腎臓からの二重否定αβT細胞の分離
Summary
DNabT細胞は、末梢T細胞の中で稀であり;しかし、彼らは、特定の非リンパ組織に豊富に存在する。非リンパ組織からDN T細胞を単離することの難しさを認識病態生理学的有意性を増加させるにもかかわらず、それらの機能解析を妨げる。我々は、マウスの腎臓からの高度に精製されたDN T細胞の単離のための新規なプロトコルを記載している。
Abstract
非リンパ組織から、DN T細胞を単離するための標準的なプロトコルは、さまざまな免疫応答でのますます報告された関与にもかかわらず、現在ありません。 DN T細胞はallotransplants 1-6に免疫および自己免疫応答と寛容の調節に関与しているユニークな免疫細胞型である。 DN T細胞は、しかしながら、末梢血および二次リンパ器官（脾臓およびリンパ節）において稀であるが、正常な腎臓の主要な居住者である。非常に少ない起因周辺での不足への病態生理学的機能7についてはほとんど知られていない。我々は最近、定常状態でおよび虚血再灌流障害時に腎臓8でこの集団の包括的表現型および機能解析を説明した。 DN T細胞機能の分析が大幅に腎臓からのそれらの単離のためのプロトコルを開発することによって強化される。
ここでは、isolatioを可能にする新たなプロトコルを記述マウス腎臓由来の高純度AB CD4 + CD8 + T細胞およびDN T細胞のnである。手短に言えば、我々は、コラゲナーゼを用いて腎組織を消化し、密度勾配によって腎臓単核細胞（KMNC）を単離する。これはKMNCから3％〜70％の造血T細胞を濃縮するために二つのステップが続く。最初のステップは、CD45 +単離キットを使用して、造血細胞の正の選択で構成されています。第二段階において、DN T細胞は負にCD4、CD8、およびMHCクラスIIモノクローナル抗体およびCD1dのα-GalCer類似四量体を用いた非所望の細胞の除去によって単離される。この戦略は、90％以上純粋なDN T細胞の集団をもたらす。 FACS分析に続いて、上述した抗体による表面染色は、純度を確認するために使用される。
Introduction
周辺αβTCR+ CD3 + CD4 – CD8 –ダ ブルネガティブ（DN）T細胞は、明確な表現型を有し、1〜4機能の様々な部分集合に分割される。 DN T細胞は、あまり理解されていますが、ますます異なる疾患モデル4-6の病態生理学的な免疫応答に関与している。
DN T細胞は、ますます様々な免疫および自己免疫応答の調節および同種移植寛容の調節に関与しているユニークな免疫細胞型である。4-6、9彼らは、末梢血および二次リンパ器官（脾臓及びリンパ節ではまれである）。しかし、彼らは正常な腎臓や腸上皮10月12日の主な居住者である。非常に少ないが、定常状態で、そのような腎臓transplに関連した急性腎障害（AKI）のような病理学的条件の下で、腎臓における機能7についてはほとんど知られていないANT。
なぜならalloresponsesを含む免疫応答を調節する上で様々な免疫細胞の複雑な役割のため、各プレイヤーの役割を定義するalloresponsesを理解し、新しい治療法を設計する上で非常に重要です。生理学的および異なる疾患状態の下で腎臓中に存在するDN T細胞の有意な数が指定され、DN T細胞は、移植レシピエントにおける免疫および自己免疫マウスおよびヒトにおける応答、およびalloresponsesの調節に重要な役割を果たしている可能性が高い。まだ散乱証拠かかわら蓄積すると、両方の病原性および免疫抑制機能のDN T細胞を関与しかし、なぜ、どのように特定の有害または抑制機能を発揮し、環境がそれらにどのように影響するかは十分に理解されていない。
により腎臓での少量に、分離する改良された方法が必要である。
Tから、DN T細胞を単離するための標準プロトコルが現在ありません彼は、非リンパ組織。我々のプロトコルは、腎臓からDN T細胞の単離のための新規な方法を記載している;しかしながら、この方法はまた、種々の非リンパ系組織のために使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
彼らはそのような自己免疫疾患、癌、移植性、および急性腎障害（AKI）を含む腎臓の原疾患、糸球体腎炎8、13の異なる病態に関与していることから、DN T細胞中の関心が高まっている。したがって、より良好なDN T細胞の病態生理学的機能を理解し、特徴付ける必要がある。しかしながら、現在CD4およびCD8 T細胞と比較して、これらの細胞の機能を理解する上で不足している。主な理由?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIHのPBS（R 21 AI095484）によってサポートされています。私たちは、CD1dの四量体のために薬価四量体中核施設に感謝します。
Materials
| Laminar flow hood | Baker Company, Inc | Or equivalent equipment | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Atmosphere-controlled incubator | Fisher Scientific | (37°C with 5% CO2) | |
| Microscope | Olympus | Or equivalent equipment | |
| Analytical flow cytometer | LSR II | ||
| Name of the reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Media Tech | 10-040-CV | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Fetal bovine serum | Corning Cellgro | 35-011-CV | |
| 0.1% sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Buffer phosphate buffered saline (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| PBS 10X | Mediatech | 46-013-CM | |
| EDTA buffer | Sigma-Aldrich | E1161 | |
| LS columns | MiltenyiBiotec | 130-042-401 | |
| CD45+ microbeads | MiltenyiBiotec | 6.78E-51 | |
| Biotin microbeads | MiltenyiBiotec | 130-090-485 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) PerCP | eBioscience | G1397 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) APC-Cy7 | Biolegend | 103116 | |
| anti-TCR Pacific Blue (ab-chain, clone: H57-597) | Invitrogen | HM3628 | |
| anti-CD4 PE | eBioscience | 12-0043 | |
| anti-CD8 FITC | eBioscience | 8011-0087 | |
| anti-CD4 biotinylated (GK1.5) | BD | 553728 | |
| anti-CD8 biotinylated (clone 53-6.7) | BD | 553029 | |
| anti-Fc receptor (CD16/32) biotinylated | BD | 553143 | |
| anti-MHC class II (I-A d) biotinylated | BD | 553609 | |
| anti-CD1d PBS-57 tetramer | NHI tetramer | lote # 15621-PBS57 | |
| AutoMACS Running Buffer- MACS Separation Buffer | MIlteny I Biotec | 130-091-221 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Labs | 000664 | Kidneys – Lymph Nodes |
| Petri dish | BD Biosciences | 356517 | |
| 70mc filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Plunger | Or equivalent equipment | ||
| GeneMate Tubes 50 ml | Bioexpress | C-3394-3 | Or equivalent equipment |
| GeneMate Tubes 15 ml | Bioexpress | C-3394-1 | Or equivalent equipment |
| Petri Dish | Fisher Scientific | S33580 | |
| Plate 24 wells | BD Biosciences | 354723 |
References
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