JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

Устройство и принцип действия непрерывного<sup> 13</sup> С и<sup> 15</sup> N Маркировка палата для Uniform или дифференциальный, Метаболический и структурная, завод Изотоп Маркировка

Published: January 16, 2014
doi:
10.3791/51117
, , , , , ,
1Natural Resource Ecology Laboratory,Colorado State University, 2Soil Plant Nutrient REsearch,USDA-ARS, 3Department of Soil and Crop Sciences,Colorado State University

Summary

Этот метод объясняет, как построить и управлять непрерывный 13 С и 15 N изотопного мечения камеру для равномерной или ткани маркировки дифференциал растений. Обсуждаются Представитель результаты от метаболических и структурных маркировки Andropogon gerardii.

Abstract

Трассировка редкие стабильные изотопы из растительного материала через экосистему обеспечивает наиболее конфиденциальную информацию о экосистемных процессов, от CO 2 потоки и формирование органическое вещество почвы до малого стабильной изотопной биомаркеров зондирования. Соединительная несколько стабильных изотопов, таких как 13 С с 15 Н, 18 О или 2 Н имеет потенциал, чтобы раскрыть еще больше информации о сложных стехиометрических отношений при биогеохимических превращений. Изотоп помечены растительный материал был использован в различных исследованиях помета разложения и образования органического вещества почвы 1-4. Из этих и других исследований, однако, стало очевидным, что структурные компоненты растительного материала ведут себя иначе, чем метаболических компонентов (т.е.. Вымываемые низкомолекулярных соединений) с точки зрения микробного использования и долговременного хранения углерода 5-7. Возможность изучения структурных и метаболических компонентовотдельно обеспечивает новый мощный инструмент для продвижения в авангарде экосистемных биогеохимических исследований. Здесь мы описываем способ получения 13 С и 15 N меченого растительный материал, который либо равномерно меченного по всему растению или дифференциально помечены в структурных и метаболических растительных компонентов.

Здесь мы представляем строительство и эксплуатацию непрерывного 13 С и 15 N маркировки камеры, которые можно модифицировать для удовлетворения различных потребностей в научных исследованиях. Равномерно помечены растительный материал получают путем непрерывной маркировки от всходов для сбора, в то время как дифференциальный маркировка достигается путем удаления растущих растений от камеры недель до сбора урожая. Представитель результаты от растущей Andropogon gerardii Кау продемонстрировать способность системы эффективно этикетки растительный материал в целевых уровней. С помощью этого метода мы подготовили растительного материала с 4,4 атом% 13 С и 6,7% атом 15 </ SUP> этикетка N равномерное завод, или материал, который дифференциально помечены до 1,29% атом 13 С и 0,56% атом 15 N в метаболических и структурных компонентов (остаточные компоненты горячей воды извлекаемые и горячей воды, соответственно). Проблемы лежат в поддержании оптимальной температуры, влажности, концентрации СО 2 и уровня освещенности в герметичном 13 С-СО 2 атмосферы для успешного производства завода. Это описание камера представляет собой полезный инструмент исследования эффективно производить равномерно или дифференциально нескольких изотопов помечены растительный материал для использования в экспериментах на экосистемы биогеохимического цикла.

Introduction

Понимание динамики растительного грунта и атмосферы процессов имеет решающее значение для точного прогнозирования, как глобальный углерод (С) и азота (N) циклов функция в нынешних и будущих условий окружающей среды. Стабильные изотопы являются мощными инструментами в количественном исследовании растений почвы и атмосферы С и N велосипеде. Трассировка редкие стабильные изотопы из растительного материала через экосистему предоставляет конфиденциальную информацию в исследованиях биогеохимического цикла, от CO 2 флюсы и образование органического вещества почвы в малой стабильной изотопной биомаркеров зондирования например 4,8,9. Объединяя 13 С маркировку с 15 N маркировки, или других стабильных изотопов, таких как 2 H или 18 O в растительной ткани обеспечивает высокую обнаружение, прослеживается, но сложный субстрат для использования в связанных исследованиях и биохимии растений почвы. Возможность равномерно или дифференциально маркировать структурную и метаболическую растительного материала объявлениеспуск дальше способность решать сложные вопросы о С и N велосипеде через экосистем. Выгода от использования изотопа помечены растительный материал в количественном исследовании C и N бухгалтерского учета, однако, зависит от способности производить 13 С и 15 N надписью материал, который либо равномерно или дифференциально помечены.

Изотоп наклеивания этикеток используются в исследованиях, посвященных завод С и N ассимиляции 10, распределения 11 и rhizodeposition 12. Равномерно 13 С и 15 N помечены растительный материал обеспечивает комплексную надписью субстрат для исследования помета разложения 1,4, формирование органического вещества почвы 2,6, почва выбросов СО 2 4, пищевая сеть исследований почвы 13, и исследования почвенного углерода времена пребывания 2,14. Исследования, использующие 13 С надписью биоугля от меченого растительного материала также начинают новую информацию о ранее забываютсимвольные почвы бассейна 15. В то время как 15 Н, 2 Н, и 18 O маркировки могут быть сравнительно легко добиться с помощью воды и удобрений лечения, проблема существует в производстве равномерно 13 С надписью растительного материала через 13 С-СО 2 фиксации.

Непрерывная изотоп маркировка от рассады до погашения в герметичной камере производит равномерное маркировки изотопа по всему растению. Другие методы, такие как повторное импульса маркировки 16 и листовой подкормки или влагу 17,18 не производят равномерно изотопный помечены растительный материал, ни четкого дифференциального маркировки конкретных C-соединений (например, метаболический против структурная) 19. Важным фактором при изотопного мечения маркировки эффективности из-за высокой стоимости редкого изотопа обогащенных соединений, используемых в маркировке. Хотя непрерывное 13 С наклеивания этикеток используются в прошлом 2-4,20, нет, насколько нам известноопубликовано подробное техническое описание непрерывной маркировки камере с признаками высокой эффективности маркировки и точного контроля количества и равномерности изотопного мечения.

На переднем крае помета разложения и почвы Исследование образование органического вещества является концепция, что метаболический растительный материал (т.е. выщелачиванию, лабильные, низкомолекулярные соединения) и структурный растительный материал (т.е.. Лигнин, целлюлоза, гемицеллюлоза) обрабатываются по-разному с точки зрения микробного эффективности использования, формирование органического вещества почвы, и долгосрочное почвы C Температура хранения 5-7. Растительный материал, который дифференциально помечены в его структурных и метаболических компонентов, поэтому, является полезным инструментом в продвижении мусора разложение и исследования формирования органического вещества почвы. Дифференциальный маркировка с двумя изотопов позволяет отслеживании структурных и метаболических компонентов по отдельности через экосистему с использованием нескольких бассейн изотопный techniquе 21.

Непрерывная изотоп маркировки с 13 С и других изотопов в герметичной камере требует особого внимания посадить физиологические условия для повышения производительности растений и изотопный эффективность маркировки. Дневные шипы температуры необходимо контролировать, чтобы предотвратить повреждение растений при выращивании в герметичном камеры. Оптимальный диапазон влажности и температуры обязаны поддерживать открытые устьица растений и CO 2 поглощение 22. Высокие уровни влажности вызывают запотевания стенок камеры, что минимизирует света доступность и может привести к повреждению структуры камеры. Особое внимание к изотопов эффективность маркировки, устраняя изобилие природных изотопов из камеры (например, исходя из герметичные с органического вещества почвы) и предотвращения воздействия наружного воздуха важно при работе с дорогими тяжелых изотопов меченых соединений.

Здесь мы представляем метод для строительства и эксплуатациинепрерывный двойной 13 С и 15 N изотоп маркировка камера для производства растительного материала, который либо равномерно с надписью или имеет свои структурные и метаболические компоненты, обозначенные на различных уровнях. 13С маркировка контролируется на уровне камеры, в то время оплодотворения и 15 Н маркировка контролируется на уровне отдельного банка. Представитель результаты показаны продемонстрировать способность данного метода для контроля температуры, влажности и концентрации СО 2 в течение всего вегетационного сезона. Результаты растущей Andropogon gerardii, Кау также продемонстрировать способность данного метода для получения равномерно или дифференциально надписью растительного материала. Специальная конструкция и рабочая камера схема, описанная могут быть изменены расти различных видов растений, а также для размещения 2 H или 18 О маркировке.

Protocol

1. Палата Строительство Построить маркировки камеру в теплице, чтобы обеспечить максимальную естественного света потенциалом для роста растений. Убедитесь, что достаточный запас мощности доступно для питания всех компонентов камеры. Построить маркировки камеру путем установки 3,175 мм толщиной прозрачные акриловые стены (поликарбонат будет также подходит) и 6,35 мм толщиной прозрачного акрилового потолка на алюминиевой раме с белой краской стальной пол, чтобы максимизировать солнечного отражения. Размеры камеры могут быть адаптированы под индивидуальные потребности исследований. Установите камеру на ¾ в (19 мм) фанеры на шлакоблоки. Просверлите отверстия в акрилового стекла, алюминиевой рамой и стальным полом и использования винтов для закрепления все компоненты вместе. Закройте все швы с силиконовой затыкают застраховать герметичное уплотнение. Построить дверь путем установки одной секции акрилового панелями на длинных винтов, который ввинчивается вниз, используя Ремоvable барашковые гайки. Закройте дверь с погода зачистки, чтобы предотвратить утечку воздуха. Выберите область непосредственно прилегающей к камере, как центр управления для установки все температуры, влажности, CO 2 управления и контрольное оборудование. Тщательно сверлить маленькие отверстия в стенке камеры, прилегающей к центру управления для всех электрических проводов и газа трубки. Используйте силиконовую замазку для герметизации отверстий вокруг всех проводов и труб, чтобы предотвратить утечку воздуха. Протестируйте камеру для утечки воздуха, наполнив его высоким уровнем СО 2 (например, 800 частей на миллион) и опуская ее на ночь. Если концентрация CO 2 в камере поддерживают на уровне первоначального уровня, то это герметичны. Если концентрация падает течение ночи, затем все швы должны быть рассмотрены и закрыты силиконовым затыкают до герметичное уплотнение не будет достигнуто. Для некоторых растений, приспособленных к высокой освещенности, добавить света, связанные с таймером для непосредственной внешности сHamber для увеличения проникновения света и продуктивность растений. 2. Температура и влажность управления Регулировать температуру в камере, установив коммерческую кондиционер типа сплит с охлаждающими (испарителя) катушек, расположенных внутри камеры и компрессора и теплообменника конденсатора, расположенных за пределами теплицы для рассеивания тепла. Установка кондиционера для поддержания желаемой температуры. Используйте маленькую комнатную осушитель воздуха, чтобы контролировать влажность в камере. Дрель дренажное отверстие через пол камеры, смежной с осушителем. Снимите коллектор конденсата из осушителя, и подключить дренажную трубку из осушителя через дренажное отверстие в полу камеры. Под камеры, поместите открытую банку, наполненную водой для осушителя для слива непосредственно в. Это создает герметичное уплотнение, но и позволяют уравновешивания давления. <lя> Установить контроллер, например, контроллера Омега ISeries, в центр управления с датчиком влажности внутри камеры. Подключение контроллера к системе осушения с твердотельного реле и установить регулятор влажности с высокой тревоги и качели для поддержания оптимальных условий выращивания в камере. Оптимальные температуры и влажности условия будут отличаться для различных видов растений. 3. CO 2 Органы управления 13 С-СО 2 обогащение достигается с помощью двух чистых CO 2 газовые баллоны, один из 10 атомных% 13 С-СО 2 или выше и один из 1,1% атом 13 С-СО 2 (природное содержание). Монитор концентрации СО 2 при наличии мембранный насос постоянно рисовать камеры воздух через инфракрасный газоанализатора (Ирга) и затем насосом воздух обратно в камеру, тем самым сохраняя закрытую систему (рис. 1). Seта сигнализация низкого и мертвая зона на Ирга программного обеспечения для поддержания концентрации CO 2 в пределах желаемого диапазона. Здесь мы используем низкую тревогу 360 частей на миллион с 40 частей на миллион нечувствительности для поддержания концентрации СО 2, между 360-400 частей на миллион. Подключите измерительный клапан для каждого танка и тщательно отрегулировать их для достижения уровня C по обогащению цель 13. Установите регуляторы танковые до 20 фунтов на квадратный дюйм. Вставьте электромагнитный клапан между дозирующим клапаном и регулятором каждого бака. Присоединяйтесь к выходным отверстиям двух измерительных клапанов вместе и трубы их в центре камеры. Провод полупроводниковое реле в Ирга выхода для управления электромагнитными клапанами (рис. 1). 4. Веб-система удаленного мониторинга Монитор концентрации СО 2 с помощью программного обеспечения Ирга, войдя его в локальный файл один раз в 30 сек. Создание пользовательской утилиты (например, в Perl или другой язык программирования), чтобы выбратьдо записи из местного СО 2 файле журнала, наряду с текущей временной метки ноутбука, и загружать их на веб-приложения на сервере. Установите веб-приложение для запроса температуру и данные датчика влажности. Используйте систему мониторинга, чтобы проверить состояние температуры в камере каждые пять минут, чтобы предотвратить потенциальные шипы температуры, которые бы уничтожить растения, если система кондиционирования воздуха не удалось. Контролируйте данные СО 2, температуры и влажности на любой стандартный веб-браузер, так что любые неожиданные всплески температуры или CO 2 капли можно немедленно проявили внимание. 5. Оросительной системы Просверлите одно маленькое отверстие в стенке акрилового стекла камеры на горшок. Используйте орошения трубы, чтобы создать одну капельного орошения кольцо на горшок и кормить орошения труб через стенки камеры наружу. Уплотнение отверстия вокруг орошения труб с силиконовой затыкают, чтобы предотвратить утечку воздуха. На внешней стороне камеры, подключить орошения трубки к трубке для перистальтического насоса. Используйте маленькую хомут, чтобы закрыть все орошения трубки, чтобы предотвратить утечку воздуха между поливами. 6. Герметичные Растения Выберите размер банка, подходящий для растений выращивается. Здесь, 40, используются 15 L горшки. Создать почвы без заливки смеси путем смешивания песок, вермикулит, и профиль пористой керамики. Испытание водой удерживающую способность заливки смеси путем взвешивания заполненный горшок сухой, впитывая пот с водой и позволяет ему полностью стечь, и весом горшок мокрой. Используйте эту максимальную емкость удерживать воду для того, чтобы избыток помечены удобрений и воды не течет из горшков во время полива. Прорастают семена в почвой до посадки их в горшках. Это гарантирует, что только успешно проросшие семена начали в маркировке камеры. Привить т он саженцев со свежим суспензии почвы ввести полезных микробов. Как только семена проросли, тщательно пересадить рассаду в горшки в нужное число. После того, как в горшке, двигаться горшки в камеру и собрать каждый горшок с индивидуальным орошения шланг. 7. Герметизации камеры Когда первый уплотнительный дверь в камеру большая масса наружного воздуха заполняет камеру пространство. Скраб этот внешний CO 2, подключив натрий-кальций скруббер для воздушного насоса, чтобы вычистить концентрацию CO 2 до по крайней мере, 200-250 частей на миллион до заполнения камеры обратно до 400 частей на миллион, используя резервуар смесь 13 С-СО 2. Старайтесь, чтобы камера закрыта через продолжительность вегетационного периода, чтобы минимизировать естественное изобилие CO 2 загрязнения. Монитор рост растений визуально и регулировать оплодотворение и орошения в зависимости от спроса. Заголовка "> 8. Оплодотворение и ирригации Используют раствор удобрений, таких как решения модифицированной Хоагленда 23, чтобы оплодотворить растения через ирригационную систему. Этикетка удобрения с 15 N с помощью 15 N-KNO 3 субрешением в адресной атома% 15 N уровня путем смешивания 98 атом% 15 N-KNO 3 с естественным содержанием 15 N-KNO 3 (0,37 атом% 15 N). Смешайте достаточное количество удобрений раствора при каждом событии оплодотворения в течение всего камере, на основе воды удерживающей способности заливки смеси. Поместите необходимое количество удобрений для одного горшка в стеклянной банке, а также подготовить как можно больше банок Есть горшки. Освободить ирригационные шланги и поместить каждый из них в банку с раствором удобрений, а затем подключить их к перистальтического насоса. Водные растения по перекачивания воды через перистальтического насоса через индивидуального капельного IRRIстранения шланги регулярно, как растения нужно. Оплодотворение раствором Хоагленда должны следовать спрос растений или опытно-конструкторских, с ростом спроса питательных при увеличении производительности завода, чтобы максимизировать производительность. Во-первых, насос решение в Хогланда через орошения шланг, затем насосом для воды полоскание через минимизировать водорослей и рост бактерий в трубах. Reclamp все шланги после оплодотворения и орошения для устранения утечки камеры воздуха. 9. Равномерное и дифференцированный Маркировка Для дифференциальной маркировки структурных и метаболических компонентов, удалить растения от маркировки камере 1-3 недели до сбора урожая. Растения, которые должны быть равномерно помечены не может оставаться в запечатанном маркировки камере непрерывно до урожая и орошаемых раствором 15 N-Хоагленда. Храните снятые растения в теплице в течение этого времени, так что они получают адекватную свети СО 2 на изобилие природных 13 С. Для дифференциальной 15 N маркировки, продолжают удобрять и поливать растения, как обычно, но и использовать природное содержание 15 N-KNO 3 в растворе удобрений в Хоагленда. 10. Урожай Остановить полива растений за 1 неделю до сбора урожая поэтому растения начинают стареть и заливки среднего высыхает. Откройте камеру и двигаться горшки для немедленного отсечения и урожай надземной биомассы Вылейте смесь заливки и корни по грубой экране. Используйте экран выделить корни от заливки смеси и встряхните корни безвозмездно заливки смеси. Поместите корни на 2 мм сито и промойте их водой, чтобы удалить оставшиеся заливочной массы. Используйте пинцет, чтобы удалить вермикулит, которые могут цепляться к корням. Разрешить корни до воздушно-сухого при подготовке будущих экспериментов. <p clasс = "jove_title"> 11. Помет химии Взвесьте воздушно-сухого растительного материала, чтобы определить, маркировка камеры биомассы. Измельчить подвыборку для химического анализа. Поместите 2,0 г осушенных в печи (60 ° C) помета в 125 мл колбу промывают кислотой и добавить 50 мл деионизированной воды. Поместите образец на нагретый (60 ° C) мешалкой пластины и поместите мешалкой в ​​колбе. Установка перемешивания в течение 200 оборотов в минуту и ​​позволить образец для нагрева в течение 30 мин. Через 30 мин фильтрации мусора раствора через 20 мкм нейлоновую сетку в системе вакуумной фильтрации. Перенести экстракт предварительно взвешенную кислоты промывают трубы и заморозить. Трансфер твердого мусора остатка на взвешенную алюминиевую кастрюлю и сухой при 60 ° С Взвесьте кастрюлю и мусор после сушки, чтобы определить массу горячей водой остатков. Замораживание сухой экстракт горячей воды и весят определить массу экстракта горячей воды. Анализ высушенную в печи (60 ° C) помет, сушат вымораживанием горячая водаЭкстракт, и печь-высушенный остаток горячей воды в элементном анализаторе – Изотоп побед Масс-спектрометр (EA-IRMS).

Representative Results

Наша маркировка камера 1.2 м 2.4 м 3.6 м по размеру и имеет 40,15 L горшки (рис. 1). Компьютеризированная IRGA система управления поддерживается концентрации СО 2, между нашими установленных значений 360 и 400 частей на миллион в течение фотосинтеза активной время суток (рис. 2, а). Низкий CO 2 сигнализации функция на Ирга срабатывает электромагнитные клапаны, чтобы CO 2 от 13 С обогащенный и природные резервуары изобилие в камеру, когда концентрация упала ниже минимального порога (например 360 частей на миллион). Функция мертвая зона остановили поток, когда концентрация достигла верхней уставки (например, 400 частей на миллион). Температура ISeries и система мониторинга влажности подключен к кондиционера и осушителя состоявшемся климатические условия в пределах установленных параметров в течение всего вегетационного сезона (рис. 2б). Мы использовали одну тонну (3,5 кВт) кондиционера в кеЕ.П. камеры прохладно. Система удаленного мониторинга позволило зарегистрированные данные для просмотра в любое время с помощью стандартного веб-браузера. Эти 2 концентрации, температуры и влажности значения CO были субдискретизируется на веб-приложения для отображения графики в течение последнего 24-240 ч, в 24 с шагом час. Это создало быстрый визуальный подтвердить, что суточные колебания были в пределах ожидаемых пределах. Просмотр веб-интерфейс также показали текущее состояние камеры, а также предусмотренные сигналы о потенциальных проблемах, таких как не получает последние данные. В любое время полный набор данных также может быть загружен с веб-интерфейс. Мы измерили фотосинтеза активной радиации (PAR) в непосредственной интерьера и экстерьера из камеры в четырех точках с и без огней на в середине лета и середине дня, используя квантовый датчик. PAR в камере составляла 31,5% ниже, чем снаружи, когда камера огни жпрежде чем прочь и на 22% ниже, чем снаружи, когда огни шли. Таким образом, камера свет помогает значительно увеличить проникновение PAR в камере на 9,5% (Р <0,05). Наша непрерывная система маркировки был способен производить 2759 г А. gerardii биомассы, 37% из которых было надземная биомасса и 63% из которых было подземная биомасса. Мы достигли 4,4 атом% 13 С весь лейбл завод в нашей единой растительного материала, установив электромагнитные клапаны на двух 2 танков СО соответственно (рис. 1, таблица 1). Мы достигли 6,7 атом% 15 N всю этикетку завода в нашей единой растительного материала путем смешивания 98% атомн 15 N-KNO 3 с 0,37 ат% 15 N-KNO 3 в KNO 3 субрешение раствора модифицированного Хоагленда 23 (табл. 1) . Мы напоил А. gerardii еженедельно 750 мл общего жидкости (вода плюс решение Хогланда) в течение всего вегетационного моресын. Мы удобряли 200-500 мл 15 N помечены решение Хогланда в неделю в зависимости от продуктивности растений. Мы использовали метод извлечения горячей воды, чтобы определить, были ли изотопные различия между равномерной и дифференциально надписью растительного материала. Для дифференциально меченных растений, на урожай мы убрали любые листья, которые были полностью мертвы и обрабатываются их отдельно, как они были, вероятно, не дифференциально помечены. При взгляде на содержание 13 C, все четыре регистрационные дней значительно отличались друг от друга по всей установки и экстракт горячей воды, но в течение дня горячая вода остатков 14 и 22 существенно не отличались друг от друга (таблица 1). При сравнении тканей растений фракции в пределах каждого дня, экстракт горячей воды и остаток значительно отличались друг от друга для всех четырех дней, и на 22 день все растение, экстракт, и остаток были СИГВВПficantly отличаются друг от друга (таблица 1). Для 15 N включения в растительных компонентов, существуют различия между дней учредительных и тканей растений фракций. Для экстракта горячей воды все четыре учредительных дней значительно отличались друг от друга в течение 15 N, и для всего растения и горячей воды остатка более короткие дни регистрации были значительно отличается от более длинных дней включения (табл. 1). Тканевые фракции растений в единых установок существенно не отличались друг от друга в 15 Н, но экстракт горячей воды и остаток значительно отличались друг от друга в 15 Н для дифференциально меченого помета. Все изотопные значения представлены с использованием атом процента (%) атом обозначение (уравнение 1), которая является более точным, чем обозначение% использовать при высоких уровнях тяжелыйизотопного обогащения 21. Например: (1) Для этого исследования, мы побежали статистический анализ с использованием SAS версии 9.2. Мы протестировали различия между камерных внутренних и наружных уровнях освещенности с использованием парного критерия Стьюдента. Мы протестировали различия между 13 С и 15 N маркировке экстрактов горячей воды и горячей воды остатками, используя односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) в PROC ANOVA. Мы использовали тест множественного диапазона Дункана для анализа множественных сравнений. Значение было принято на Р-уровня 0,05. Мы использовали тест Вилкоксона суммы рангов для проверки, что данные встретился условиям анализа. Рисунок 1. SchematМикросхема схема 40 горшок мощностей непрерывной многоступенчатой ​​изотопов маркировки камеры от высоты птичьего полета. Пунктирные линии представляют электропроводки, а сплошные линии представляют газ или трубы воды. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение. . Рисунок 2) Средний концентрация СО 2 (частей на миллион) (+ / -. SE) в течение двадцати четырех часов в течение всего вегетационного периода Б) Средняя температура (º C), белые кружки, а влажность воздуха (%), закрытый круги . (+ / – SE) в течение двадцати четырех часов в течение всего вегетационного периода Нажмите здесь, чтобы увеличить внутримышечновозраст. Равномерное (0) Дифференциал (7) Дифференциал (14) Дифференциал (22) Всего Помет 13 С Atom% 4.46 ± 0.02 Aab 3.93 ± 0.05 Ba 3.64 ± 0.03 Ca 3.35 ± 0.06 дБ 15 N Atom% 6.69 ± 0.07 Аа 6.72 ± 0.01 Аа 6.33 ± 0.06 Ba 6.41 ± 0.07 Ba <td height="38" rowsпан = стиль "2" = "высота: 38px; ширина: 77px;"> горячая вода экстракт 13 С Atom% 4.59 ± 0.04 Аа 3.35 ± 0.06 Bb 2.79 ± 0.06 Cb 2.37 ± 0.03 Dc 15 N Atom% 6.69 ± 0.03 Аа 6.43 ± 0.01 Bb 5.89 ± 0.07 дБ 6.16 ± 0.05 Cb Горячая вода Остаток 13 С Atom% 4.37 ± 0.06 Ab 4,1 ± 0,03 Ба 3.79 ± 0.10 Ca 3.66 ± 0.05 Ca 15 N Atom% 6.57 ± 0.04 Ba 6.71 ± 0.02 Аа 6.45 ± 0.02 Ca 6.44 ± 0.03 Ca Таблица 1. <strong> Изотопный состав и подстилка химия для равномерной и дифференциально надписью помета. Дни дифференциального маркировки вне камеры в скобках. Сравнения между дней включения выделяются заглавными буквами (по строкам) и между подстилки фракций строчными буквами (вниз столбцов) для каждой переменной.

Discussion

Эта конструкция для непрерывного изотопного мечения камере использовали для получения равномерно и дифференциально 13 C и 15 N помечены A. gerardii для последующего поля и лабораторных экспериментов. В течение трех сезонов роста работы, камера успешно поддерживается температура, влажность и концентрации СО 2, в пределах установленных параметров (рис. 2). Надежность системы контроля температуры имеет решающее значение во время пика летом, когда высокая солнечная радиация может привести к перегреву в герметичной камере. Устранение избыточной влажности, вызванной транспирации от выращивания растений гарантирует, что завод устьица остаются открытыми для фотосинтеза поглощения 22 и что конденсат не ингибирует проникновение света или повредить структуру камеры.

Почти непрерывный мониторинг концентрации СО 2 по Ирга программного обеспечения поддерживается непрерывная13 С маркировка растений в то время как они росли в камере. В связи с высокой фотосинтетической деятельности А. gerardii растет в этой камере, CO 2 вводили в системе часто в дневное время пика вегетации, когда фотосинтетической активности обратил концентрации СО 2 до 360 частей на миллион, примерно каждые 15-20 мин. Дозирование и обогащенный природное содержание 13 C-CO 2 танка, разрешенные для контролируемой 4,4% атом атмосфере 13 C через вегетации для равномерного маркировки тканей растений. 13 С-CO 2 производства также может быть достигнуто путем смешивания 13 С-натрий бикарбонат или 13 карбонат С-натрия и соляную кислоту, однако этот тип системы является более сложным и требует больше контроля и обслуживания, поэтому мы рекомендуем использовать 13 С-CO 2 газ. Важным фактором для мониторинга CO 2 Concentrations использующие Ирга является то, что инфракрасные анализаторы потерять две трети их чувствительности при измерении 13 С-СО 2. Это недооценка около 2,9% промилле для нашего 4.4% 13 С-СО 2 смеси не был большой интерес для нас, но может стать более серьезной проблемой при маркировке на более высоких уровнях 13 C 27.

А. gerardii теплый сезон многолетние Tallgrass прерии злак видов. Конструкция этой камеры был оптимизирован для А. gerardii производства (рис. 1). Размер и высота камеры были выбраны с учетом для максимальной производительности высоты A. gerardii в этой области, а также для требуемого производства биомассы растений для будущих экспериментов. А. gerardii, как известно, свет ограничены в области 24,25. PAR в теплице может быть уменьшена на 30-47% по сравнению с внешними уровней 26. Так как наш заводс выращивали в акриловой стеклянной камеры внутри теплицы, PAR ограничение было беспокойство. Когда включена, флуоресцентные лампы увеличился PAR в камере на 9,5%, что, возможно, помогли повысить производительность в этом свете чувствительных видов. При использовании этого камерный дизайн выращивать другие виды растений конкретных физиологических потребностей, таких как размер, освещение, требований питательных, температурной чувствительности, и влажности почвы должны быть тщательно адаптированы для поддержания оптимальных условия для роста растений.

При работе с дорогих меченных изотопами соединений, таких как 10% атом 13 С-СО 2 и 98 атом% 15 N-КНО-3, эффективности маркировки является важным фактором. Эта конструкция камеры оптимизирует 13 С маркировки, сделав все усилия, чтобы запечатать в камеру и минимизации утечки воздуха в и из камеры. Если эта камера никогда не открыл в течение вегетационного периода, то ни одна из этикетке 13 CCO 2-е изд из камеры просочилась в атмосферу. CO 2 наращивать в ночное время дыхания, кажется, не повредить растущие растения и быстро рассмотрен после восхода солнца (рис. 2). Во время дифференциальной маркировки, камера была кратко открыл для удаления дифференциально помечены горшки, но это, казалось, не разбавить целевой 4.4 атом% 13 C маркировки непрерывно меченых растений (табл. 1). 13С маркировки была также оптимизирована, вычищая из начальная атмосферного воздуха в ловушке в камере на уплотнения. В ходе предварительных испытаний на камере без первоначального скраб атмосферного CO 2, растения были измерены иметь разбавленный уровень 13 C в первых листьев, производимых, чем в более поздних листьев производится. Первоначальный скраб из атмосферного СО 2 после закрытия камеры появляется устранить эту проблему, что обеспечивает бесперебойное 13 C маркировки отрассады до погашения. Поддержание почвы без заливки смесь песка, вермикулита и глины также устраняет естественный изобилие CO 2 загрязнения от дыхания почвы. Устранение почвы из системы требует тщательного оплодотворения и прививки соображения, который может быть уникальным для различных видов растений. 15 N маркировка через целевого 7 атом% 15 раствора н Hoegland произвели очень меченого растительного материала в 6,7 атомных% 15 N (табл. 1). Небольшое разбавление от целевой 15 N этикетке может быть вызвано каким-то естественным содержанием N в субстрате или от родного прививки почвы.

В биосинтезе соединений, природных дискриминации 13 С (или 15 N) происходит в результате кинетической фракционирования и нестатистической распределения изотопов в синтезированных соединений. Таким образом, в случае С, вторичные продукты (например, липиды, фенольные соединения), как правило, обедненный 13 С по сравнению с первичной продукции (углеводы). Этот естественный дискриминации 13 С по-видимому, сохранится и тогда, когда растения выращиваются в обогащенной 13 C атмосфере, как это можно видеть в небольшой разницей по атомной% 13 С горячей воды экстрактов и горячей воды вычетов равномерно меченных растений (Таблица 1 ). Этот естественный кинетическая фракционирования очень мала по сравнению с обогащением и не ставит под угрозу единства маркировки.

Дифференциальный маркировка структурных и метаболических тканях растений является новая техника с потенциалом для продвинутых исследований в помете разложения, микробной экологии и образования органических веществ в почве. Разница в 13 С и 15 N горячей воды экстрактов и горячей воды остатков указывает на значительное разбавление 13 С и 15 N в вымываемой, низкийсоединения молекулярной массой (горячая вода выдержки) от структурного растительного материала (горячая вода остатков) после 7, 14 и 22 дней дифференциального маркировки (P <0,005). Этот дифференциал маркировка растительных тканей может быть использована для отслеживания судьбы структурных и метаболических компонентов по отдельности через экосистему. 13 С дифференциальная маркировка была более экстремальные, чем 15 N дифференциальной маркировки. Это может быть связано с непосредственности 13 C разбавления при удалении растений из 13 С-СО 2 с надписью атмосфере, в то время как 15 N этикетка еще остается в заливки смеси в течение некоторого времени и 15 Н разбавление происходит более медленно. Для получения дополнительной резкого перепада маркировки 15 Н, можно считать, промывка горшки с водой перед изобилие природных оплодотворения в течение последних недель роста за пределами камеры.

Конструкция и эксплуатация этого непрерывного 13 </ SUP> С и 15 N маркировки система для равномерной или дифференциала, метаболических и структурных, растительной ткани маркировки обеспечивает новый способ получения меченного изотопом растительный материал для передовых исследований. Дизайн и оперативные детали этой камеры были выбраны для 4,4 атом% 13 С и 7% атом 15 Н маркировки А. gerardii, но могут быть адаптированы к другим типам растений и уровней маркировки изотопов. Растущие условия, описанные здесь, должны быть адаптированы в соответствии с форматом, температура, влажность, свет, вода и питательные потребности конкретных видов растений, представляющих интерес. Маркировка с 18 O или 2 H также может быть достигнуто путем маркировки воды, используемой в системе орошения. Система, описанная здесь решает многие из проблем форме и дифференциал 13 С маркировки растительного материала. Эта базовая конструкция камеры могут быть использованы другими исследовательскими группами, чтобы произвести очень надписью растительный материал для рекламныхрованное обучение в экосистемы биогеохимии.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Отдельное спасибо завод содействия экономическому росту и EcoCore аналитического объекта Университета штата Колорадо и на многие студентов и преподавателей, которые помогли в этом проекте. Эта работа финансируется грантом NSF DEB # 0918482, Министерство сельского хозяйства США национальных потребностей стипендию, и фонда Cotrufo-Hoppess для экологии почвы исследований.

Materials

40 in Remote Tower Fan Living Accents FS10-S3R-A
42 in Electric Tower Fan with remote control LASKO 2559
Mr. Slim Split-type air conditioner Mitsubishi Electric R410A
Electronic 24 hr time switches Intermatic ET100C Operates Fluorescent Light System
iSeries Humidity and Temp Controller Omega CHiTH-i8DV33-5-El
Solid State Relay Omega SSRL240
CKR Series Solid State Relay Crydon
Solenoid Coils Dayton 6X543
GasHound CO2 Analyzer LI-COR LI-800
Dehumidifier Dayton 1DGX4
Specialty gas regulator Airgas CGA 580
T5 Hight Output Commercial Fluorescent Light System Hydro Farm FLT48
Air pump Thermo Scientific 420-1901
Masterflex Cartridge Pump HeadSystem Cole Parmer 7553-70
1900 Series Network Switch Catalyst
Profile Porus Ceramic Top Dressing Greens Grade
Industrial Quartz 40 mesh Unimin 4095
Mycorrhizae Professional Growing Medium ProMix
Vermiculite and Perlite Thermo-Ran C633
Potassium Nitrate- 15N 98 atom % Sigma-Aldrich 335134
Carbon-13C Dioxide 10 atom % Sigma-Aldrich 600180
Medical grade CO2 Airgas
Regulator Airgas  CGA 350
4 in box fans Grainger
Masterflex PharMed BPT Tubing Cole Parmer HV-06508-24
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bird, J. A., Torn, M. S. Fine roots vs. Needles: A comparison of (13)C and (15)N dynamics in a ponderosa pine forest soil. Biogeochemistry. 79, 361-382 (2006).
  2. Bird, J. A., van Kessel, C., Horwath, W. R. Stabilization of C-13-carbon and immobilization of N-15-nitrogen from rice straw in humic fractions. Soil Sci. Soc. Am. J. 67, 806-816 (2003).
  3. Denef, K., Six, J. Contributions of incorporated residue and living roots to aggregate-associated and microbial carbon in two soils with different clay mineralogy. Eur. J. Soil Sci. 57, 774-786 (2006).
  4. Rubino, M. Carbon input belowground is the major C flux contributing to leaf litter mass loss: Evidences from a C-13 labelled-leaf litter experiment. Soil Biol. Biochem. 42, 1009-1016 (2010).
  5. Cotrufo, M. F., Wallenstein, M. D., Boot, C. M., Denef, K., Paul, E. The Microbial Efficiency-Matrix Stabilization (MEMS) framework integrates plant litter decomposition with soil organic matter stabilization: do labile plant inputs form stable soil organic matter. Glob. Change Biol. 19, 988-995 (2013).
  6. Mambelli, S., Bird, J. A., Gleixner, G., Dawson, T. E., Torn, M. S. Relative contribution of foliar and fine root pine litter to the molecular composition of soil organic matter after in situ degradation. Org. Geochem. 42, 1099-1108 (2011).
  7. Prescott, C. E. Litter decomposition: what controls it and how can we alter it to sequester more carbon in forest soils. Biogeochemistry. 101, 133-149 (2010).
  8. Denef, K., Roobroeck, D., Wadu, M., Lootens, P., Boeckx, P. Microbial community composition and rhizodeposit-carbon assimilation in differently managed temperate grassland soils. Soil Biol. Biochem. 41, 144-153 (2009).
  9. Bird, J. A., Kleber, M., Torn, M. S. C-13 and N-15 stabilization dynamics in soil organic matter fractions during needle and fine root decomposition. Org. Geochem. 39, 465-477 (2008).
  10. Andresen, L. C., Jonasson, S., Strom, L., Michelsen, A. Uptake of pulse injected nitrogen by soil microbes and mycorrhizal and non-mycorrhizal plants in a species-diverse subarctic heath ecosystem. Plant Soil. 313, 283-295 (2008).
  11. Horwath, W. R., Pregitzer, K. S., Paul, E. A. C-14 Allocation in tree soil systems. Tree Physiol. 14, 1163-1176 (1994).
  12. Denef, K. Community shifts and carbon translocation within metabolically-active rhizosphere microorganisms in grasslands under elevated CO2. Biogeosciences. 4, 769-779 (2007).
  13. Pollierer, M. M., Langel, R., Korner, C., Maraun, M., Scheu, S. The underestimated importance of belowground carbon input for forest soil animal food webs. Ecol. Lett. 10, 729-736 (2007).
  14. Stewart, D. P. C., Metherell, A. K. Carbon (C-13) uptake and allocation in pasture plants following field pulse-labelling. Plant Soil. 210, 61-73 (1999).
  15. Santos, F., Torn, M. S., Bird, J. A. Biological degradation of pyrogenic organic matter in temperate forest soils. Soil Biol. Biochem. 51, 115-124 (2012).
  16. Bromand, S., Whalen, J. K., Janzen, H. H., Schjoerring, J. K., Ellert, B. H. A pulse-labelling method to generate 13C- enriched plant materials. Plant Soil. 235, 253-257 (2001).
  17. Putz, B. A simple method for in situ-labelling with 15N and 13C of grassland plant species by foliar brushing. Methods Ecol. Evol. 2, 326-332 (2011).
  18. Wichern, F., Mayer, J., Joergensen, R., Müller, T. Evaluation of the wick method for in situ &lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C and &lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N labelling of annual plants using sugar-urea mixtures. Plant Soil. 329, 105-115 (2010).
  19. Fahey, T. J. Transport of Carbon and Nitrogen Between Litter and Soil Organic Matter in a Northern Hardwood Forest. Ecosystems. 14, 326-340 (2011).
  20. Stewart, C. E., Paustian, K., Conant, R. T., Plante, A. F., Six, J. Soil carbon saturation: Evaluation and corroboration by long-term incubations. Soil Biol. Biochem. 40, 1741-1750 (2008).
  21. Fry, B. . Stable Isotope Ecology. , (2006).
  22. Nippert, J. B., Fay, P. A., Carlisle, J. D., Knapp, A. K., Smith, M. D. Ecophysiological responses of two dominant grasses to altered temperature and precipitation regimes. Acta Oecol. Int. J. Ecol. 35, 400-408 (2009).
  23. Hoagland, D. R. a. A., I, D. . The Water-Culture Method for Growing Plants without Soil. , (1950).
  24. Lett, M. S., Knapp, A. K. Consequences of shrub expansion in mesic grassland: Resource alterations and graminoid responses. J. Veg. Sci. 14, 487-496 (2003).
  25. Knapp, A. K., Seastedt, T. R. Detritus Aaccumulation limits productivity of tallgrass prairie. Bioscience. 36, 662-668 (1986).
  26. Ting, K. C., Giacomelli, G. A. Solar photosynthetically active radiation transmission through greenhouse glazings. Energy Agric. 6, 121-132 (1987).
  27. McDermitt, D. K., Welles, J. M., Eckles, R. D. Effects of Temperature, Pressure and Water Vapor on Gas Phase Infrared Absorption by CO2. , .

Tags

13C15NIsotope LabelingContinuous LabelingUniform LabelingDifferential LabelingPlant MaterialEcosystem ProcessesBiogeochemical TransformationsLitter DecompositionSoil Organic MatterStructural ComponentsMetabolic Components

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Soong, J. L., Reuss, D., Pinney, C., Boyack, T., Haddix, M. L., Stewart, C. E., Cotrufo, M. F. Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling. J. Vis. Exp. (83), e51117, doi:10.3791/51117 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image