Aislamiento de doble negación células T αβ del Riñón
Summary
Células DNabT son raros entre las células T periféricas; sin embargo, que son abundantes en ciertos tejidos no linfoides. Dificultad de aislar las células T DN de tejidos no linfoides dificulta su análisis funcional a pesar del aumento reconocida importancia fisiopatológica. Se describe un nuevo protocolo para el aislamiento de células DN T altamente purificadas de riñón murino.
Abstract
Actualmente no hay ningún protocolo estándar para el aislamiento de células DN T de los tejidos no linfoides a pesar de su participación cada vez informado en varias respuestas inmunes. Células DN T son un tipo de célula inmune única que ha sido implicado en la regulación de las respuestas y la tolerancia inmunes y autoinmunes a alotrasplantes 1-6. Células DN T son, sin embargo, rara en la sangre periférica y órganos linfoides secundarios (bazo y nódulos linfáticos), pero son importantes los residentes de la normal del riñón. Muy poco se sabe acerca de su función fisiopatológica 7 debido a su escasez en la periferia. Recientemente hemos descrito un análisis fenotípico y funcional integral de esta población en el riñón 8 en estado estacionario y durante la lesión por isquemia-reperfusión. Análisis de la función de las células T DN se verá muy reforzada por el desarrollo de un protocolo para su aislamiento del riñón.
Aquí, se describe un nuevo protocolo que permite isolation de alta pureza + CD8 + células T CD4 AB y las células DN T de riñón murino. En pocas palabras, digerimos tejido renal mediante colagenasa y aislar las células mononucleares de riñón (KMNC) por gradiente de densidad. Esto es seguido por dos pasos para enriquecer las células T hematopoyéticas de 3% a 70% de KMNC. El primer paso consiste en una selección positiva de las células hematopoyéticas CD45 + utilizando un kit de aislamiento. En el segundo paso, las células DN T se aíslan negativamente por la eliminación de células no deseadas utilizando CD4, CD8, MHC de clase II y anticuerpos monoclonales y CD1d α-GalCer tetrámero. Esta estrategia conduce a una población de más de 90% de pureza células T DN. Tinción de la superficie con los anticuerpos mencionados anteriormente, seguido por el análisis FACS se utiliza para confirmar la pureza.
Introduction
Periférico αβTCR + CD3 + CD4 – CD8 – doble negativa células (DN) T se dividen en varios subconjuntos que poseen fenotipos y funciones 1-4 distintos. DN células T, son poco conocidos, pero cada vez más implicados en la respuesta inmune fisiopatológicos en diferentes modelos de enfermedad 4-6.
Células DN T son un tipo de célula inmune única que está implicada cada vez más en la regulación de diversas respuestas inmunes y autoinmunes y la modulación de la tolerancia alotrasplante. 4-6, 9 son raros en la sangre periférica y órganos linfoides secundarios (bazo y los ganglios linfáticos ). Sin embargo, son importantes los residentes del riñón y el intestino epitelio normal 10-12. Muy poco se sabe acerca de su función 7 en el riñón en el estado estacionario y en condiciones patológicas como la lesión renal aguda (LRA) asociado con trasplantación de riñónhormiga.
Debido a las funciones complejas de diferentes células inmunes en la regulación de respuestas inmunes incluyendo alloresponses, definir el papel de cada jugador es fundamental para entender alloresponses y el diseño de nuevas terapias. Teniendo en cuenta los números significativos de células DN T presentes en el riñón bajo condiciones fisiológicas y de enfermedad diferentes, las células DN T es probable que desempeñen un papel crítico en la regulación de respuestas inmunes y autoinmunes en ratones y seres humanos, y alloresponses en receptores de trasplante. La acumulación de pruebas, aunque todavía dispersos implica células T DN en ambas funciones patogénicas e inmunosupresores, pero no se comprende bien por qué y cómo se exhiben una función perjudicial o supresora específica y cómo el ambiente influye en ellos.
Debido a su baja abundancia en el riñón, mejora de los métodos de aislamiento son necesarios.
Actualmente no hay ningún protocolo estándar para el aislamiento de células DN T de Tél tejidos no linfoides. Nuestro protocolo describe un nuevo método para el aislamiento de células DN T de los riñones; Sin embargo, el método también se puede utilizar para diversos tejidos no linfoides.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existe un interés creciente en las células T DN ya que están siendo implicados en diferentes condiciones patológicas tales como enfermedades autoinmunes, el cáncer, la tolerancia del injerto, y las enfermedades primarias del riñón incluyendo lesión renal aguda (LRA), glomerulonefritis 8, 13. Por lo tanto, no hay necesidad de entender mejor y caracterizar las funciones fisiopatológicas de las células T DN. Sin embargo, actualmente hay una falta de comprensión de la función de estas células en comp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por el NIH PBS (R21 AI095484). Damos las gracias a instalaciones básicas tetrámero NHI para CD1d tetrámero.
Materials
| Laminar flow hood | Baker Company, Inc | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Atmosphere-controlled incubator | Fisher Scientific | (37°C with 5% CO2) | |
| Microscope | Olympus | Or equivalent equipment | |
| Analytical flow cytometer | LSR II | ||
| Name of the reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Media Tech | 10-040-CV | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Fetal bovine serum | Corning Cellgro | 35-011-CV | |
| 0.1% sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Buffer phosphate buffered saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| PBS 10X | Mediatech | 46-013-CM | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | E1161 | |
| LS columns | MiltenyiBiotec | 130-042-401 | |
| CD45+ microbeads | MiltenyiBiotec | 6.78E-51 | |
| Biotin microbeads | MiltenyiBiotec | 130-090-485 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) PerCP | eBioscience | G1397 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) APC-Cy7 | Biolegend | 103116 | |
| anti-TCR Pacific Blue (ab-chain, clone: H57-597) | Invitrogen | HM3628 | |
| anti-CD4 PE | eBioscience | 12-0043 | |
| anti-CD8 FITC | eBioscience | 8011-0087 | |
| anti-CD4 biotinylated (GK1.5) | BD | 553728 | |
| anti-CD8 biotinylated (clone 53-6.7) | BD | 553029 | |
| anti-Fc receptor (CD16/32) biotinylated | BD | 553143 | |
| anti-MHC class II (I-A d) biotinylated | BD | 553609 | |
| anti-CD1d PBS-57 tetramer | NHI tetramer | lote # 15621-PBS57 | |
| AutoMACS Running Buffer- MACS Separation Buffer | MIlteny I Biotec | 130-091-221 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Kidneys – Lymph Nodes |
| Petri dish | BD Biosciences | 356517 | |
| 70mc filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Plunger | Or equivalent equipment | ||
| GeneMate Tubes 50 ml | Bioexpress | C-3394-3 | Or equivalent equipment |
| GeneMate Tubes 15 ml | Bioexpress | C-3394-1 | Or equivalent equipment |
| Petri Dish | Fisher Scientific | S33580 | |
| Plate 24 wells | BD Biosciences | 354723 |
References
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