Summary

Выделение Double Negative αβ Т-клеток из почек

Published: May 16, 2014
doi:

Summary

DNabT клетки редки среди периферийных Т-клеток; однако, они широко распространены в определенных нелимфоидных тканей. Сложность выделения DN Т-клеток от не-лимфоидной ткани препятствует их функционального анализа, несмотря на рост признал патофизиологического значение. Мы опишем протокол нового для изоляции высокоочищенных DN Т-клеток из мышиных почки.

Abstract

Там в настоящее время нет стандартный протокол для выделения DN Т-клеток от не-лимфоидных тканях, несмотря на их более сообщил участия в различных иммунных реакций. DN Т-клетки являются уникальной иммунной тип клеток, который был вовлечен в регуляции иммунных и аутоиммунных реакций и толерантность к аллотрансплантаты 1-6. DN Т-клетки, однако, редко встречается в периферической крови и вторичных лимфоидных органах (селезенке и лимфатических узлах), но являются основными жители здоровую почку. Очень мало известно об их патофизиологической функции 7 из-за их малочисленности на периферии. Мы недавно описал комплексную фенотипическую и функциональный анализ этой группы населения в почках 8 в стационарном состоянии и во время ишемии реперфузионного повреждения. Анализ функции DN Т-клеток будет значительно повышена путем разработки протокола для их изоляции от почки.

Здесь мы описываем новый протокол, позволяющий isolatioн высокочистых AB CD4 + CD8 + Т-клеток и DN Т-клеток от мышей почки. Вкратце, мы переварить ткань почки с помощью коллагеназы и изолировать почек одноядерные клетки (KMNC) по градиенту плотности. Далее следуют два этапа по обогащению гемопоэтических Т-клетки с 3% до 70% от KMNC. Первый шаг состоит из позитивной селекции кроветворных клеток с использованием CD45 + набор для выделения. На втором этапе, DN Т-клетки негативно выдел ют путем удалени не-желательных клеток с использованием CD4, CD8 и МНС класса II моноклональные антитела и CD1d α-GalCer тетрамер. Эта стратегия приводит к населением более 90% чистых DN Т-клеток. Поверхность окрашивание указанных выше антител с последующим анализом FACS используется для подтверждения чистоты.

Introduction

Периферийное αβTCR + CD3 + CD4 CD8 дважды отрицательный (DN) Т-клетки делятся на различные подмножества, которые обладают различные фенотипы и функции 1-4. DN Т-клетки плохо изучены, но все чаще участвуют в патофизиологических иммунных реакций в различных моделях болезни 4-6.

DN Т-клетки представляют собой уникальный тип клеток иммунной что все чаще участвует в регуляции различных иммунных и аутоиммунных реакций и модуляции аллотрансплантата толерантности. 4-6, 9 Они редки в периферической крови и вторичных лимфоидных органах (селезенке и лимфатических узлах ). Тем не менее, они являются основными жителями нормальной почек и кишечника эпителия 10-12. Очень мало известно об их функции 7 в почках в стационарном состоянии и при патологических состояниях, таких как острого повреждения почек (AKI), связанные с почечной Transplмуравей.

Из-за сложных ролей различных иммунных клеток в регуляции иммунных реакций, включая alloresponses, определение роли каждого игрока имеет решающее значение в понимании alloresponses и разработке новых терапевтических средств. Учитывая значительное число DN Т-клеток, присутствующих в почках под физиологических и различных болезненных состояний, Д. Н. Т-клетки, вероятно, играют важную роль в регуляции иммунных и аутоиммунных реакций у мышей и людей, и alloresponses в реципиентов. Накопление хотя все еще рассеянного доказательств подразумевает DN Т-клеток в обоих патогенных и иммуносупрессивных функций, но он плохо понимал, почему и как они проявляют определенную вредных или подавляющий функцию и, как окружающая среда влияет на них.

Из-за их низкой численности в почках, улучшенные методы выделения необходимы.

Там в настоящее время нет стандартный протокол для изоляции Ду Т-клеток из тон не-лимфоидных тканей. Наш протокол описывает новый способ для выделения DN Т-клеток из почки; Однако способ также может быть использован для различных нелимфоидных тканей.

Protocol

1. Подготовка инструментов, питательных сред и реактивов Инструменты: Подготовка реагентов в стерильных условиях и использовать под ламинаре. Подготовка 1 л RPMI тканевой культуральной среде, добавляют 5% фетальной бычьей сыворотки, 2,1 г бикарбоната, 10 мл глутамат 100x 10 мг HEPES, 1 м?…

Representative Results

Дикого типа C57BL / 6 (В6) почки содержит около 1,5-2,1 х 10 6 мононуклеаров на почки. Примерно менее 10% являются гемопоэтические клетки CD45 +. Для приготовления почек мононуклеарных клеток (KMNC), почки разрезают на маленькие кусочки, как показано на рисунке 1 с последующим расще?…

Discussion

Существует растущий интерес к DN Т-клеток, так как они в настоящее время участвуют в различных патологических состояний, таких как аутоиммунные расстройства, рак, терпимости трансплантата и первичных заболеваний почек, включая острого повреждения почек (AKI), гломерулонефрит 8, 13. Т?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа поддерживается NIH PBS (R21 AI095484). Мы благодарим NHI тетрамерное основной объект для CD1d тетрамере.

Materials

Laminar flow hood  Baker Company, Inc Or equivalent equipment 
Centrifuge Beckman Coulter Or equivalent equipment 
Hemocytometer Electron Microscopy Sciences 63514-11
Atmosphere-controlled incubator Fisher Scientific  (37°C with 5% CO2)
Microscope  Olympus Or equivalent equipment 
Analytical flow cytometer LSR II 
Name of the reagent Company  Catalog  Number Comments 
RPMI 1640 Media Tech 10-040-CV
Collagenase D Roche 11088858001
Percoll  GE Healthcare  17-0891-01
Fetal bovine serum  Corning Cellgro 35-011-CV
0.1% sodium azide (NaN3) Sigma-Aldrich  S2002
Buffer phosphate buffered saline (PBS) Corning Cellgro 21-040-CV
PBS 10X Mediatech 46-013-CM
EDTA buffer  Sigma-Aldrich  E1161
LS columns  MiltenyiBiotec 130-042-401
CD45+ microbeads MiltenyiBiotec 6.78E-51
Biotin microbeads  MiltenyiBiotec 130-090-485
anti-CD45 (clone: 30-F11)  PerCP  eBioscience  G1397
anti-CD45 (clone: 30-F11)  APC-Cy7 Biolegend   103116
anti-TCR Pacific Blue  (ab-chain, clone: H57-597) Invitrogen HM3628
anti-CD4 PE eBioscience  12-0043
anti-CD8 FITC eBioscience  8011-0087
anti-CD4 biotinylated (GK1.5) BD 553728
anti-CD8 biotinylated  (clone 53-6.7) BD 553029
anti-Fc receptor (CD16/32) biotinylated BD 553143
anti-MHC class II (I-A d) biotinylated BD 553609
anti-CD1d PBS-57 tetramer NHI tetramer  lote # 15621-PBS57
AutoMACS Running Buffer-  MACS Separation Buffer  MIlteny I Biotec 130-091-221
C57BL/6J mice Jackson Labs 000664 Kidneys – Lymph Nodes
Petri dish  BD Biosciences 356517
70mc filter  Fisher Scientific 22363548
Plunger  Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 50 ml Bioexpress C-3394-3 Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 15 ml Bioexpress C-3394-1 Or equivalent equipment 
Petri Dish  Fisher Scientific S33580
Plate 24 wells  BD Biosciences 354723

References

  1. Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med. 6, 782-789 (2000).
  2. Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo. J Exp Med. 196, 261-267 (2002).
  3. Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression. J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).
  4. Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells. Blood. 100, 3408-3414 (2002).
  5. Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice. Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).
  6. Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells. J Immunol. 171, 134-141 (2003).
  7. Mohamood, A. S., et al. Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells. Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).
  8. Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).
  9. Hamad, A. R., et al. B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production. J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).
  10. Rabb, H., et al. Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).
  11. Burne, M. J., et al. Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).
  12. Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation. 74, 759-763 (2002).
  13. Crispin, J. C., et al. Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys. J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).
  14. Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice. Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).
  15. Dowdell, K. C., et al. Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome. Blood. 115, 5164-5169 (2010).
  16. Juvet, S. C., et al. FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice. J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).
  17. Thomson, C. W., et al. FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function. J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).

Play Video

Cite This Article
Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney. J. Vis. Exp. (87), e51192, doi:10.3791/51192 (2014).

View Video