Technologies | 4385612 |
7500 Fast Real-Time PCR System and software | Life Technologies | 4351106 |
μParaflo Microfluidic Biochip Technology | LCSciences | MRA-1001 and AS-2001(for result analysis) |
DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set) | Life Technologies | 4400928 |
Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit | Life Technologies | 4366596 |
GeneAmp PCR System 9700 thermocycler | Life Technologies | 4310899 |
Dual Labeled Probes (TaqMan) 2X Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG | Life Technologies | 4324018 |
7900HT Fast Real-Time PCR system | Life Technologies | 4329001 |
SDS and RQ manager softwares | Life Technologies | 4444202 |
NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit | Life Technologies | MIRC-50 |
10X DPL (TaqMan) RT primers | Life Technologies | Specific for each miRNA |
20X DPL (TaqMan) real-time assay primer | Life Technologies | Specific for each miRNA |