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Environment

Progettazione e funzionamento di un continuo<sup> 13</sup> C e<sup> 15</sup> N Etichettatura Camera di Uniform o differenziale, metaboliche e strutturali, Flora Isotope Labeling

Published: January 16, 2014
doi:
10.3791/51117
, , , , , ,
1Natural Resource Ecology Laboratory,Colorado State University, 2Soil Plant Nutrient REsearch,USDA-ARS, 3Department of Soil and Crop Sciences,Colorado State University

Summary

Questo metodo spiega come costruire e gestire un continuo 13 C e 15 N isotopo camera di etichettatura uniforme o l'etichettatura tessuti vegetali differenziale. I risultati rappresentativi da metabolico e l'etichettatura strutturale gerardii Andropogon sono discussi.

Abstract

Tracciare isotopi stabili rare da materiale vegetale attraverso l'ecosistema fornisce le informazioni più sensibili sui processi ecosistemici, da flussi di CO 2 e del suolo formazione di materia organica alla piccola stalla-isotopo biomarker sondaggio. Accoppiamento più isotopi stabili come 13 C con 15 N, 18 O o 2 H ha il potenziale per rivelare ancora più informazioni su complesse relazioni stechiometrico durante le trasformazioni biogeochimici. Isotopo marcato materiale vegetale è stato utilizzato in vari studi di decomposizione lettiera e formazione del suolo materia organica 1-4. Da questi e altri studi, tuttavia, è diventato evidente che i componenti strutturali del materiale vegetale saranno diversi componenti metabolici (cioè composti con peso molecolare basso. Percolati) in termini di utilizzo microbica e stoccaggio del carbonio a lungo termine 5-7. La capacità di studiare componenti strutturali e metabolicifornisce separatamente un nuovo potente strumento per l'avanzamento della linea di studi biogeochimici degli ecosistemi. Qui si descrive un metodo per produrre 13 C e 15 N materiale vegetale marcato che è o etichettato uniformemente in tutta la pianta o differenzialmente etichettato componenti dell'impianto strutturali e metabolici.

Qui, vi presentiamo la costruzione e l'esercizio di una continua 13 C e 15 N camera di etichettatura che può essere modificato per soddisfare le varie esigenze di ricerca. Materiale vegetale uniformemente marcato è prodotta mediante l'etichettatura continuo dal germoglio alla raccolta, mentre l'etichettatura differenziale si ottiene eliminando le piante che crescono dalle settimane camera prima del raccolto. I risultati rappresentativi di crescere Andropogon gerardii Kaw dimostrano la capacità del sistema in modo efficiente etichetta materiale vegetale ai livelli mirati. Attraverso questo metodo abbiamo prodotto materiale vegetale con un 4,4% atomo di 13 C e 6,7 atomo% 15 </ Sup> etichetta pianta N uniforme, o materiale che è differenzialmente etichettato fino al 1,29% atomo di 13 C e 0,56% atomo di 15 N nel suo metabolica e componenti strutturali (acqua calda acqua estraibile e calda componenti residui, rispettivamente). Le sfide si trovano nel mantenimento della giusta temperatura, umidità, concentrazione di CO 2, e livelli di luce in un ermetico 13 C-CO 2 nell'atmosfera per la produzione vegetale di successo. Questa descrizione della camera rappresenta uno strumento di ricerca utile per produrre efficacemente uniforme o differenziale multi-isotopo marcato materiale vegetale da utilizzare negli esperimenti sull'ecosistema cicli biogeochimici.

Introduction

Capire le dinamiche dei processi pianta-suolo-atmosfera è fondamentale per prevedere con precisione come il globale del carbonio (C) e azoto (N) funzione di cicli in condizioni ambientali attuali e future. Isotopi stabili sono strumenti potenti in studi quantitativi di pianta-suolo-atmosfera C e N ciclismo. Tracciare isotopi stabili rare da materiale vegetale attraverso l'ecosistema fornisce informazioni sensibili in studi di cicli biogeochimici, da CO 2 flussi e organica del suolo formazione questione su piccola scala stabili-isotopo biomarker sondaggio esempio 4,8,9. Combinando 13 C etichettatura con 15 N all'etichettatura o ad altri isotopi stabili come 2 H o 18 O nei tessuti vegetali fornisce un alto rilevazione, tracciabile, substrato ancora complesso per l'utilizzo in studi accoppiate di piante e biochimica del suolo. La possibilità di etichettare in modo uniforme o differenziato strutturale e metabolica ad materiale vegetaleds ulteriormente la capacità di affrontare questioni complesse su C e N in bicicletta attraverso gli ecosistemi. Il vantaggio di utilizzare isotopo marcato materiale vegetale in studi quantitativi di C e N contabile, tuttavia, dipende dalla capacità di produrre 13 C e 15 N materiale marcato che è o uniformemente o differenzialmente etichettati.

L'etichettatura isotopo è stato utilizzato in studi che riguardano impianti C e N assimilazione 10, 11 e allocazione rizodeposizioni 12. Uniformemente 13 C e 15 N materiale vegetale marcato fornisce un complesso substrato marcato per gli studi di decomposizione della lettiera 1,4, terreno di formazione di materia organica del suolo, 2,6 emissioni di CO 2 4, del suolo alimenti web studia 13, e studi di suolo C tempi di permanenza 2,14. Gli studi che utilizzano 13 biochar C marcato da materiale vegetale etichettati stanno cominciando a rivelare nuove informazioni sul passato trascuratopiscine char suolo 15. Mentre 15 N, H 2, e 18 O etichettatura sono relativamente facili da realizzare con il trattamento acqua e fertilizzante, la sfida esiste nella produzione di materiale vegetale uniformemente 13 C marcato con 13 C-fissazione di CO 2.

Etichettatura isotopo continua da piantina alla scadenza in una camera stagna produce etichettatura isotopo uniforme in tutta la pianta. Altri metodi quali l'etichettatura ripetuti impulsi 16 e applicazione fogliare o assorbimento 17,18 non producono isotopi etichettato materiale vegetale in modo uniforme, né un'etichettatura chiara differenziale delle specifiche C-composti (ad es metabolica vs strutturale) 19. Una considerazione importante in etichettatura isotopo viene etichettatura dell'efficienza, a causa del costo elevato di rara isotopi composti arricchiti utilizzati in etichettatura. Sebbene etichettatura continua 13 C è stato utilizzato in passato 2-4,20, non vi è a nostra conoscenzauna descrizione tecnica dettagliata pubblicata di una camera di etichettatura continuo con evidenza di alta efficienza etichettatura e controllo accurato della quantità e uniformità di marcatura isotopica.

Sulla prima linea di decomposizione lettiera e del suolo la ricerca la formazione di materia organica è il concetto che il materiale vegetale metabolica (cioè lisciviabile, labili, composti a basso peso molecolare) e materiale vegetale strutturale (vale a dire. Lignina, cellulosa, emicellulosa) sono trattati in modo diverso in termini di microbica utilizzare l'efficienza, la formazione di materia organica del suolo, e lungo termine del suolo C archiviazione 5-7. Materiale vegetale che viene etichettato differenziale nelle sue componenti strutturali e metabolici, quindi, è uno strumento utile nel promuovere la decomposizione lettiera e nel suolo di ricerca formazione di materia organica. Etichettatura differenziale con due isotopi consente il tracciamento dei componenti strutturali e metabolici separatamente attraverso l'ecosistema utilizzando un multiplo-pool isotopo technique 21.

Etichettatura continua isotopo con 13 C e altri isotopi in una camera stagna richiede particolare attenzione per piantare condizioni fisiologiche per massimizzare la produttività dell'impianto e isotopi efficienza di etichettatura. Picchi di temperatura diurna devono essere controllati per evitare danni pianta quando cresce in una camera stagna. Una gamma ottimale di umidità e temperatura sono tenuti a mantenere aperto stomi delle piante e assorbimento di CO 2 22. Alti livelli di umidità causa l'appannamento delle pareti della camera, che riduce al minimo la disponibilità di luce e può danneggiare la struttura della camera. Attenta considerazione di isotopo efficienza etichettatura eliminando isotopi abbondanza naturale dalla camera (ad esempio proveniente da invasatura con materia organica del suolo) e prevenire l'esposizione all'aria esterna è importante quando si lavora con costosi heavy-isotopi composti marcati.

Qui, presentiamo un metodo per la costruzione e gestione di uncontinua dual 13 C e 15 N isotopo camera di etichettatura per la produzione di materiale vegetale che sia uniformemente etichettati o ha i suoi componenti strutturali e metabolici etichettati a livelli distinti. 13 C etichettatura sono controllate a livello di sezione, mentre fecondazione e 15 N etichettatura è controllate a livello di singolo piatto. I risultati rappresentativi sono riportati per dimostrare la capacità di questo metodo per il controllo della temperatura, umidità e concentrazione di CO 2 per tutta la stagione di crescita. I risultati di crescita Andropogon gerardii, Kaw anche dimostrano la capacità di questo metodo per produrre materiale vegetale in modo uniforme o differenziato etichettati. Il regime specifico disegno della camera e del funzionamento descritta può essere modificata a crescere diverse specie vegetali, nonché per ospitare 2 o H 18 O etichettatura.

Protocol

1. Sezione Costruzioni Costruire la camera di etichettatura in una serra per consentire la massima potenzialità della luce naturale per la crescita delle piante. Assicurarsi che un'adeguata alimentazione è disponibile per alimentare tutti i componenti della camera. Costruire la camera di etichettatura montando 3,175 millimetri muri acrilico trasparente di spessore (policarbonato sarebbe anche adatto) e un 6,35 millimetri di spessore del soffitto in acrilico trasparente su un telaio in alluminio con un pavimento in acciaio verniciato bianco per massimizzare la riflettanza solare. Le dimensioni della camera possono essere personalizzati per soddisfare le esigenze di ricerca individuali. Montare la camera in ¾ in (19 mm) di compensato su blocchi di cenere. Fori nel vetro acrilico, telaio in alluminio e piano in acciaio e utilizzare viti per il fissaggio di tutti i componenti insieme. Sigillare tutte le cuciture con mastice siliconico per garantire una chiusura ermetica. Costruire una porta da una sezione del rivestimento acrilico su viti lunghe, che può essere avvitato utilizzando remo montaggiogalletti vable. Sigillare la porta con guarnizione di battuta per evitare perdite d'aria. Selezionare una zona direttamente adiacente alla camera da centro di controllo per montare tutto temperatura, umidità, CO 2 controlli e monitoraggio. Eseguire con cautela piccoli fori nella parete della camera adiacente al centro di controllo per tutti i cavi elettrici e tubazioni gas. Usare mastice siliconico per sigillare i buchi intorno tutti i cavi e tubi per evitare perdite d'aria. Provare la camera di perdita d'aria riempiendo con un elevato livello di CO 2 (es. 800 ppm) e lasciare riposare una notte. Se la concentrazione di CO 2 nella camera è mantenuta al suo livello originale, allora è ermetico. Se la concentrazione scende la notte, tutte le cuciture devono essere esaminati e richiuse con mastice siliconico fino ad ottenere una chiusura ermetica. Per alcune piante adattate alle condizioni di luce alti, aggiungere luci collegate a un timer all'esterno immediato del cHamber per aumentare la penetrazione della luce e la produttività dell'impianto. 2. Controlli di temperatura e umidità Regolare la temperatura della camera con l'installazione di uno spot tipo split condizionatore d'aria con il raffreddamento (evaporatore) bobine situate all'interno della camera e le bobine compressore e condensatore situati al di fuori della serra per dissipare il calore. Impostare il condizionatore d'aria per mantenere la temperatura desiderata. Utilizzare una piccola stanza deumidificatore per controllare l'umidità nella camera. Praticare un foro di drenaggio attraverso il pavimento della camera adiacente al deumidificatore. Rimuovere il collettore condensa dal deumidificatore, e collegare un tubo di drenaggio dal deumidificatore attraverso il foro di scarico sul fondo della camera. Sotto la camera, mettere un vaso aperto riempito con acqua per il deumidificatore per drenare direttamente in. Questo crea una chiusura ermetica ma anche consentire equilibrazione pressione. <li> installare il controllore, come il controller Omega iSeries, nel centro di controllo di un sensore di umidità all'interno della camera. Connettere il controller al sistema di deumidificazione con un relè a stato solido e impostare il regolatore di umidità con un allarme alto e swing per mantenere condizioni ottimali di crescita nella camera. Temperatura e umidità ottimali differiscono per diverse specie vegetali. 3. CO 2 Controlli Il 13 C-CO 2 arricchimento si ottiene utilizzando due due serbatoi di gas puri CO, uno del 10% atomo di 13 C-CO 2 o superiore e una del 1,1% atomo di 13 C-CO 2 (abbondanza naturale). Controllo concentrazione di CO 2 da avere una pompa a membrana disegnare continuamente aria camera attraverso un Infrared Gas Analyzer (IRGA) e poi la pompa dell'aria all'interno della camera, mantenendo così un sistema chiuso (Figura 1). Seta allarme basso e banda morta sul software IRGA per mantenere concentrazioni di CO 2 entro un intervallo desiderato. Qui, usiamo un allarme basso di 360 ppm con una banda morta 40 ppm a mantenere concentrazioni di CO 2 tra 360-400 ppm. Collegare una valvola di dosaggio ad ogni carro e con attenzione regolarle per raggiungere il livello C arricchimento bersaglio 13. Impostare i regolatori del serbatoio a 20 psi. Inserire una elettrovalvola tra la valvola dosatrice e il regolatore di ciascun serbatoio. Unire le uscite delle due valvole di dosaggio e li tubo nel centro della camera. Filo un relè a stato solido all'uscita IRGA per controllare le elettrovalvole (Figura 1). 4. Sistema di monitoraggio remoto basato sul Web Controllo concentrazioni di CO 2 dal software IRGA accedendo a un file locale, una volta ogni 30 sec. Creare un programma personalizzato (ad esempio in perl o in un altro linguaggio di programmazione) per sceglierevoci su dal CO 2 file di log locale, insieme con il timestamp portatile attuale, e caricarli su un applicazione web di back-end. Impostare l'applicazione web per interrogare la temperatura e dati del sensore di umidità. Utilizzare un sistema di monitoraggio per controllare lo stato della temperatura nella camera ogni cinque minuti per evitare eventuali picchi di temperatura che distruggerebbero le piante, il sistema di condizionamento fallito. Monitorare i dati di CO 2, temperatura e umidità su qualsiasi browser web standard in modo che eventuali picchi di temperatura imprevisti o di CO 2 gocce possono essere immediatamente rettificata. 5. Impianto di irrigazione Praticare un piccolo foro nel muro della camera di vetro acrilico per vaso. Utilizzare tubo di irrigazione per creare un anello di irrigazione a goccia per piatto e far passare il tubo di irrigazione attraverso la parete della camera verso l'esterno. Sigillare i fori attorno al tubo di irrigazione con mastice siliconicoper evitare perdite di aria. All'esterno della camera, collegare il tubo di irrigazione al tubo di una pompa peristaltica. Utilizzare una piccola fascetta per chiudere tutti i tubi di irrigazione per evitare perdite di aria tra un'annaffiatura. 6. Invasatura piante Selezionare un formato piatto adatto per le piante coltivate. Qui, 40, sono utilizzati 15 L pentole. Creare un mix di invasatura privo di suolo mescolando sabbia, vermiculite, e il profilo ceramica porosa. Testare la capacità del mix di invasatura pesando un vaso pieno asciutto, immergendo la pentola con acqua e permettendogli di scaricare completamente, e pesare il piatto bagnato di trattenere l'acqua. Utilizzare questa capacità di ritenzione idrica massima per garantire che l'eccesso di fertilizzanti etichettati e l'acqua non fuoriesca dalle pentole durante l'irrigazione. Germinare i semi in terriccio prima di loro piantare nei vasi. Questo assicura che i semi germinati solo successo vengono avviati nella camera di etichettatura. Seminare t egli piantine con liquame terreno fresco per introdurre microbi benefici. Una volta che i semi sono germinati, trapiantare piantine attenzione ai vasi nel numero desiderato. Una volta in vaso, spostare le pentole nella camera e assemblare ogni pentola con un tubo di irrigazione individuale. 7. Tenuta la Camera Quando prima tenuta la porta della camera di una grande massa di aria esterna riempie lo spazio della camera. Scrub questo tipo di CO 2 esterno collegando un depuratore soda calce alla pompa dell'aria per fregare la concentrazione di CO 2 fino ad almeno 200-250 ppm prima di riempire la camera posteriore fino a 400 ppm mediante la miscela 13 C-CO 2 serbatoio. Cercate di mantenere la camera chiusa per tutta la durata della stagione di crescita per ridurre al minimo l'abbondanza naturale contaminazione di CO 2. Controllare la crescita delle piante visivamente e regolare concimazione e irrigazione in base alla domanda. DENOMINAZIONE "> 8. Concimazione ed Irrigazione Utilizzare una soluzione di fertilizzante, come una soluzione di Hoagland modificata 23, per fecondare le piante attraverso il sistema di irrigazione. Etichettare il fertilizzante con 15 N utilizzando un 15-N KNO 3 subsolution alla mirato atomo% 15 N livello miscelando il 98% atomo 15 N-KNO 3 con abbondanza naturale 15 N-KNO 3 (0,37% atomo di 15 N). Mescolare quantità della soluzione fertilizzante ad ogni evento fertilizzazione per tutta la camera, sulla base della capacità della miscela di impregnazione di trattenere l'acqua. Mettere la giusta quantità di fertilizzante per un vaso in un vaso di vetro, e preparare altrettanti vasetti ci sono vasi. Sbloccare i tubi di irrigazione e mettere ciascuno di essi in un vaso con la soluzione fertilizzante, e poi li collegano alla pompa peristaltica. Le piante acquatiche di pompare acqua attraverso la pompa peristaltica attraverso l'individuo irri flebotubi gazione regolarmente come le piante hanno bisogno di esso. Concimazione con la soluzione di Hoagland dovrebbe seguire la richiesta pianta o disegno sperimentale, con l'aumento della domanda di nutrienti come la produttività dell'impianto aumenta per massimizzare la produttività. In primo luogo, pompare la soluzione di Hoagland attraverso il tubo di irrigazione, poi pompare acqua attraverso un risciacquo per ridurre al minimo la crescita delle alghe e batteri nei tubi. Fissare nuovamente tutti i tubi dopo la fecondazione e l'irrigazione per eliminare camera di perdite d'aria. 9. Uniforme e differenziale Etichettatura Per l'etichettatura differenziale di componenti strutturali e metabolici, rimuovere le piante dalla camera etichettatura 1-3 settimane prima della raccolta. Le piante che devono essere etichettati uniforme possono rimanere nella camera di etichettatura sigillato continuamente fino alla raccolta e irrigato con soluzione al 15 di N-Hoagland. Mantenere le piante rimosse in serra durante questo tempo in modo che essi ricevono luce adeguatae CO 2 in abbondanza naturale 13 C. Per differenziale 15 N etichettatura, continuare a concimare ed irrigare le piante come al solito, ma utilizzare abbondanza naturale 15 N-KNO 3 in soluzione fertilizzante del Hoagland. 10. Raccolto Interrompere l'irrigazione delle piante 1 settimana prima del raccolto così le piante iniziano a senesce e invasatura medie asciuga. Aprire la camera e spostare le pentole per clipping immediata e raccolta della biomassa epigea Versate il mix di invasatura e le radici su uno schermo grossolana. Utilizzare la schermata per separare le radici dal mix di invasatura e scuotere le radici gratuitamente mix di invasatura. Collocare le radici su un setaccio 2 mm e sciacquare con acqua per rimuovere qualsiasi residuo di materiale isolante. Utilizzare le pinzette per rimuovere eventuali vermiculite che possono aggrapparsi alle radici. Lasciare le radici di asciugare in preparazione per futuri esperimenti. <p class = "jove_title"> 11. Litter Chimica Pesare materiale vegetale aria secca per determinare la biomassa camera di etichettatura. Macinare un sottocampione per l'analisi chimica. Porre 2,0 g di forno secchi (60 ° C) lettiera in un acido 125 ml lavato pallone e aggiungere 50 ml di acqua deionizzata. Porre il campione su un piatto preriscaldato agitatore (60 ° C) e posizionare un bar agitatore nel pallone. Impostare l'agitazione per 200 rpm e permettere al campione di riscaldare per 30 min. Dopo 30 minuti, filtrare la soluzione attraverso una lettiera 20 micron maglia di nylon su un sistema di filtrazione sotto vuoto. Trasferire l'estratto in una provetta lavato acido pre-pesate e congelare. Trasferire il residuo solido lettiera di una vaschetta di alluminio pre-pesate ed asciutto a 60 ° C. Pesare pan e rifiuti dopo l'essiccazione per determinare la massa dei residui di acqua calda. Congelare l'estratto secco di acqua calda e pesare per determinare la massa di estratto in acqua calda. Analizzare essiccato in forno (60 ° C) lettiera, acqua calda liofilizzatoestratto, e forno a secco residuo di acqua calda in un Elemental Analyzer – rapporto isotopico Mass Spectrometer (EA-IRMS).

Representative Results

La nostra camera di etichettatura è di 1,2 mx 2,4 mx 3,6 m di dimensione e detiene 40,15 L pentole (Figura 1). Il sistema di controllo computerizzato IRGA mantenuta concentrazioni di CO 2 tra i nostri valori impostati di 360 e 400 ppm nel periodo fotosinteticamente attiva della giornata (Figura 2a). La funzione di basse emissioni di CO 2 di allarme sul IRGA innescato elettrovalvole per consentire di CO 2 dal 13 C arricchito e serbatoi abbondanza naturale nella camera quando la concentrazione è scesa al di sotto della soglia minima (ad esempio 360 ppm). La caratteristica banda morta fermato il flusso quando la concentrazione raggiunge il set point superiore (ad esempio 400 ppm). La temperatura iSeries e il sistema di controllo dell'umidità collegato al condizionatore d'aria e deumidificatore tenuto le condizioni climatiche all'interno dei parametri impostati per tutta la stagione di crescita (Figura 2b). Abbiamo utilizzato una sola tonnellata (3,5 kW) unità di aria condizionata keep il fresco della camera. Il sistema di monitoraggio remoto permesso ai dati registrati di visualizzare in qualsiasi momento da un browser web standard. Le due concentrazioni, temperatura e umidità valori di CO sono stati giù campionati con l'applicazione web per visualizzare i grafici nel corso degli ultimi 24-240 ore, con incrementi di 24 hr. Questo ha creato un rapido visivo per confermare che le fluttuazioni giornaliere erano entro i limiti previsti. Visualizzazione l'interfaccia web ha anche mostrato lo stato attuale della camera, così come gli avvisi forniti ai potenziali problemi come non ricevere dati recenti. In qualsiasi momento il set di dati completo potrebbe anche essere scaricato dall'interfaccia web. Abbiamo misurato radiazione fotosinteticamente attiva (PAR) nell'immediato interno e l'esterno della camera a quattro punti con e senza le luci accese nel bel mezzo dell'estate e mezzo al giorno utilizzando un sensore quantistica. Il PAR nella camera era inferiore del 31,5% rispetto all'esterno quando le luci camera were off e inferiore del 22% rispetto l'esterno quando le luci erano accese. Così, le luci camera contribuiscono ad aumentare notevolmente la penetrazione PAR entro la camera del 9,5% (P <0.05). Il nostro sistema di etichettatura continuo è stato in grado di produrre 2.759 g di A. biomassa gerardii, 37% dei quali era biomassa epigea e il 63% dei quali è stato biomassa ipogea. Abbiamo ottenuto un 13 C un'etichetta pianta intera 4,4% atomo nel nostro materiale vegetale uniforme modificando le elettrovalvole sulle due CO 2 serbatoi di conseguenza (Figura 1, Tabella 1). Abbiamo ottenuto un 15 N etichetta pianta intera 6,7 atom% nel nostro materiale vegetale uniforme miscelando 98 atom% 15 N-KNO 3 con 0,37 atom% 15 N-KNO 3 nella KNO 3 subsolution di soluzione di un Hoagland modificata 23 (Tabella 1) . Abbiamo irrigato la A. settimanale gerardii con 750 ml di liquido totale (acqua più la soluzione di Hoagland) tutta la crescita marefiglio. Abbiamo fertilizzato con 200-500 ml di 15 N etichettato soluzione di Hoagland a settimana a seconda della produttività dell'impianto. Abbiamo utilizzato il metodo di estrazione di acqua calda per determinare se ci fossero differenze isotopiche tra la divisa e materiale vegetale differenziale marcato. Per gli impianti differenziale etichettati, al momento del raccolto abbiamo rimosso le foglie che erano completamente morto e gestite separatamente come questi erano probabilmente non differenziato etichettati. Se si guarda a 13 C contenuti, tutti e quattro i giorni incorporazione erano significativamente differenti tra loro per l'intera pianta e l'estratto a caldo, ma per il giorno residuo di acqua calda 14 e 22 non erano significativamente differenti tra loro (Tabella 1). Quando si confrontano le frazioni tessuto vegetale all'interno di ogni giorno, l'estratto di acqua calda e residui erano significativamente differenti tra loro per tutti i quattro giorni e dal giorno 22 l'intera pianta, estratto, e residui erano tutti significantly diversi tra loro (Tabella 1). Per il 15 N incorporazione in componenti d'impianto, vi erano differenze tra i giorni di incorporazione e di tessuti vegetali frazioni. Per l'estratto a caldo tutti e quattro i giorni incorporazione erano significativamente differenti tra loro per 15 N, e per l'intera pianta e l'acqua calda residuo giorni più brevi costitutivi erano significativamente differenti rispetto ai giorni più lunghi costitutivi (Tabella 1). Le frazioni tessuto vegetale nelle piante uniformi non erano significativamente differenti tra loro in 15 N, ma l'estratto a caldo e residui erano significativamente differenti tra di loro in 15 N per la lettiera differenzialmente etichettati. Tutti i valori isotopici sono rilevate con il cento atomo (atomo%) notazione (Equazione 1), che è una notazione più accurata rispetto% da utilizzare ad alti livelli di pesanteisotopo arricchimento 21. Per esempio: (1) Per questo studio, abbiamo eseguito le analisi statistiche utilizzando SAS versione 9.2. Abbiamo testato le differenze tra i livelli di luce per interni ed esterni da camera con un t-test accoppiato. Abbiamo testato le differenze tra 13 C e 15 N etichettatura di estratti di acqua calda e residui di acqua calda utilizzando l'analisi a senso unico della varianza (ANOVA) in PROC ANOVA. Abbiamo usato test a intervallo multiplo di Duncan per l'analisi dei confronti multipli. La significatività è stata accettata a livello P di 0,05. Abbiamo utilizzato un test di Wilcoxon della somma dei ranghi per verificare che i dati soddisfatte le ipotesi dell'analisi. Figura 1. Schematic diagramma del 40 capacità pot continuo multi-isotopo camera di etichettatura dalla vista a volo d'uccello. Le linee tratteggiate rappresentano il cablaggio elettrico, mentre le linee continue rappresentano tubi gas, acqua o. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita. . Figura 2 A) 2 Concentrazione media di CO (ppm) (+ / -. SE) per un periodo di 24 ore per un'intera stagione di crescita B) Temperatura media (° C), cerchi aperti, e umidità (%), i cerchi chiusi . (+ / – SE) per un periodo di 24 ore per un'intera stagione di crescita Clicca qui per ingrandire imetà. Uniform (0) Differenziale (7) Differenziale (14) Differenziale (22) Tutta Litter 13 C Atom% 4.46 ± 0.02 Aab 3.93 ± 0.05 Ba 3.64 ± 0.03 Ca 3.35 ± 0.06 Db 15 N Atom% 6.69 ± 0.07 Aa 6.72 ± 0.01 Aa 6.33 ± 0.06 Ba 6.41 ± 0.07 Ba <td height="38" rowspan = "2" style = "height: 38px; width: 77px;"> estrarre l'acqua calda 13 C Atom% 4.59 ± 0.04 Aa 3.35 ± 0.06 Bb 2.79 ± 0.06 Cb 2.37 ± 0.03 Dc 15 N Atom% 6.69 ± 0.03 Aa 6.43 ± 0.01 Bb 5.89 ± 0.07 Db 6.16 ± 0.05 Cb Residui di acqua calda 13 C Atom% 4.37 ± 0.06 Ab 4.1 ± 0.03 Ba 3.79 ± 0.10 Ca 3.66 ± 0.05 Ca 15 N Atom% 6.57 ± 0.04 Ba 6.71 ± 0.02 Aa 6.45 ± 0.02 Ca 6.44 ± 0.03 Ca Tabella 1. <strong> Composizione isotopica e lettiera chimica per uniforme e rifiuti in modo differenziato etichettati. Giorni di etichettatura differenziale all'esterno della camera sono tra parentesi. Il confronto tra giorni di incorporazione sono in lettere maiuscole (attraverso righe) e fra le frazioni lettiera sono in lettere minuscole (giù colonne) per ogni variabile.

Discussion

Questo disegno per una camera marcatura isotopica continuo è stato usato per produrre uniformemente e differenzialmente 13 C e 15 N etichettato A. gerardii per il successivo campo ed esperimenti di laboratorio. Nel corso di tre stagioni di crescita di funzionamento, la camera ha temperatura, umidità e concentrazioni di CO 2 entro i parametri impostati (Figura 2), mantenuto con successo. L'affidabilità del sistema di controllo della temperatura è critico durante il picco della stagione estiva, quando elevato irraggiamento solare può causare surriscaldamento nella camera a tenuta d'aria. L'eliminazione dell'umidità in eccesso causato dalla traspirazione delle piante che crescono assicura che pianta stomi rimangono aperti per l'assorbimento fotosintetico 22 e che la condensazione dell'acqua non inibisce la penetrazione della luce o danneggiare la struttura della camera.

Il monitoraggio quasi continuo di concentrazione di CO 2 dal software IRGA mantenuta continua13 C etichettatura delle piante durante la crescita nella camera. A causa della elevata attività fotosintetica di A. gerardii crescendo in questa camera, CO 2 è stato iniettato nel sistema frequentemente durante le ore diurne della stagione di crescere quando l'attività fotosintetica ha tratto concentrazioni di CO 2 fino a 360 ppm, circa ogni 15-20 minuti. La misurazione della arricchito e abbondanza naturale di 13 C-CO 2 serbatoi consentiti per un 4,4% atomo di 13 C in atmosfera controllata attraverso la stagione di crescita per l'etichettatura tessuto vegetale uniforme. 13 C-produzione di CO 2 può essere ottenuto anche mescolando 13 C-sodio bicarbonato o carbonato di 13 C-sodio e acido cloridrico, tuttavia questo tipo di sistema è più complicato e richiede più il monitoraggio e la manutenzione, quindi si consiglia di utilizzare 13 C-CO 2 gas. Una considerazione importante per il monitoraggio di CO 2 concentrations utilizzano un IRGA è che gli analizzatori all'infrarosso perdere due terzi del loro sensibilità quando si misurano 13 C-CO 2. Questa sottovalutazione di circa il 2,9% ppm per la nostra miscela 4,4% 13 C-CO 2 non è stato di grande preoccupazione per noi, ma potrebbe diventare un problema più significativo quando l'etichettatura ai più alti livelli di 13 C 27.

A. gerardii è una stagione calda tallgrass permanenti prairie specie Graminoid. Il design di questa camera è stata ottimizzata per A. produzione gerardii (Figura 1). La dimensione e l'altezza della camera sono stati scelti in considerazione per la massima produttività altezza A. gerardii nel campo, così come per la produzione di biomassa vegetale desiderato per futuri esperimenti. A. gerardii è noto per essere luce limitata nel campo 24,25. PAR all'interno di una serra può essere diminuito 30-47% rispetto ai livelli esterni 26. Poiché il nostro stabilimentos sono state coltivate in una camera di vetro acrilico all'interno di una serra, limitazione PAR era una preoccupazione. Una volta acceso, le luci fluorescenti hanno aumentato PAR all'interno della camera del 9,5%, che può aver contribuito ad aumentare la produttività in questa luce specie sensibili. Quando si utilizza questo disegno della camera di crescere altri tipi di piante specifiche esigenze fisiologiche come la dimensione, l'illuminazione, le esigenze nutrizionali, la sensibilità alla temperatura e umidità del suolo deve essere attentamente su misura per mantenere le condizioni ottimali di crescita per le piante.

Quando si lavora con costosi composti marcati con isotopi, come ad esempio il 10% atomo di 13 C-CO 2 e il 98% atom 15 N-KNO 3, efficienza di etichettatura è una considerazione importante. Questo disegno della camera ottimizza 13 C etichettatura facendo tutti gli sforzi per sigillare la camera e ridurre al minimo le perdite d'aria dentro e fuori dalla camera. Se questa camera non viene mai aperto durante la stagione di crescita, allora nessuno dell'etichetta 13 CEd CO 2 dalla camera è fuoriuscito nell'atmosfera. La CO 2 accumulo durante la respirazione notte non sembra danneggiare le piante in crescita e viene rapidamente assorbito dopo l'alba (Figura 2). Durante etichettatura differenziale, la camera è stata brevemente aperto per rimuovere le pentole differenzialmente etichettati ma questo non sembra diluire il targeting 4,4% atomo 13 C etichettatura delle piante continuamente etichettati (Tabella 1). 13 C etichettatura è stata ottimizzata con il lavaggio il aria atmosferica iniziale intrappolata nella camera upon tenuta. Durante i test preliminari sulla camera senza una macchia iniziale di CO 2 atmosferica, le piante sono state misurate per avere un diluito livello 13 C nelle prime foglie prodotte che nelle foglie successive prodotte. Lo scrub iniziale di CO 2 atmosferica al momento della chiusura della camera appare per eliminare questo problema, consentendo per l'etichettatura continua 13 C dapiantina alla maturità. Il mantenimento di una invasatura impasto privo di suolo di sabbia, vermiculite, e argilla elimina anche abbondanza naturale contaminazione di CO 2 da respirazione del suolo. L'eliminazione del terreno dal sistema non richiede attente considerazioni fertilizzazione e inoculo, che può essere unica per diverse specie vegetali. 15 N etichettatura attraverso il 7 atomo% 15 soluzione di N Hoegland mirato prodotta materiale vegetale altamente etichettate 6,7 atom% 15 N (Tabella 1). Una leggera diluizione dall'etichetta mirata 15 N può essere causato da qualche abbondanza naturale N nella miscela di impregnazione o dalla inoculazione nativo suolo.

Durante biosintesi di composti, discriminazione naturale del 13 C (o 15 N) si verifica come conseguenza di frazionamento cinetica e distribuzione isotopica nonstatistical nei composti sintetizzati. Così, nel caso di C, prodotti secondari (es. lipidi, composti fenolici) sono generalmente esaurite in 13 C rispetto ai prodotti primari (carboidrati). Tale discriminazione naturale 13 C sembrano persistere anche quando le piante sono coltivate in un ambiente arricchito C 13, come si può vedere nella leggera differenza in atom% 13 C degli estratti di acqua calda e residui di acqua calda delle piante etichettate uniformemente (Tabella 1 ). Questo frazionamento cinetico naturale è molto piccola rispetto all'arricchimento e non compromette l'uniformità della etichettatura.

Etichettatura differenziale dei tessuti vegetali strutturali e metaboliche è una tecnica innovativa con un potenziale di studi avanzati in decomposizione lettiera, ecologia microbica del suolo e la formazione di materia organica. La differenza di 13 C e 15 N degli estratti di acqua calda e residui di acqua calda indica una diluizione significativa di 13 C e 15 N nella lisciviabile, bassacomposti con peso molecolare (estratti acqua calda) dal materiale vegetale strutturale (residui di acqua calda) dopo 7, 14, e 22 giorni di etichettatura differenziale (p <0.005). Tale etichettatura differenziale dei tessuti vegetali può essere utilizzato per monitorare il destino di componenti strutturali e metabolici separatamente attraverso un ecosistema. L'etichettatura differenziale di 13 C è stata più estremo di 15 etichette differenziale N. Ciò può essere dovuto alla immediatezza di 13 C diluizione nel rimuovere le piante dal 13 C-CO 2 nell'atmosfera etichettati, mentre l'etichetta 15 N rimane nella miscela di impregnazione per qualche tempo e 15 N diluizione avviene più lentamente. Per l'etichettatura più drastica differenziale di 15 N, si può considerare il lavaggio delle pentole con acqua prima di abbondanza naturale concimazione durante le ultime settimane di crescita al di fuori della camera.

La progettazione e il funzionamento di questo continuo 13 </ Sup> C e 15 N sistema di etichettatura per uniforme o differenziale, metaboliche e, etichettatura tessuto vegetale strutturale fornisce un nuovo metodo per la produzione di materiale vegetale marcati con isotopi per la ricerca avanzata. Il design ei dettagli operativi di questa camera sono stati scelti per 4,4 atom% 13 C e il 7% atomo di 15 N etichettatura di A. gerardii, ma può essere adattato ad altri tipi di piante e livelli di etichettatura isotopi. Le condizioni di crescita qui descritte dovrebbero essere adattati per soddisfare le dimensioni, temperatura, umidità, luce, acqua e nutrienti esigenze di particolari specie vegetali di interesse. Etichettatura con 18 o O 2 H può anche essere ottenuta etichettatura dell'acqua utilizzata nel sistema di irrigazione. Il sistema qui descritto risolve molte delle sfide di uniforme e differenziale 13 C etichettatura di materiale vegetale. Questo disegno di base camera può essere utilizzato da altri gruppi di ricerca per produrre materiale vegetale altamente marcato per advstudi dell'ecosistema biogeochimica bilanciato.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Un ringraziamento speciale al Growth Facility Impianti e EcoCore struttura analitica presso la Colorado State University e ai tanti studenti e insegnanti che hanno contribuito a questo progetto. Questo lavoro è finanziato dalla NSF DEB concessione # 0918482, ha bisogno USDA Nazionale Fellowship, e il fondo Cotrufo-Hoppess per la ricerca di ecologia del suolo.

Materials

40 in Remote Tower Fan Living Accents FS10-S3R-A
42 in Electric Tower Fan with remote control LASKO 2559
Mr. Slim Split-type air conditioner Mitsubishi Electric R410A
Electronic 24 hr time switches Intermatic ET100C Operates Fluorescent Light System
iSeries Humidity and Temp Controller Omega CHiTH-i8DV33-5-El
Solid State Relay Omega SSRL240
CKR Series Solid State Relay Crydon
Solenoid Coils Dayton 6X543
GasHound CO2 Analyzer LI-COR LI-800
Dehumidifier Dayton 1DGX4
Specialty gas regulator Airgas CGA 580
T5 Hight Output Commercial Fluorescent Light System Hydro Farm FLT48
Air pump Thermo Scientific 420-1901
Masterflex Cartridge Pump HeadSystem Cole Parmer 7553-70
1900 Series Network Switch Catalyst
Profile Porus Ceramic Top Dressing Greens Grade
Industrial Quartz 40 mesh Unimin 4095
Mycorrhizae Professional Growing Medium ProMix
Vermiculite and Perlite Thermo-Ran C633
Potassium Nitrate- 15N 98 atom % Sigma-Aldrich 335134
Carbon-13C Dioxide 10 atom % Sigma-Aldrich 600180
Medical grade CO2 Airgas
Regulator Airgas  CGA 350
4 in box fans Grainger
Masterflex PharMed BPT Tubing Cole Parmer HV-06508-24
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References

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Soong, J. L., Reuss, D., Pinney, C., Boyack, T., Haddix, M. L., Stewart, C. E., Cotrufo, M. F. Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling. J. Vis. Exp. (83), e51117, doi:10.3791/51117 (2014).
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