Isolatie van Double Negative αβ T-cellen uit de nier
Summary
DNabT cellen zijn zeldzaam onder perifere T-cellen; maar ze zijn er in overvloed in bepaalde niet-lymfoïde weefsels. Moeilijkheid van het isoleren van DN T-cellen van niet-lymfeweefsel belemmert hun functionele analyse Ondanks toenemende erkend pathofysiologische betekenis. We beschrijven een nieuw protocol voor isolatie van hooggezuiverde DN T-cellen van muizen nier.
Abstract
Er is geen standaard protocol voor de isolatie van DN T-cellen van de niet-lymfoïde weefsels ondanks hun betrokkenheid vaker gerapporteerd in verschillende immuunresponsen. DN T-cellen een uniek immuun celtype dat is betrokken bij regulering van immuun-en auto-immuunreacties en tolerantie voor allotransplants 1-6. DN T-cellen zijn echter zeldzaam in perifeer bloed en secundaire lymfoïde organen (milt en lymfeknopen), maar zijn belangrijke inwoners van de normale nier. Er is zeer weinig bekend over hun pathofysiologische functies 7 vanwege hun gebrek in de periferie. We hebben recent beschreven een uitgebreide fenotypische en functionele analyse van deze populatie in de nieren 8 in stationaire toestand als tijdens ischemie reperfusie schade. Analyse van DN T-cel functie zal aanzienlijk worden uitgebreid door het ontwikkelen van een protocol voor de isolatie van de nier.
Hier beschrijven we een nieuw protocol dat toelaat Isolation van zeer zuivere ab CD4 + CD8 + T-cellen en DN T-cellen van de muis nieren. Kortom, wij verteren nierweefsel met collagenase en isoleren nier cellen (KMNC) door dichtheidsgradiënt. Dit wordt gevolgd door twee stappen hematopoietische T-cellen verrijken van 3% tot 70% van KMNC. De eerste stap bestaat uit een positieve selectie van hematopoïetische cellen met behulp van een CD45 + isolatie kit. In de tweede stap worden DN T-cellen negatief geïsoleerd door verwijdering van niet-gewenste cellen met CD4, CD8 en MHC klasse II monoklonale antilichamen en CD1d α-GalCer tetrameer. Deze strategie leidt tot een populatie van meer dan 90% zuiver DN T-cellen. Oppervlak kleuring met bovengenoemde antilichamen gevolgd door FACS-analyse wordt gebruikt om de zuiverheid te bevestigen.
Introduction
Perifere αβTCR + CD3 + CD4 – CD8 – dubbel-negatieve (DN) T-cellen zijn onderverdeeld in verschillende subgroepen die verschillende fenotypes en functies 1-4 bezitten. DN T-cellen worden slecht begrepen, maar in toenemende mate betrokken bij pathofysiologische immuunreacties in verschillende ziektemodellen 4-6.
DN T-cellen een uniek immuun celtype die steeds betrokken bij de regulatie van verschillende immuun-en auto-immune reacties en de modulatie van allotransplant tolerantie. 4-6, 9 zijn zeldzaam in het perifere bloed en secundaire lymfoïde organen (milt en lymfeklieren ). Ze zijn echter belangrijke inwoners van de normale nier en darmepitheel 10-12. Er is zeer weinig bekend over de functie 7 van de nier bij de statische en onder pathologische omstandigheden zoals acute nierschade (AKI) geassocieerd met nier Transplmier.
Vanwege de ingewikkelde rol van de verschillende immuuncellen in het reguleren van immuunreacties waaronder alloresponses, het definiëren van de rol van elke speler is van cruciaal belang in het begrijpen alloresponses en het ontwerpen van nieuwe therapieën. Gezien de grote aantallen DN T-cellen in de nieren onder fysiologische en andere ziektetoestanden, DN T-cellen waarschijnlijk een kritieke rol in het reguleren immuun-en auto-immuunreacties in muizen en mensen, en alloresponses spelen bij transplantatiepatiënten. Accumuleren hoewel nog steeds verspreid bewijs impliceert DN T-cellen in zowel pathogene en immunosuppressieve functies, maar het is slecht begrepen waarom en hoe ze vertonen een specifiek schadelijk of onderdrukkende functie en hoe de omgeving beïnvloedt hen.
Door hun geringe hoeveelheden in de nier, verbeterde methoden van isolatie noodzakelijk.
Er is geen standaard protocol voor isolatie van DN T-cellen van thij niet-lymfoïde weefsels. Het protocol beschrijft een nieuwe werkwijze voor het isoleren van DN T-cellen van de nier; Echter kan de werkwijze ook worden gebruikt voor verschillende niet-lymfoïde weefsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er is steeds meer belangstelling DN T-cellen omdat ze worden betrokken bij verschillende pathologische aandoeningen zoals auto-immuunziekten, kanker, ent tolerantie en primaire ziekten van de nier, waaronder acute nierschade (AKI), glomerulonefritis 8, 13. Daarom is er behoefte aan een beter inzicht karakteriseren pathofysiologische functies van DN T-cellen. Echter, momenteel is er een gebrek aan inzicht in functie van deze cellen ten opzichte van CD4 en CD8 T-cellen. Een belangrijke reden is gebrek van DN T-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door NIH PBS (R21 AI095484). Wij danken NHI tetramer kern faciliteit voor CD1d tetrameer.
Materials
| Laminar flow hood | Baker Company, Inc | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Atmosphere-controlled incubator | Fisher Scientific | (37°C with 5% CO2) | |
| Microscope | Olympus | Or equivalent equipment | |
| Analytical flow cytometer | LSR II | ||
| Name of the reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Media Tech | 10-040-CV | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Fetal bovine serum | Corning Cellgro | 35-011-CV | |
| 0.1% sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Buffer phosphate buffered saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| PBS 10X | Mediatech | 46-013-CM | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | E1161 | |
| LS columns | MiltenyiBiotec | 130-042-401 | |
| CD45+ microbeads | MiltenyiBiotec | 6.78E-51 | |
| Biotin microbeads | MiltenyiBiotec | 130-090-485 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) PerCP | eBioscience | G1397 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) APC-Cy7 | Biolegend | 103116 | |
| anti-TCR Pacific Blue (ab-chain, clone: H57-597) | Invitrogen | HM3628 | |
| anti-CD4 PE | eBioscience | 12-0043 | |
| anti-CD8 FITC | eBioscience | 8011-0087 | |
| anti-CD4 biotinylated (GK1.5) | BD | 553728 | |
| anti-CD8 biotinylated (clone 53-6.7) | BD | 553029 | |
| anti-Fc receptor (CD16/32) biotinylated | BD | 553143 | |
| anti-MHC class II (I-A d) biotinylated | BD | 553609 | |
| anti-CD1d PBS-57 tetramer | NHI tetramer | lote # 15621-PBS57 | |
| AutoMACS Running Buffer- MACS Separation Buffer | MIlteny I Biotec | 130-091-221 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Kidneys – Lymph Nodes |
| Petri dish | BD Biosciences | 356517 | |
| 70mc filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Plunger | Or equivalent equipment | ||
| GeneMate Tubes 50 ml | Bioexpress | C-3394-3 | Or equivalent equipment |
| GeneMate Tubes 15 ml | Bioexpress | C-3394-1 | Or equivalent equipment |
| Petri Dish | Fisher Scientific | S33580 | |
| Plate 24 wells | BD Biosciences | 354723 |
References
- Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med. 6, 782-789 (2000).
- Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo. J Exp Med. 196, 261-267 (2002).
- Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression. J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).
- Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells. Blood. 100, 3408-3414 (2002).
- Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice. Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).
- Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells. J Immunol. 171, 134-141 (2003).
- Mohamood, A. S., et al. Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells. Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).
- Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).
- Hamad, A. R., et al. B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production. J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).
- Rabb, H., et al. Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).
- Burne, M. J., et al. Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).
- Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation. 74, 759-763 (2002).
- Crispin, J. C., et al. Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys. J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).
- Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice. Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).
- Dowdell, K. C., et al. Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome. Blood. 115, 5164-5169 (2010).
- Juvet, S. C., et al. FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice. J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).
- Thomson, C. W., et al. FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function. J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).
