Summary

Isolierung von Double Negative αβ T-Zellen aus der Niere

Published: May 16, 2014
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Summary

DNabT Zellen sind selten unter peripheren T-Zellen; aber reichlich sind sie in bestimmten Nicht-lymphatischen Gewebe. Schwierigkeitsgrad der Isolierung DN T-Zellen von nicht-lymphatischen Gewebe behindert ihre Funktionsanalyse trotz steigender erkannt pathophysiologische Bedeutung. Wir beschreiben eine neue Methode zur Isolierung von hoch gereinigten DN T-Zellen aus murinen Niere.

Abstract

Derzeit gibt es keine Standard-Protokoll für die Isolierung von DN-T-Zellen von den nicht-lymphatischen Gewebe trotz ihrer zunehmend berichtet Beteiligung an verschiedenen Immunantworten. DN-T-Zellen sind eine einzigartige Immunzelltyp, der bei der Regulierung der Immun-und Autoimmunreaktionen und Toleranz zu allotransplants 1-6 gebracht wurde. DN-T-Zellen sind jedoch selten im peripheren Blut und sekundären lymphatischen Organen (Milz und Lymphknoten), jedoch sind die Haupt Bewohner der normalen Niere. Sehr wenig ist über die pathophysiologische Funktion 7 aufgrund ihrer Mangel in dem Umfang bekannt. Wir haben vor kurzem beschrieben, eine umfassende phänotypische und funktionelle Analyse dieser Bevölkerung in der Niere 8 in stationären und während der Ischämie Reperfusion. Analyse der DN-T-Zell-Funktion wird stark durch die Entwicklung eines Protokolls für ihre Isolation von der Niere verbessert werden.

Hier ein neues Protokoll, das ermöglicht isolatio beschreiben wirn von hochreinem ab CD4 + CD8 + T-Zellen und DN-T-Zellen aus der Maus-Nieren. Kurz gesagt, wir verdauen Nierengewebe mittels Collagenase und zu isolieren, Nierenmononuklearen Zellen (KMNC) durch Dichtegradientenzentrifugation. Dies wird durch zwei Schritte auf hämatopoetischen T-Zellen von 3% bis 70%, gefolgt von KMNC bereichern. Der erste Schritt besteht aus einer positiven Selektion von hämatopoetischen Zellen mit einer CD45 +-Isolierungs-Kit. Im zweiten Schritt werden negativ DN-T-Zellen durch Entfernen von nicht-gewünschten Zellen mit CD4, CD8, MHC Klasse II und monoklonale Antikörper und CD1d α-GalCer Tetramer isoliert. Diese Strategie führt zu einer Bevölkerung von mehr als 90% rein DN T-Zellen. Oberflächenfärbung mit den oben erwähnten Antikörper, gefolgt von FACS-Analyse wird verwendet, um die Reinheit zu bestätigen.

Introduction

Periphere αβTCR + CD3 + CD4 CD8 doppelt-negative (DN) T-Zellen werden in verschiedene Untergruppen, die unterschiedliche Phänotypen und Funktionen besitzen 1-4 unterteilt. DN-T-Zellen sind wenig verstanden, aber zunehmend auch in pathophysiologischen Immunantworten in verschiedenen Krankheitsmodellen 4-6 verwickelt.

DN-T-Zellen sind eine einzigartige Immunzelltyp, der immer an der Regulation von verschiedenen Immun-und Autoimmunreaktionen und die Modulation der Allotransplantat-Toleranz in Verbindung gebracht wird. 4-6, 9 Sie sind selten im peripheren Blut und sekundären lymphatischen Organen (Milz und Lymphknoten ). Allerdings sind sie großen Bewohner der normalen Nieren-und Darmepithel 10-12. Sehr wenig ist über ihre Funktion 7 in der Niere im stationären Zustand und unter pathologischen Bedingungen, wie akute Nierenschädigung (AKI) mit Nieren Transpl. verbundenen bekanntAmeise.

Wegen der komplizierten Rollen der verschiedenen Immunzellen bei der Regulierung der Immunantworten einschließlich alloresponses, die Definition der Rolle der einzelnen Spieler ist entscheidend für das Verständnis alloresponses und Gestaltung neuer Therapeutika. Angesichts der erheblichen Zahl von DN-T in der Niere unter physiologischen und unterschiedliche Krankheitszustände vorliegenden Zellen sind DN-T-Zellen wahrscheinlich eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Immun-und Autoimmunreaktionen in Mäusen und Menschen, und alloresponses bei Transplantatempfängern spielen. Thesaurierend wenn auch noch zerstreut Beweise bringen DN-T-Zellen in beiden pathogenen und immunsuppressive Funktionen, aber es ist schlecht verstanden, warum und wie sie eine spezifische schädliche oder drück Funktion aufweisen und wie die Umwelt beeinflusst sie.

Aufgrund ihrer geringen Menge in der Niere, sind verbesserte Verfahren zur Isolierung erforderlich.

Derzeit gibt es keine Standard-Protokoll für die Isolierung von DN T-Zellen von ter nicht-lymphatischen Geweben. Unser Protokoll beschreibt ein neues Verfahren zur Isolierung von DN-T-Zellen aus der Niere; Jedoch kann das Verfahren auch für verschiedene nicht-lymphoiden Geweben verwendet werden.

Protocol

1. Vorbereitung der Instrumente, Kultur, Medien und Reagenzien Instrumente: Bereiten Sie die Reagenzien unter sterilen Bedingungen und unter Verwendung einer Steril. Herstellung von 1 l RPMI-Gewebekulturmedium mit 5% fötalem Rinderserum, 2,1 g Natriumbicarbonat, 10 ml Glutamat 100x, 10 mg HEPES, 1 mg Natriumpyruvat und 10 ml 100x Penicillin / Streptomycin. Hinweis: Die empfohlene Gewebekulturmedium RPMI, ist austauschbar mit DMEM. Vorbereitung 5% Collagenase "D"-Lösung (…

Representative Results

Wildtyp C57BL / 6 (B6) Niere enthält etwa 1,5 bis 2,1 x 10 6 mononuklearen Zellen pro Niere. Weniger als etwa 10% hämatopoetische CD45 +-Zellen. Für die Herstellung von Nieren mononukleären Zellen (KMNC) werden die Nieren in kleine Stücke geschnitten, wie in Fig. 1 gezeigt, gefolgt von Verdauung mit Collagenase 5%. Dies wird durch Durchführen einer Dichte-Gradienten-Zentrifugation auf KMNC Schicht (Fig. 2, links) zu sammeln, gefol…

Discussion

Es gibt immer mehr Interesse an DN-T-Zellen, da sie, die in verschiedenen pathologischen Bedingungen, wie Autoimmunerkrankungen, Krebs, Transplantat-Toleranz und primären Erkrankungen der Niere einschließlich akuten Nierenschädigung (AKI) in Verbindung gebracht, Glomerulonephritis 8, 13. Daher besteht Bedarf, die pathophysiologische Funktionen DN-T-Zellen besser zu verstehen und zu charakterisieren. Derzeit jedoch mangelt es in Verständnis der Funktion dieser Zellen im Vergleich zu CD4 und CD8 T-Zellen. E…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wird von NIH PBS (R21 AI095484) unterstützt. Wir danken NHI Tetramer Core Facility für CD1d Tetramer.

Materials

Laminar flow hood  Baker Company, Inc Or equivalent equipment 
Centrifuge Beckman Coulter Or equivalent equipment 
Hemocytometer Electron Microscopy Sciences 63514-11
Atmosphere-controlled incubator Fisher Scientific  (37°C with 5% CO2)
Microscope  Olympus Or equivalent equipment 
Analytical flow cytometer LSR II 
Name of the reagent Company  Catalog  Number Comments 
RPMI 1640 Media Tech 10-040-CV
Collagenase D Roche 11088858001
Percoll  GE Healthcare  17-0891-01
Fetal bovine serum  Corning Cellgro 35-011-CV
0.1% sodium azide (NaN3) Sigma-Aldrich  S2002
Buffer phosphate buffered saline (PBS) Corning Cellgro 21-040-CV
PBS 10X Mediatech 46-013-CM
EDTA buffer  Sigma-Aldrich  E1161
LS columns  MiltenyiBiotec 130-042-401
CD45+ microbeads MiltenyiBiotec 6.78E-51
Biotin microbeads  MiltenyiBiotec 130-090-485
anti-CD45 (clone: 30-F11)  PerCP  eBioscience  G1397
anti-CD45 (clone: 30-F11)  APC-Cy7 Biolegend   103116
anti-TCR Pacific Blue  (ab-chain, clone: H57-597) Invitrogen HM3628
anti-CD4 PE eBioscience  12-0043
anti-CD8 FITC eBioscience  8011-0087
anti-CD4 biotinylated (GK1.5) BD 553728
anti-CD8 biotinylated  (clone 53-6.7) BD 553029
anti-Fc receptor (CD16/32) biotinylated BD 553143
anti-MHC class II (I-A d) biotinylated BD 553609
anti-CD1d PBS-57 tetramer NHI tetramer  lote # 15621-PBS57
AutoMACS Running Buffer-  MACS Separation Buffer  MIlteny I Biotec 130-091-221
C57BL/6J mice Jackson Labs 000664 Kidneys – Lymph Nodes
Petri dish  BD Biosciences 356517
70mc filter  Fisher Scientific 22363548
Plunger  Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 50 ml Bioexpress C-3394-3 Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 15 ml Bioexpress C-3394-1 Or equivalent equipment 
Petri Dish  Fisher Scientific S33580
Plate 24 wells  BD Biosciences 354723

References

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Cite This Article
Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney. J. Vis. Exp. (87), e51192, doi:10.3791/51192 (2014).

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