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Environment

Conception et l'exploitation d'un continu<sup> 13</sup> C et<sup> 15</sup> N Chambre pour uniforme ou différentiel étiquetage, métabolique et structurale, usine de production d'isotopes étiquetage

Published: January 16, 2014
doi:
10.3791/51117
, , , , , ,
1Natural Resource Ecology Laboratory,Colorado State University, 2Soil Plant Nutrient REsearch,USDA-ARS, 3Department of Soil and Crop Sciences,Colorado State University

Summary

Cette méthode explique comment construire et d'exploiter un continu 13 C et 15 N chambre de marquage isotopique pour uniforme ou plante différentiel étiquetage des tissus. Les résultats représentatifs du métabolisme et de l'étiquetage structurelle de gerardii Andropogon sont discutées.

Abstract

Traçage des isotopes stables rares de matériel végétal dans l'écosystème fournit les informations les plus sensibles sur les processus des écosystèmes; du flux de CO 2 et formation du sol de la matière organique à petite échelle isotopes stables biomarqueur sondage. Coupler plusieurs isotopes stables tels que 13 C avec 15 N, 18 O et 2 H a le potentiel de révéler encore plus d'informations sur les relations complexes stoechiométriques pendant transformations biogéochimiques. matériel végétal isotopique marqué a été utilisé dans diverses études de décomposition de la litière et de la formation du sol en matière organique de 1 à 4. A partir de ces études et d'autres, cependant, il est apparu que les composants structurels de la matière végétale se comportent différemment des composants métaboliques (composés ie. Lixiviables de bas poids moléculaire) en termes d'utilisation microbienne et de longue durée de stockage de carbone 5-7. La possibilité d'étudier les composants structuraux et métaboliquesfournit séparément un nouvel outil puissant pour faire avancer l'avant-garde des études biogéochimiques des écosystèmes. Ici, nous décrivons un procédé de production 13 C et 15 N de matériel végétal qui est marqué soit marqué uniformément dans toute la plante ou marquées de façon différentielle dans les composants structurels et métaboliques végétales.

Ici, nous présentons la construction et l'exploitation d'un continu 13 C et 15 N chambre d'étiquetage qui peut être modifié pour répondre aux différents besoins de la recherche. Matériel végétal uniformément marqué est produit par étiquetage continue de germination à la récolte, tandis que l'étiquetage différentiel est obtenu en enlevant les plantes qui poussent dans les semaines de la chambre avant la récolte. Les résultats représentatifs de plus en plus Andropogon gerardii Kaw démontrer la capacité à efficacement le matériel végétal d'étiquette aux niveaux ciblés du système. Grâce à cette méthode, nous avons produit du matériel végétal avec un atome de 4,4% C 13 6,7% en atomes et 15 </ Sup> étiquette de plante N uniforme, ou d'un matériau qui est différentiellement marqué par jusqu'à 1,29% en atomes de 13 C et 0,56% en atomes de 15 N dans son métabolisme et des composants structurels (composants résiduels de l'eau chaude et de l'eau extractible à chaud, respectivement). Défis résident dans le maintien de la bonne température, l'humidité, la concentration de CO 2, et les niveaux de lumière dans un contenant hermétique 13 C-atmosphère de CO 2 pour la production de l'usine de succès. Cette description de la chambre représente un outil de recherche utile pour produire efficacement de manière uniforme ou différentielle matériel végétal marqué multi-isotopes pour utilisation dans des expériences sur l'écosystème des cycles biogéochimiques.

Introduction

Comprendre la dynamique des processus sol-plante-atmosphère est essentiel pour prédire avec précision comment le carbone mondial (C) et d'azote (N) la fonction de cycles dans des conditions environnementales actuelles et futures. Les isotopes stables sont des outils puissants dans les études quantitatives de sol-plante-atmosphère C et N vélo. Traçage des isotopes stables rares de matériel végétal dans l'écosystème fournit des informations sensibles dans des études de cycles biogéochimiques, de flux de CO 2 et le sol organique formation de la matière à petite échelle isotopes stables biomarqueur sondage par exemple 4,8,9. La combinaison de 13 étiquetage C avec 15 N étiquetage, ou d'autres isotopes stables tels que 2 H ou 18 O dans les tissus de la plante fournit une haute détection, traçabilité substrat, encore complexe pour une utilisation dans les études couplées de l'usine et de la biochimie des sols. La capacité d'étiqueter de manière uniforme ou différentielle structurale et métabolique matériel végétal annonceds en outre la capacité de répondre à des questions complexes sur C et N à vélo à travers les écosystèmes. L'avantage d'utiliser du matériel végétal de l'isotope marqué dans les études quantitatives de C et N comptabilité, cependant, dépend de la capacité à produire des 13 C et 15 N matière marquée qui est soit uniformément ou de manière différentielle marquée.

étiquetage isotopique a été utilisé dans des études portant sur ​​l'usine C et N assimilation 10, 11 et allocation rhizodéposition 12. Matériel végétal marqué uniformément 13 C et 15 N fournit un substrat marqué de complexe pour les études de décomposition de la litière 1,4, le sol formation de la matière organique du sol, 2,6 émissions de CO 2, 4 études alimentaires sol web 13, et des études de sol C temps de séjour 2,14. Études utilisant 13 biochar C marqué de matériel végétal marqué commencent également à révéler de nouvelles informations à propos de autrefois négligépiscines char du sol 15. Alors que 15 N, 2 H et 18 O étiquetage sont relativement faciles à atteindre par le traitement de l'eau et de l'engrais, le défi existe dans la production de matériel végétal uniforme 13 C marqué par 13 C-fixation du CO 2.

Continuous marquage isotopique de semis à maturité dans une chambre étanche produit marquage isotopique uniforme dans toute la plante. D'autres méthodes telles que l'étiquetage répétée d'impulsion 16 et l'application foliaire ou mèche 17,18 ne produisent pas de matériel végétal isotope étiquetés de manière uniforme, ni étiquetage clair différentielle de C-composés spécifiques (par exemple métabolique vs structurel) 19. Une considération importante dans l'étiquetage isotopique appose efficacité, en raison du coût élevé de composés enrichis en isotopes rares utilisées dans l'étiquetage. Bien que l'étiquetage en continu de 13 C a été utilisée dans le passé 2-4,20, il n'y a pas, à notre connaissanceune description technique détaillée publiée d'une chambre d'étiquetage continu des éléments de preuve de l'efficacité de l'étiquetage et de contrôle de haute précision de la quantité et de l'uniformité de marquage isotopique.

Sur la pointe de la décomposition de la litière et le sol la recherche de la formation de la matière organique est le concept que le matériel végétal métabolique (c.-à-lessivable, composés labiles de bas poids moléculaire) et le matériel végétal structurel (. Lignine, la cellulose, l'hémicellulose) sont traitées différemment en termes de microbienne efficacité de l'utilisation, formation du sol en matière organique, et à long terme des sols C stockage 5-7. Le matériel végétal qui est étiqueté différemment ses éléments structuraux et métaboliques, par conséquent, est un outil utile pour faire avancer décomposition de la litière et le sol de la recherche la formation de la matière organique. Étiquetage différentiel avec deux isotopes permet le traçage des composants structuraux et métaboliques séparément dans l'écosystème en utilisant un isotope techniqu multiples de la piscinee 21.

Continue marquage isotopique de 13 C et d'autres isotopes dans une chambre étanche nécessite une attention particulière à planter des conditions physiologiques pour maximiser la productivité de l'usine et l'efficacité de l'étiquetage isotopique. Journée des pointes de température doivent être contrôlées pour éviter d'endommager les plantes lors de la croissance dans une chambre étanche à l'air. Une gamme optimale de l'humidité et de la température sont nécessaires pour maintenir les stomates des plantes ouvert et absorption de CO 2 22. Des niveaux élevés d'humidité cause de la buée sur les parois de la chambre, ce qui réduit la disponibilité en lumière et peut endommager la structure de la chambre. Une attention particulière à l'efficacité de l'étiquetage isotopique en éliminant isotopes naturels de l'abondance de la chambre (par exemple en provenance de rempotage matière organique du sol) et la prévention de l'exposition à l'air extérieur est important lorsque l'on travaille avec des isotopes lourds composés marqués coûteux.

Ici, nous présentons une méthode de construction et l'exploitation d'uncontinu 13 double C et 15 chambre d'étiquetage N isotopique pour la production de matériel végétal qui est soit uniformément marqué ou a ses composantes structurelles et métaboliques marqués à des niveaux distincts. 13 étiquetage C est contrôlée au niveau de la chambre, tandis que la fertilisation et 15 N étiquetage est contrôlée au niveau de pot individuel. Les résultats représentatifs sont présentés pour démontrer la capacité de cette méthode pour contrôler la température, l'humidité et la concentration de CO 2 pendant toute la saison de croissance. Les résultats de plus en plus gerardii Andropogon, Kaw démontrent également la capacité de cette méthode pour produire du matériel végétal uniforme ou différentielle marqué. Le régime spécifique de conception et de fonctionnement décrit chambre peut être modifié pour cultiver des espèces végétales différentes, ainsi que pour accommoder 2 H 18 O ou étiquetage.

Protocol

Une. Chambre de la Construction Construire la chambre d'étiquetage dans une serre pour permettre le potentiel de la lumière naturelle au maximum la croissance des plantes. Assurez-vous que l'alimentation adéquate est disponible pour alimenter tous les composants de la chambre. Construire la chambre de l'étiquetage par le montage de 3,175 mm parois transparentes en acrylique épais (polycarbonate conviendrait également) et un 6,35 mm d'épaisseur plafond acrylique transparent sur un cadre en aluminium avec un plancher en acier peint en blanc afin de maximiser la réflectance solaire. Les dimensions de la chambre peuvent être adaptés pour répondre aux besoins individuels de recherche. Montez la chambre de ¾ po (19 mm) d'épaisseur sur des parpaings. Percez des trous dans le verre acrylique, cadre en aluminium et un plancher en acier et utiliser des vis pour attacher tous les composants ensemble. Sceller tous les joints avec un mastic de silicone pour assurer un joint étanche à l'air. Construire une porte en montant une section de l'habillage acrylique sur de longues vis, qui peut être vissé à l'aide remoécrous à oreilles vable. Scellez la porte coupe-froid pour éviter les fuites d'air. Sélectionnez une zone directement adjacente à la chambre que le centre de contrôle de monter toutes les températures, l'humidité, CO 2 contrôles, et l'équipement de surveillance. Percer des petits trous avec précaution dans la paroi de la chambre adjacente au centre de contrôle pour tous les câbles électriques et des tubes à gaz. Utilisez mastic silicone pour sceller les trous autour de tous les fils et les tubes pour éviter les fuites d'air. Testez la chambre pour les fuites d'air en le remplissant avec un niveau élevé de CO 2 (par exemple 800 ppm) et laisser reposer toute la nuit. Si la concentration en CO 2 dans la chambre est maintenue à son niveau initial, puis il est étanche à l'air. Si la concentration des gouttes de la nuit puis toutes les coutures doivent être examinés et refermés avec du silicone calfeutrage jusqu'à un joint étanche à l'air est atteint. Pour certaines plantes adaptées aux conditions de luminosité élevées, ajouter des lumières reliées à une minuterie à l'extérieur immédiat de la chambre d'augmenter la pénétration de la lumière et de la productivité de l'usine. 2. Contrôle de température et d'humidité Réguler la température de la chambre par l'installation d'un type de climatiseur split commercial avec les refroidissement (évaporateur) bobines situées à l'intérieur de la chambre et les bobines de compresseurs et condenseurs situés à l'extérieur de la serre pour dissiper la chaleur. Réglez le climatiseur pour maintenir la température souhaitée. Utilisez une petite pièce déshumidificateur pour contrôler l'humidité dans la chambre. Percer un trou de drainage à travers le plancher de la chambre adjacente à la déshumidificateur. Retirer le collecteur de condensat provenant du déshumidificateur, et raccorder un tuyau de drainage à partir du déshumidificateur par le trou de drainage dans le sol de la chambre. Sous la chambre, placez un pot ouvert rempli d'eau pour que le déshumidificateur à vider directement dans. Ceci crée un joint étanche à l'air, mais aussi permettre l'équilibrage de pression. <li> installer un contrôleur, comme le contrôleur Omega iSeries, dans le centre de commande avec un capteur d'humidité à l'intérieur de la chambre. Connectez le contrôleur au système de déshumidification avec un relais à l'état solide et régler le régulateur d'humidité avec une alarme de haute et de swing pour maintenir des conditions de croissance optimales dans la chambre. Conditions de température et d'humidité optimales diffèrent pour les espèces de plantes différentes. 3. CO 2 Commandes Le 2 enrichissement 13 C-CO est réalisée en utilisant deux 2 réservoirs de gaz de CO pur, l'un des 10% d'atomes 13 C-CO 2 ou plus et un atome de 1,1% 13 C-CO 2 (abondance naturelle). Surveiller la concentration de CO 2 en ayant une pompe à membrane dessiner en continu de l'air de la chambre à travers un analyseur de gaz à infrarouge (IRGA), puis la pompe à air dans la chambre, en maintenant ainsi un système fermé (figure 1). Seta alarme basse et bande morte sur le logiciel IRGA de maintenir les concentrations de CO 2 dans une gamme désirée. Ici, nous utilisons une alarme basse de 360 ppm avec une bande morte de 40 ppm à maintenir concentrations de CO 2 entre 360-400 ppm. Connectez une vanne de dosage de chaque réservoir et soigneusement les ajuster pour atteindre le niveau C d'enrichissement cible 13. Définissez les régulateurs de réservoir à 20 psi. Insérer une électrovanne entre la soupape de dosage et le régulateur de chaque réservoir. Rejoignez les sorties des deux valves doseuses ensemble et les canaliser dans le centre de la chambre. Fil d'un relais à l'état solide à la sortie IRGA pour commander les soupapes électromagnétiques (figure 1). 4. Système de surveillance à distance basée sur le Web Surveillance de concentrations de CO 2 à partir du logiciel IRGA en vous connectant à un fichier local, une fois toutes les 30 sec. Créez un utilitaire personnalisé (par exemple en perl ou autre langage de programmation) de choisirentrées jusqu'à à partir du fichier de journalisation locale CO 2, ainsi que l'horodatage de portable actuel, et les télécharger sur une application web back-end. Régler l'application web pour interroger la température et des données de capteur d'humidité. Utilisez un système de suivi pour vérifier l'état de la température dans la chambre toutes les cinq minutes pour éviter les pics de température potentiels qui pourraient détruire les plantes si le système de conditionnement d'air a échoué. Surveiller les données de CO 2, la température et l'humidité sur n'importe quel navigateur Web standard, de sorte que les pointes de température inattendus ou CO 2 gouttes peuvent être immédiatement assisté à. 5. Système d'irrigation Percer un petit trou dans la paroi de la chambre en verre acrylique par pot. Utilisez des tuyaux d'irrigation goutte à goutte pour créer un anneau d'irrigation par pot et nourrir le tuyau d'irrigation à travers la paroi de la chambre à l'extérieur. Sceller les trous dans le tuyau d'irrigation avec joint de siliconepour empêcher les fuites d'air. A l'extérieur de la chambre, connecter le tube d'irrigation à la tubulure d'une pompe péristaltique. Utilisez un petit collier de serrage pour fermer tous les tubes d'irrigation pour éviter les fuites d'air entre les arrosages. 6. Plantes en pot Sélectionnez une taille de pot approprié pour les plantes cultivées. Ici, 40, 15 L pots sont utilisés. Créer un terreau sans sol par le mélange du sable, de la vermiculite, et le profil de céramique poreuse. Tester la capacité de rétention d'eau du terreau en pesant un pot rempli sec, tremper le pot avec de l'eau et lui permettre de se vider complètement, et en pesant le pot humide. Utilisez cette capacité de rétention d'eau maximale pour s'assurer que l'excès d'engrais marqué et l'eau ne coule pas des pots lors de l'arrosage. Germer des graines dans du terreau avant de les planter dans des pots. Cela garantit que les semences ne germent avec succès sont démarrés dans la chambre d'étiquetage. Inoculer t il semis avec du lisier de sol frais à introduire des microbes bénéfiques. Une fois que les graines ont germé, transplanter les plants soigneusement les pots dans le nombre souhaité. Une fois mis en pot, déplacer les pots dans la chambre et assembler chaque pot avec un tuyau d'arrosage individuel. 7. Étanchéité de la Chambre Lorsque le premier élément d'étanchéité de porte de la chambre d'une grande masse d'air externe remplit l'espace de la chambre. Frotter ce CO 2 externe par connexion d'un épurateur de chaux sodée pour la pompe à air pour nettoyer la concentration de CO 2 vers le bas à au moins 200 à 250 ppm avant de remplir la chambre arrière vers le haut à 400 ppm en utilisant le mélange de la cuve 13 C-CO 2. Essayez de garder la chambre fermée pendant toute la durée de la saison de croissance pour réduire l'abondance naturelle de la contamination CO 2. Surveillance de la croissance des plantes visuellement et ajuster la fertilisation et de l'irrigation selon la demande. itre "> 8. fertilisation et de l'irrigation Utilisez une solution d'engrais, tels que la solution de Hoagland modifié un 23, pour fertiliser les plantes à travers le système d'irrigation. Étiqueter l'engrais avec 15 N en utilisant un 15 N-KNO 3 sous-solution à l'atome ciblée% 15 N niveau en mélangeant 98% d'atomes 15 N-KNO 3 avec abondance naturelle de 15 N-KNO 3 (0,37% atomique 15 N). Mélanger suffisamment de la solution d'engrais à chaque événement de fertilisation pour l'ensemble de la chambre, sur la base de la capacité de rétention d'eau de la composition d'enrobage. Placez la bonne quantité d'engrais pour un pot dans un bocal en verre, et préparer autant de pots il ya des pots. Desserrer les tuyaux d'irrigation et de placer chacun d'eux dans un bocal avec la solution d'engrais, puis les relier à la pompe péristaltique. Les plantes aquatiques par pompage de l'eau à travers la pompe péristaltique par l'irritation de récupération individuelletuyaux d'gation régulièrement que les plantes ont besoin. La fertilisation avec la solution de Hoagland devrait suivre la demande de la plante ou de la conception expérimentale, avec l'augmentation de la demande de nutriments que les gains de productivité de l'usine afin de maximiser la productivité. Tout d'abord, pomper la solution de Hoagland à travers le tuyau d'irrigation, puis pomper un rinçage à l'eau par le biais de minimiser la croissance des algues et des bactéries dans les tubes. Reclamp tous les tuyaux après fertilisation et irrigation pour éliminer les fuites d'air de la chambre. 9. Uniforme et différencié étiquetage Pour l'étiquetage différencié de composants structuraux et métaboliques, enlever les plantes de la chambre de l'étiquetage 1-3 semaines avant la récolte. Les plantes qui doivent être uniformément marqué peuvent rester dans la chambre d'étiquetage scellé en continu jusqu'à la récolte et irriguées avec une solution de 15 N-Hoagland. Gardez les plantes enlevées dans la serre pendant ce temps afin qu'ils reçoivent suffisamment de lumièreet CO 2 en abondance naturelle 13 C. Pour différentiel 15 N étiquetage, continuer à fertiliser et arroser les plantes, comme d'habitude, mais utiliser l'abondance naturelle de 15 N-KNO 3 dans la solution d'engrais de la Hoagland. 10. Récolte Arrêtez plantes 1 semaine avant la récolte afin d'arroser les plantes commencent à vieillir et terreau s'assèche. Ouvrez la chambre et déplacer les pots l'écrêtage immédiate et la récolte de la biomasse aérienne Verser le mélange de terreau et des racines sur un écran grossier. Utilisez l'écran pour séparer les racines du terreau et secouer les racines libres de terreau. Placez les racines sur un tamis de 2 mm et les rincer à l'eau pour éliminer tout matériau d'enrobage restante. Utilisez des pinces pour enlever toute la vermiculite qui peuvent s'accrocher aux racines. Autoriser les racines à l'air libre en préparation pour de futures expériences. <p class = "jove_title"> 11. Chimie de la litière Peser matériel végétal séché à l'air pour déterminer chambre de l'étiquetage de la biomasse. Broyer un sous-échantillon pour l'analyse chimique. Placer 2,0 g de séchage à l'étuve (60 ° C) dans une litière acide 125 ml lavé ballon et ajouter 50 ml d'eau déminéralisée. Placer l'échantillon sur un four préchauffé (60 ° C) plaque d'agitation et placer une barre d'agitation dans le ballon. Réglez l'agitation de 200 tours par minute et l'échantillon à chauffer pendant 30 min. Après 30 min, filtrer la solution à travers une litière de 20 um Nylon mesh sur un système de filtration sous vide. Transférer l'extrait dans un tube d'acide lavé préalablement pesé et congeler. Transférer le résidu solide de litière dans une casserole en aluminium préalablement pesée et sèche à 60 ° C. Plateau de pesée et de la litière après séchage pour déterminer la masse de résidus d'eau chaude. Lyophiliser l'extrait de l'eau chaude et peser pour déterminer la masse de l'extrait à l'eau chaude. Analyser séché au four (60 ° C) d'une litière, de l'eau chaude lyophiliséextrait et séché au four résidu de l'eau chaude dans un analyseur élémentaire – rapport isotopique spectromètre de masse (EA-IRMS).

Representative Results

Notre chambre de l'étiquetage est de 1,2 mx 2,4 mx 3,6 m en taille et en détient 40,15 L pots (Figure 1). Le système de contrôle informatisé IRGA maintenue concentrations de CO 2 entre les valeurs de consigne de 360 et 400 ppm pendant la période active la photosynthèse de la journée (Figure 2a). La faible CO 2 fonction d'alarme sur la IRGA déclenché électrovannes pour permettre de CO 2 du 13 C enrichi et réservoirs naturels d'abondance dans la chambre lorsque la concentration a chuté en dessous du seuil minimum (par exemple 360 ppm). La fonction de bande morte arrêté l'écoulement lorsque la concentration atteint le point de consigne supérieure (par exemple 400 ppm). La température iSeries et système de contrôle de l'humidité relié au conditionneur d'air et déshumidificateur tenue conditions climatiques à l'intérieur des paramètres définis tout au long de la saison de croissance (Figure 2b). Nous avons utilisé un d'une tonne (3,5 kW) unité de conditionnement d'air pour keep la chambre froide. Le système de surveillance à distance a permis aux données enregistrées pour être consultés à tout moment par un navigateur Web standard. Les valeurs 2 concentrations, température et humidité de CO ont été échantillonné par l'application Web pour afficher des graphiques sur le passé 24-240 h, en 24 incréments de h. Cela a créé un visuel rapide pour confirmer que les fluctuations quotidiennes étaient dans les limites prévues. Affichage de l'interface web a également montré l'état de la chambre actuelle, ainsi que les alertes fournies aux problèmes potentiels tels que ne pas recevoir des données récentes. A tout moment l'ensemble des données peut également être téléchargé à partir de l'interface web. Nous avons mesuré la photosynthèse rayonnement actif (PAR) à l'intérieur et à l'extérieur de la chambre à quatre points avec et sans les lumières dans le milieu de l'été et le milieu de la journée en utilisant un capteur quantique immédiate. Le PAR dans la chambre était de 31,5% inférieur à l'extérieur quand les lumières de la chambre wERE off et 22% de moins que l'extérieur quand les lumières étaient allumées. Ainsi, les lumières de la chambre permettent d'augmenter de façon significative la pénétration de la RAP à l'intérieur de la chambre de 9,5% (P <0,05). Notre système d'étiquetage continu était capable de produire 2759 g de A. biomasse gerardii, 37% de ce qui était la biomasse aérienne et 63% de ce qui était la biomasse souterraine. Nous avons réalisé un 13 C étiquette de plante 4,4% d'atomes ensemble dans notre matériel végétal uniforme en définissant les électrovannes sur les deux réservoirs 2 CO en conséquence (figure 1, tableau 1). Nous avons réalisé un 15 N étiquette de plante 6,7% d'atomes ensemble dans notre matériel végétal uniforme en mélangeant 98% d'atomes 15 N-KNO 3 avec 0,37% d'atomes 15 N-KNO 3 dans le KNO 3 sous-solution de la solution d'un Hoagland modifié 23 (tableau 1) . Nous avons dilué la A. hebdomadaire gerardii avec 750 ml de liquide total (eau plus la solution de Hoagland) tout au long de la mer de plus en plusfils. Nous fertilisé avec 200-500 ml de 15 N marqué la solution de Hoagland par semaine en fonction de la productivité de l'usine. Nous avons utilisé la méthode d'extraction de l'eau chaude afin de déterminer s'il existait des différences isotopiques entre l'uniforme et le matériel végétal différemment marqué. Pour les plantes marquées de façon différentielle, moment de la récolte, nous avons supprimé toutes les feuilles qui étaient complètement morts et manipulés séparément les comme ils sont probablement pas marqués de façon différentielle. Lorsque l'on regarde 13 la teneur en C, l'ensemble des quatre jours d'incorporation étaient significativement différentes l'une de l'autre pendant toute la plante et l'extrait à l'eau chaude, mais pour le jour de résidus d'eau chaude 14 et 22 ne sont pas significativement différents les uns des autres (Tableau 1). Lorsque l'on compare les fractions de tissus de plantes au sein de chaque jour, l'extrait à l'eau chaude et les résidus sont significativement différentes l'une de l'autre pour tous les quatre jours et 22 jours par la plante entière, de l'extrait, et des résidus étaient significantly différents les uns des autres (Tableau 1). Pour la 15 N incorporation dans les composants de la plante, il y avait des différences entre les jours de constitution et de tissus végétaux fractions. Pour l'extrait de l'eau chaude les quatre jours de constitution étaient significativement différents les uns des autres pour 15 N, et pour toute la plante et l'eau chaude résidu les journées plus courtes de la société ont été significativement différente de celle des jours de plus de l'incorporation (tableau 1). Les fractions de tissus végétaux dans les plantes uniformes ne sont pas significativement différents les uns des autres dans le 15 N, mais l'extrait à l'eau chaude et les résidus sont significativement différentes l'une de l'autre en 15 N pour la litière de manière différentielle marquée. Toutes les valeurs isotopiques sont comptabilisés en utilisant le pour cent d'atomes (atome d'%) de notation (équation 1), qui est une notation plus précise que% à utiliser à des niveaux élevés de fortesisotope enrichissement 21. Par exemple: (1) Pour cette étude, nous avons effectué des analyses statistiques en utilisant SAS la version 9.2. Nous avons testé les différences entre les niveaux d'éclairage intérieurs et extérieurs chambre en utilisant un test t apparié. Nous avons testé les différences entre 13 C et 15 N étiquetage des extraits d'eau chaude et les résidus d'eau chaude utilisant une analyse de variance (Anova) dans PROC ANOVA. Nous avons utilisé test de gamme multiple de Duncan pour l'analyse de comparaisons multiples. Importance a été accepté à un niveau P de 0,05. Nous avons utilisé un test Wilcoxon somme pour vérifier que les données réunies les hypothèses de l'analyse. Figure 1. Schematic schéma de la chambre de l'étiquetage de 40 capacité de pot continue multi-isotope à la vue de l'oeil d'un oiseau. Les lignes en pointillé représentent le câblage électrique, tandis que les lignes pleines représentent gaz ou le tube de l'eau. Cliquez ici pour agrandir l'image. . Figure 2) la concentration de CO Moyen 2 (ppm) (+ / -. SE) sur une période de vingt-quatre heures pour toute une saison de croissance B) Température moyenne (° C), les milieux ouverts, et l'humidité (%), des cercles fermés . (+ / – SE) sur une période de vingt-quatre heures pour toute une saison de croissance Cliquez ici pour agrandir l'imâge. Uniforme (0) Différentiel (7) Différentiel (14) Différentiel (22) Tout le Litter C 13% Atom 4,46 ± 0,02 Aab 3,93 ± 0,05 Ba 3,64 ± 0,03 Ca 3,35 ± 0,06 Db 15 N% Atom 6,69 ± 0,07 Aa 6,72 ± 0,01 Aa 6,33 ± 0,06 Ba 6,41 ± 0,07 Ba <td height="38" rowspan style = "2" = "hauteur: 38px; largeur: 77px;"> Extrait de l'eau chaude C 13% Atom 4,59 ± 0,04 Aa 3,35 ± 0,06 Bb 2,79 ± 0,06 Cb 2,37 ± 0,03 Dc 15 N% Atom 6,69 ± 0,03 Aa 6,43 ± 0,01 Bb 5,89 ± 0,07 Db 6,16 ± 0,05 Cb Résidus de l'eau chaude C 13% Atom 4,37 ± 0,06 Ab 4,1 ± 0,03 Ba 3,79 ± 0,10 Ca 3,66 ± 0,05 Ca 15 N% Atom 6,57 ± 0,04 Ba 6,71 ± 0,02 Aa 6,45 ± 0,02 Ca 6,44 ± 0,03 Ca Tableau 1. <strong> Composition isotopique et de la chimie de la litière et la litière pour uniforme différemment marqué. Journées de l'étiquetage différentiel extérieur de la chambre sont entre parenthèses. Les comparaisons entre les jours de constitution sont en majuscules (à travers les lignes) et entre les fractions de litière sont en lettres minuscules (bas colonnes) pour chaque variable.

Discussion

Cette conception d'une chambre de marquage isotopique continu a été utilisé pour produire uniformément et de façon différentielle 13 C et 15 N étiqueté A. gerardii pour le champ suivant et des expériences de laboratoire. Au cours de trois saisons de croissance de fonctionnement, la chambre a réussi à maintenir la température, l'humidité, et concentrations de CO 2 dans les paramètres de réglage (Figure 2). La fiabilité du système de contrôle de la température est essentielle pendant le pic de l'été, lorsque le rayonnement solaire élevé peut provoquer une surchauffe dans la chambre étanche à l'air. L'élimination de l'excès d'humidité causée par la transpiration des plantes qui poussent en sorte que les stomates de la plante reste ouvert pour l'absorption photosynthétique 22 et que la condensation de l'eau n'empêche pas la pénétration de lumière ou d'endommager la structure de la chambre.

La surveillance continue de près la concentration de CO 2 par le logiciel IRGA maintenu continu13 C étiquetage des plantes alors qu'ils ont grandi dans la chambre. En raison de la forte activité photosynthétique de A. gerardii de plus en plus dans cette chambre, le CO 2 est injecté dans le système fréquemment pendant les heures de jour de la saison de croissance, lorsque l'activité photosynthétique tirait concentrations de CO 2 jusqu'à 360 ppm, environ toutes les 15-20 minutes. Le dosage de l'enrichi et de l'abondance naturelle de 13 C-CO 2 réservoirs autorisées pour un 4,4 atome% à atmosphère contrôlée 13 de C à travers la période de croissance pour le marquage de tissus végétaux uniforme. 13C-production de CO 2 peut également être obtenue par mélange de 13 C-sodium bicarbonate ou carbonate 13 C-sodium et de l'acide chlorhydrique, mais ce type de système est plus complexe et nécessite plus de surveillance et de maintenance, nous vous recommandons d'utiliser 13 C-CO 2 gaz. Une considération importante pour le suivi de CO 2 concentrations utilisant un IRGA est que les analyseurs infrarouges perdent deux tiers de leur sensibilité lors de la mesure du 13 C-CO 2. Cette sous-estimation d'environ 2,9% ppm pour notre mélange 4,4% 13 C-CO 2 n'était pas une grande préoccupation pour nous, mais pourrait devenir un problème plus important lors de l'étiquetage à des niveaux plus élevés 27 13 C.

A. gerardii est une saison chaude herbes hautes vivaces graminées de prairie espèces. La conception de cette chambre a été optimisé pour A. production gerardii (Figure 1). La taille et la hauteur de la chambre ont été choisis en tenant compte de la productivité de la hauteur maximale de A. gerardii dans le domaine, ainsi que pour la production de biomasse de la plante désirée pour les expériences ultérieures. A. gerardii est connu pour être la lumière limitée dans le domaine de 24,25. PAR dans une serre peut être diminuée par 30-47% par rapport aux niveaux extérieurs 26. Depuis notre usines ont été cultivées dans une chambre de verre acrylique intérieur d'une serre, limitation PAR est une préoccupation. Lorsqu'elle est activée, les lampes fluorescentes ont augmenté PAR intérieur de la chambre de 9,5%, ce qui peut avoir contribué à accroître la productivité dans cette lumière espèces sensibles. Lorsque vous utilisez cette conception de la chambre à cultiver d'autres types de plantes besoins physiologiques spécifiques tels que la taille, l'éclairage, les exigences en éléments nutritifs, sensibilité à la température, et l'humidité du sol doit être soigneusement adaptée pour maintenir des conditions de croissance optimales pour les plantes.

Lorsque l'on travaille avec des composés marqués par des isotopes coûteuses, telles que 10% d'atomes de 13 C-CO 2 et 98% en atomes 15 N-KNO 3, l'efficacité de marquage est une considération importante. Cette conception de la chambre 13 optimise l'étiquetage de C en faisant tous les efforts pour sceller la chambre et limiter les fuites d'air dans et hors de la chambre. Si cette chambre est jamais ouvert pendant la saison de croissance, alors aucun de l'étiquette de 13 Ced CO 2 à partir de la chambre est filtré dans l'atmosphère. Le CO 2 augmente pendant la respiration la nuit ne semble pas endommager les plantes en croissance et est rapidement repris après le lever du soleil (figure 2). Au cours de l'étiquetage différentiel, la chambre a été brièvement ouvert pour retirer les pots marqués de manière différente, mais cela ne semble pas diluer la cible de 4,4% en atomes de marquage 13 C des plantes en continu étiquetés (Tableau 1). 13 étiquetage C a également été optimisée en frottant sur ​​la l'air atmosphérique initiale piégé dans la chambre lors de l'étanchéité. Au cours des essais préliminaires sur la chambre sans un gommage initiale du CO 2 atmosphérique, les plantes ont été mesurés à un niveau de 13 C dilué dans les premières feuilles produites que dans les feuilles plus tard produites. Le gommage initiale de CO 2 dans l'atmosphère lors de la fermeture de la chambre semble éliminer ce problème en permettant à l'étiquetage continu de 13 C à partir desemis à la maturité. Le maintien d'un mélange d'enrobage hors-sol de sable, la vermiculite, l'argile et élimine également le CO 2 abondance naturelle de la contamination à partir de la respiration du sol. L'élimination du sol du système ne nécessite considérations de fertilisation et d'inoculation prudents, ce qui peut être unique pour différentes espèces de plantes. 15 N étiquetage à travers le 7 atome% 15 solution ciblée de N Hoegland produit matériel végétal très marquée à 6,7% d'atomes 15 N (tableau 1). Une légère dilution de l'étiquette de 15 N ciblée peut être causée par une abondance naturelle N dans le terreau ou de l'inoculation du sol natal.

Au cours de la biosynthèse de composés, la discrimination naturel de 13 C (ou 15 N) se produit à la suite d'un fractionnement cinétique et la distribution de l'isotope non statistique dans les composés synthétisés. Ainsi, dans le cas de C, les produits secondaires (par exemple les lipides, des composés phénoliques) sont généralement épuisées en 13 C par rapport aux produits primaires (hydrates de carbone). Cette discrimination naturel 13 C semble persister même lorsque les plantes sont cultivées dans une atmosphère enrichie en 13 C, comme on peut le voir dans la légère différence en% d'atomes de 13 C des extraits à l'eau chaude et les résidus de l'eau chaude des plantes uniformément marqués (tableau 1 ). Ce fractionnement cinétique naturelle est très faible par rapport à l'enrichissement et ne compromet pas l'uniformité de l'étiquetage.

Étiquetage différencié des tissus structurels et métaboliques végétales est une nouvelle technique avec un potentiel pour des études supérieures en décomposition de la litière, l'écologie microbienne et formation du sol en matière organique. La différence de 13 C et 15 N des extraits à l'eau chaude et les résidus d'eau chaude indique une dilution importante de 13 C et 15 N dans le lixiviable, faiblecomposés de poids moléculaire (extraits de l'eau chaude) à partir de la matière végétale structurale (résidus d'eau chaude) après 7, 14 et 22 jours de marquage différentiel (P <0,005). Cet étiquetage différentiel des tissus végétaux peut être utilisé pour suivre le sort des composants structuraux et métaboliques séparément dans un écosystème. L'étiquetage différentiel 13 C était plus extrême que 15 N étiquetage différentiel. Cela peut être dû à l'immédiateté de 13 C dilution lors de l'enlèvement des plantes dans l'atmosphère 13 C-CO 2 marqué, alors que l'étiquette 15 N reste dans le terreau pendant un certain temps et 15 N dilution se fait plus lentement. Pour plus d'étiquetage différentiel drastique de 15 N, on peut considérer le rinçage des pots avec de l'eau avant de l'abondance naturelle fécondation au cours des dernières semaines de croissance en dehors de la chambre.

La conception et le fonctionnement de ce continu 13 </ Sup> C et 15 N système d'étiquetage pour uniforme ou différentiel, métabolique et structurale, l'étiquetage des tissus de la plante fournit une nouvelle méthode de production de matériel végétal marquage isotopique pour la recherche avancée. La conception et les détails opérationnels de cette chambre ont été choisis pour 4,4% d'atomes 13 C et 7% d'atomes 15 N étiquetage des A. gerardii, mais peut être adapté à d'autres types de plantes et les niveaux d'étiquetage des isotopes. Les conditions de croissance décrites ici doivent être adaptées pour répondre aux exigences de taille, température, humidité, lumière, eau et nutriments des espèces végétales d'intérêt particulier. Le marquage avec 18 O 2 ou H peut également être obtenue par marquage de l'eau utilisée dans le système d'irrigation. Le système décrit ici aborde un grand nombre des défis de l'uniforme et différentiel 13 C étiquetage du matériel végétal. Cette conception de base de chambre peut être utilisé par d'autres groupes de recherche à produire du matériel végétal très marqué pour les advétudes en biochimie des écosystèmes équilibrée.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Un merci spécial à la facilité de la croissance des plantes et des installations d'analyse EcoCore à l'Université d'État du Colorado et aux nombreux étudiants et professeurs qui ont contribué à ce projet. Ce travail est financé par la NSF DEB subvention # 0918482, bourse besoins USDA National, et le fonds Cotrufo-Hoppess pour la recherche sur l'écologie du sol.

Materials

40 in Remote Tower Fan Living Accents FS10-S3R-A
42 in Electric Tower Fan with remote control LASKO 2559
Mr. Slim Split-type air conditioner Mitsubishi Electric R410A
Electronic 24 hr time switches Intermatic ET100C Operates Fluorescent Light System
iSeries Humidity and Temp Controller Omega CHiTH-i8DV33-5-El
Solid State Relay Omega SSRL240
CKR Series Solid State Relay Crydon
Solenoid Coils Dayton 6X543
GasHound CO2 Analyzer LI-COR LI-800
Dehumidifier Dayton 1DGX4
Specialty gas regulator Airgas CGA 580
T5 Hight Output Commercial Fluorescent Light System Hydro Farm FLT48
Air pump Thermo Scientific 420-1901
Masterflex Cartridge Pump HeadSystem Cole Parmer 7553-70
1900 Series Network Switch Catalyst
Profile Porus Ceramic Top Dressing Greens Grade
Industrial Quartz 40 mesh Unimin 4095
Mycorrhizae Professional Growing Medium ProMix
Vermiculite and Perlite Thermo-Ran C633
Potassium Nitrate- 15N 98 atom % Sigma-Aldrich 335134
Carbon-13C Dioxide 10 atom % Sigma-Aldrich 600180
Medical grade CO2 Airgas
Regulator Airgas  CGA 350
4 in box fans Grainger
Masterflex PharMed BPT Tubing Cole Parmer HV-06508-24
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Soong, J. L., Reuss, D., Pinney, C., Boyack, T., Haddix, M. L., Stewart, C. E., Cotrufo, M. F. Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling. J. Vis. Exp. (83), e51117, doi:10.3791/51117 (2014).
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