JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

Opzet en werking van een continue<sup> 13</sup> C<sup> 15</sup> N Labeling Kamer voor Uniform of Differentieel, Metabole en structurele, Plant isotooplabelen

Published: January 16, 2014
doi:
10.3791/51117
, , , , , ,
1Natural Resource Ecology Laboratory,Colorado State University, 2Soil Plant Nutrient REsearch,USDA-ARS, 3Department of Soil and Crop Sciences,Colorado State University

Summary

Deze methode wordt uitgelegd hoe op te bouwen en exploiteren van een continue 13 C en 15 N isotooplabelen kamer voor uniforme of differentiële plantenweefsel etikettering. Representatieve resultaten van metabole en structurele kenmerken van Andropogon gerardii worden besproken.

Abstract

Tracing zeldzame stabiele isotopen uit plantaardig materiaal door het ecosysteem biedt de meest gevoelige informatie over het ecosysteem processen; van CO 2 stromen en vorming organische stof in de bodem om kleinschalige stabiele isotoop biomarker sonderen. Koppeling meerdere stabiele isotopen zoals 13C met 15 N, 18 O of 2 H heeft het potentieel om nog meer informatie over complexe stoichiometrische verhoudingen in biochemische transformaties onthullen. Isotoop gemerkte plantmateriaal is gebruikt in diverse onderzoeken van afbraak van afval en de vorming van organisch bodemmateriaal 1-4. Uit deze en andere studies is het echter duidelijk geworden dat de structurele bestanddelen van plantaardige materiaal anders dan metabole bestanddelen (dwz. Uitloogbare laag molecuulgewicht) in termen van microbiële benutting en langdurige koolstofopslag 5-7 gedragen. Het vermogen om structurele en metabolische componenten bestuderenafzonderlijk biedt een krachtige nieuwe tool voor het bevorderen van de voorhoede van het ecosysteem biogeochemische studies. Hier beschrijven we een werkwijze voor 13C en 15N gemerkte plantmateriaal dat ofwel uniform gelabelde gehele plant of verschillend gemerkte structurele en metabolische installatiedelen.

Hier presenteren we de bouw en exploitatie van een continu 13 C en 15 N etikettering kamer die kan worden aangepast aan verschillende onderzoeksprojecten behoeften te voldoen. Gelijkmatig gemerkte plantenmateriaal wordt geproduceerd door continue etikettering van zaailing tot oogst, terwijl differentiële labeling wordt bereikt door het verwijderen van de groeiende planten uit de kamer weken voor de oogst. Representatieve resultaten van de groeiende Andropogon gerardii Kaw aantonen vermogen van het systeem om efficiënt label plantaardig materiaal op de beoogde niveaus. Door deze werkwijze hebben wij plantaardig materiaal geproduceerd met een 4,4 atoom% 13 C en 6,7 atoom% 15 </ Sup> N uniforme planten label, of materiaal dat verschillend wordt gemerkt door tot 1.29 atoom% 13 C en 0,56 atoom% 15 N in de metabole en structurele componenten (warm water extraheerbare en warm water restcomponenten, respectievelijk). Uitdagingen liggen in het handhaven van de juiste temperatuur, luchtvochtigheid, CO 2-concentratie, en het lichtniveau in een luchtdichte 13 C-CO 2 atmosfeer voor een succesvolle teelt van gewassen. Deze kamer beschrijving vormt een nuttige research tool om effectief te produceren uniform of verschillend multi-isotoop gemerkte plantaardig materiaal voor gebruik in proeven op ecosysteem biogeochemische cycli.

Introduction

Inzicht in de dynamiek van plant-bodem-atmosfeer processen is van cruciaal belang voor het nauwkeurig voorspellen hoe de globale koolstof (C) en stikstof (N) cycli functie onder de huidige en toekomstige milieu-omstandigheden. Stabiele isotopen zijn krachtige hulpmiddelen in kwantitatieve studies van plant-bodem-atmosfeer C en N fietsen. Tracing zeldzame stabiele isotopen uit plantaardig materiaal door het ecosysteem levert gevoelige informatie in studies van biogeochemische cycli, van CO 2 stromen en bodemvorming organisch materiaal om kleinschalige stabiele isotopen-biomarker indringende bv. 4,8,9. De combinatie van 13C labeling met 15 N etikettering, of andere stabiele isotopen zoals 2 H of 18 O in plantenweefsel biedt een high-detectie, traceerbaar, maar complexe substraat voor gebruik in gekoppelde studies van planten en de bodem biochemie. De mogelijkheid om uniform of differentieel labelen structurele en metabolische plantmateriaal advertentieds verdere vermogen om complexe vragen over C en N fietsen door ecosystemen te pakken. Het voordeel van isotoop gemerkte plantenmateriaal kwantitatieve studies van C en N boekhouding, echter afhankelijk van het vermogen 13C en 15N gelabeld materiaal dat ofwel uniform of verschillend gemerkte produceren.

Isotooplabelen is gebruikt in studies over planten C en N assimilatie 10, allocatie 11 en rhizodeposition 12. Gelijkmatig 13C en 15N gelabelde plantaardig materiaal zorgt voor een complexe gemerkt substraat voor studies van strooiselafbraak 1,4, vorming organische stof in de bodem 2,6, bodem CO 2-uitstoot 4, bodemvoedselweb bestudeert 13, en studies van de bodem C verblijftijden 2,14. Studies met behulp van 13 C-gelabeld biochar van gelabelde plantmateriaal beginnen ook nieuwe informatie over vroeger over het hoofd gezien te onthullenbodem char zwembaden 15. Terwijl 15 N, 2 H en 18 O etikettering zijn relatief gemakkelijk door water en kunstmest behandeling te bereiken, de uitdaging bestaat in het produceren uniform 13C gelabelde plantaardig materiaal tot en met 13 C-CO 2 fixatie.

Continu isotooplabelen van zaailing tot volwassenheid in een afgesloten kamer produceert uniforme isotooplabelen de gehele plant. Andere methoden zoals herhaalde puls labeling 16 en bladtoepassing of wicking 17,18 produceren niet uniform isotoop gemerkte plantmateriaal, noch duidelijke verschil etikettering van specifieke C-verbindingen (bv. metabolische versus structureel) 19. Een belangrijke overweging bij isotopen wordt labelingsefficiëntie, vanwege de hoge kosten van zeldzame isotoop verrijkte verbindingen die voor levensmiddelen. Hoewel continue 13C etikettering in het verleden 2-4,20, er geen kenniseen gepubliceerde gedetailleerde technische beschrijving van een continue labeling kamer met tekenen van hoge labelingsefficiëntie en nauwkeurige controle van de hoeveelheid en uniformiteit van isotopen.

Op de voorgrond van de afbraak van afval en bodemvorming organische stof onderzoek is het concept dat metabole plantaardig materiaal (dwz uitloogbare, labiele, verbindingen met laag molecuulgewicht) en structurele plantmateriaal (dwz. Lignine, cellulose, hemicellulose) verschillend in termen van microbiële verwerkt efficiëntie bij het ​​eindgebruik, vorming organische stof in de bodem, en de lange termijn bodem C opslag 5-7. Plantmateriaal dat differentieel is geëtiketteerd zijn structurele en metabolische componenten, dus een nuttig instrument in het bevorderen afbraak van afval en bodemvorming organisch materiaal onderzoek. Differentiële labeling met dual isotopen maakt voor de opsporing van structurele en metabole componenten afzonderlijk via het ecosysteem via een verdeelstekker zwembad isotoop technique 21.

Continu isotoop labeling met 13 C en andere isotopen in een afgesloten kamer vereist een zorgvuldige aandacht voor fysiologische omstandigheden planten om productiviteit van de vegetatie en isotooplabelen efficiëntie te maximaliseren. Dagtemperatuur spikes moeten worden gecontroleerd om te planten schade bij het kweken in een luchtdichte kamer te voorkomen. Een optimaal bereik van vochtigheid en temperatuur moeten openblijven planten huidmondjes en de CO 2-opname 22 te handhaven. Hoge luchtvochtigheid oorzaak beslaan van de wanden, die de beschikbaarheid van licht minimaliseert en kan de kamer structuur beschadigen. Zorgvuldige afweging om labelingsefficiëntie isotoop door het elimineren van natuurlijke overvloed isotopen uit de kamer (bijvoorbeeld afkomstig uit het oppotten met bodem organische stof) en het voorkomen van blootstelling aan de buitenlucht is van belang bij het ​​werken met dure zwaar isotoop gemerkte verbindingen.

Hier presenteren we een methode voor het bouwen en exploiteren van eencontinue dubbele 13C en 15N isotopen kamer voor de productie van plantaardige materiaal dat ofwel uniform gemerkt of heeft een structurele en metabolische componenten gelabeld op verschillende niveaus. is 13 C etiket gecontroleerd op de kamer niveau, terwijl bemesting en 15 N etikettering gecontroleerd op de individuele pot niveau. Representatieve resultaten zijn het vermogen van deze methode om de temperatuur, vochtigheid en CO2-concentratie gedurende het groeiseizoen controle tonen. Resultaten van groeiende Andropogon gerardii, Kaw ook het vermogen van deze methode om uniform of verschillend gemerkte plantmateriaal te produceren tonen. De beschreven specifieke kamer-ontwerp en werking regeling kan worden aangepast aan verschillende plantensoorten groeien, evenals 2 18 H of O etikettering tegemoet.

Protocol

1. Kamer Bouw Construeer de etikettering kamer in een kas te zorgen voor een maximale lichtinval potentieel voor de groei van planten. Zorg ervoor dat er voldoende voeding is beschikbaar voor alle kameronderdelen macht. Construeer de etikettering kamer door montage 3,175 mm dik transparant acryl muren (polycarbonaat zou ook geschikt zijn) en een 6,35 mm dik transparant acryl plafond op een aluminium frame met een wit geschilderde stalen vloer aan zonnereflectie maximaliseren. De afmetingen van de kamer kan worden afgestemd op de individuele behoeften onderzoek. Monteer de kamer op ¾ in (19 mm) multiplex op sintelblokken. Boor gaten in het acrylglas, aluminium frame en stalen vloer en het gebruik schroeven om alle onderdelen samen vast. Dicht alle naden met siliconenkit om een ​​luchtdichte afdichting te verzekeren. Construeer een deur door de montage van een gedeelte van de acryl panelen op lange schroeven, die kan worden vastgeschroefd met behulp van removable vleugelmoeren. Verzegeling van de deur met tochtstrip aan de lucht lekkage te voorkomen. Selecteer een gebied direct grenzend aan de kamer als het controle centrum om alle temperatuur, luchtvochtigheid, CO 2-regelaars, en bewakingsapparatuur monteren. Boor voorzichtig kleine gaatjes in de kamerwand grenzend aan het controlecentrum voor alle elektrische draden en gas leidingen. Gebruik siliconenkit om de gaten rond alle kabels en leidingen af ​​te dichten aan de lucht lekkage te voorkomen. Test de kamer voor luchtlekken door deze te vullen met een hoog niveau van CO 2 (bijvoorbeeld 800 ppm) en laten zitten 's nachts. Indien de CO2-concentratie in de kamer wordt gehandhaafd op het oorspronkelijke niveau dan is het luchtdicht. Als de concentratie daalt 's nachts dan alle naden moeten worden onderzocht en opnieuw afgedicht met siliconenkit tot een luchtdichte afdichting wordt bereikt. Voor sommige planten die zijn aangepast aan hoge licht omstandigheden, toe te voegen verlichting aangesloten op een timer om de onmiddellijke buitenomgeving van de cHamber aan lichtinval en productiviteit van de vegetatie te verhogen. 2. Temperatuur en vochtigheid Controls Reguleren kamertemperatuur door het installeren van een commerciële split type airconditioner met de koeling (verdamper) spoelen zich in de kamer en de compressor en de condensor spoelen buiten de kas om de warmte af te voeren gevestigd. Zet de airconditioner op de gewenste temperatuur te handhaven. Gebruik een kleine kamer ontvochtiger om de luchtvochtigheid te beheersen in de kamer. Boor een drainage gat door de vloer van de kamer naast de ontvochtiger. Verwijder het condensaat verzamelaar uit de ontvochtiger, en sluit een afvoerslang van de ontvochtiger via de drainage gat in de vloer van de kamer. Onder de kamer, plaatst een open pot gevuld met water voor de ontvochtiger direct afwateren in. Dit zorgt voor een luchtdichte afsluiting, maar ook zorgen voor drukevenwicht. <li> Installeer een controller, zoals de Omega iSeries-controller, in het control center met een vochtsensor in de kamer. Sluit de controller aan op de luchtdrogingsinstallatie met een solid-state relais en stel de vochtigheid controller met een hoog alarm en swing om optimale groeiomstandigheden in de kamer te houden. Optimale temperatuur en vochtigheid zal verschillen voor verschillende plantensoorten. 3. CO 2 Controls De 13 C-CO 2 verrijking wordt bereikt met behulp van twee zuivere CO 2 gastanks, een van 10 atoom% 13 C-CO 2 of hoger en een van 1.1 atoom% 13 C-CO 2 (natuurlijke overvloed). Monitor de CO 2-concentratie door het hebben van een membraanpomp continu kamer lucht door een infrarood Gas Analyzer (Irga) en dan pomp de lucht terug in de kamer, dus een gesloten systeem (figuur 1) behoud. Seta laag alarm en dode band op de irgA software om de CO 2-concentraties in een gewenste bereik te houden. Hier gebruiken we een lage alarm van 360 ppm met een 40 ppm dode band om de CO 2 concentraties van 360-400 ppm te houden. Sluit een doseerventiel aan elke tank en zorgvuldig te passen aan de doelgroep 13 C verrijking niveau te bereiken. Zet de tank regelgevers om 20 psi. Plaats een magneetventiel tussen de doseerventiel en de regulator van elke tank. Word lid van de uitlaten van de twee maatkleppen elkaar en pijp ze in het midden van de kamer. Sluit een halfgeleiderrelais de irgA uitgang de magneetventielen (figuur 1) besturen. 4. Web-based Remote Monitoring System Monitor CO 2-concentraties van de irgA software door in te loggen naar een lokaal bestand elke 30 sec. Maak een aangepast programma (bijvoorbeeld in perl of een andere programmeertaal) te halenvermeldingen vanuit de lokale CO 2 logbestand, samen met de huidige laptop tijdstempel, en upload deze naar een back-end web applicatie. Stel de webapplicatie om de temperatuur en vochtigheid sensor data opvragen. Gebruik een monitoringsysteem om de status van de temperatuur in de kamer om de vijf minuten om potentiële temperatuur pieken die de planten zou vernietigen als de airconditioning niet te voorkomen controleren. Bewaken van de CO 2, temperatuur en vochtigheid op elke standaard web browser, zodat eventuele onverwachte temperatuur spikes of CO 2 druppels onmiddellijk kan worden bijgewoond. 5. Irrigatiesysteem Boor een klein gaatje in de muur van het acrylglas kamer per pot. Gebruik irrigatie slang aan een druppelirrigatie ring per pot te creëren en voeden de irrigatie slang door de kamer wand naar buiten. Dicht de gaten rond de irrigatie buis met siliconenkitlucht lekkage te voorkomen. Aan de buitenkant van de kamer, sluit de irrigatie slang aan op de buis voor een peristaltische pomp. Gebruik een kleine slangklem af te sluiten alle irrigatie slang aan luchtlekkage tussen water te voorkomen. 6. Potplanten Selecteer een potmaat geschikt is voor de planten worden geteeld. Hier, 40, 15 L potten gebruikt. Maak een bodem gratis potgrond door het mengen van zand, vermiculiet, en het profiel poreus keramisch. Test het waterhoudend vermogen van de potgrond door weging van een gevulde pot droog, weken de pot met water en zodat het helemaal uitlekken, en het wegen van de pot nat. Gebruik deze maximale watergehalte om ervoor te zorgen dat overtollige gelabelde kunstmest en water niet lekken uit de potten tijdens het water geven. Ontkiemen zaden in potgrond voorafgaand aan het planten ze in de potten. Dit zorgt ervoor dat alleen met succes ontkiemde zaden worden gestart in de etikettering kamer. Inoculeren t hij zaailingen met verse grond slurry gunstige microben te introduceren. Zodra de zaden ontkiemd, zorgvuldig zaailingen te transplanteren om de potten in het gewenste nummer. Eenmaal ingemaakt, verplaatst u de potten in de kamer en monteren elke pot met een individuele irrigatie slang. 7. Het afdichten van de Kamer Wanneer de deur eerste afdichtelement aan de kamer een grote massa van buitenlucht vult de ovenkamer. Scrub uit deze externe CO 2 door het aansluiten van een ademkalk scrubber om de luchtpomp om de CO 2-concentratie schrobben tot minstens 200-250 ppm voor het vullen van de kamer terug naar 400 ppm met behulp van de 13 C-CO 2 tank mengsel. Proberen te houden de kamer gesloten door de duur van het groeiseizoen om natuurlijke overvloed CO 2 besmetting te minimaliseren. Monitor plantengroei visueel en pas bemesting en irrigatie afhankelijk van de vraag. TITEL "> 8. Bemesting en irrigatie Gebruik een meststofoplossing, zoals een gemodificeerde Hoagland's oplossing 23 te bemesten door het irrigatiesysteem. Label de meststof met 15 N met behulp van een 15 N-KNO 3 subsolution bij de gerichte atoom% 15 N-niveau door het mengen van 98 atoom% 15 N-KNO 3 met natuurlijke overvloed 15 N-KNO 3 (0,37 atoom% 15 N). Meng genoeg van de meststofoplossing bij elke fertilisatiegebeurtenis de gehele kamer, op basis van het waterhoudend vermogen van de potgrond. Plaats de juiste hoeveelheid meststof voor een pot in een glazen pot, en bereiden zoals vele potjes er potten. Span de irrigatie slangen en leg elk van hen in een pot met de meststof oplossing, en dan sluit ze aan op de peristaltische pomp. Waterplanten door het pompen van water door de peristaltische pomp door de individuele infuus irriting slangen regelmatig de planten nodig hebben. Bemesting met Hoagland's oplossing zou de vraag plant of experimenteel ontwerp te volgen, met een toenemende vraag naar voedingsstoffen als de productiviteit van de vegetatie toeneemt om de productiviteit te maximaliseren. Eerste, pomp de Hoagland's oplossing door de irrigatie slang, dan pomp een spoeling met water tot algen en bacteriegroei in de buizen te minimaliseren. Span alle slangen na bemesting en irrigatie naar kamer luchtlekken te elimineren. 9. Uniform en Differential Labeling Voor differentiële etikettering van structurele en metabole onderdelen, verwijderen planten uit etikettering kamer 1-3 weken voorafgaand aan de oogst. Planten die uniform worden geëtiketteerd kan continu in de verzegelde etikettering kamer blijven tot de oogst en geïrrigeerd met 15 N-Hoagland's oplossing. Bewaar de verwijderde planten in de kas gedurende deze tijd, zodat ze voldoende licht krijgenen CO 2 op natuurlijke overvloed 13 C. Voor differentiële 15 N etikettering, blijven bemesten en irrigeren de planten zoals gewoonlijk, maar maken gebruik van natuurlijke overvloed 15 N-KNO 3 in de Hoagland's meststof oplossing. 10. Oogst Stop planten water geven 1 week voorafgaand aan de oogst dus planten beginnen te senesce en oppotten medium uitdroogt. Open de kamer en zet de potten uit voor onmiddellijke knippen en oogsten van de bovengrondse biomassa Giet de potgrond en wortels over een grove zeef. Gebruik het scherm te scheiden van de wortels van de potgrond en schud de wortels vrij van potgrond. Leg de wortels op een 2 mm zeef en spoel ze af met water om alle resterende potgrond materiaal te verwijderen. Gebruik een pincet om eventuele vermiculiet die kunnen vastklampen aan de wortels te verwijderen. Laat wortels aan de lucht drogen in de voorbereiding op toekomstige experimenten. <p class = "jove_title"> 11. Nest Chemie Weeg de lucht drogen plantmateriaal etikettering kamer biomassa te bepalen. Maal een subgroep voor chemische analyse. Breng 2,0 g ovengedroogde (60 ° C) in een nest 125 ml zuur gespoelde kolf en voeg 50 ml gedeïoniseerd water. Plaats het monster op een voorverwarmde (60 ° C) roerder plaat en plaats een roerstaaf in de kolf. Zet het roeren 200 tpm en laat het monster gedurende 30 minuten verwarmen. Na 30 min. Filtreer het nest oplossing door een 20 urn nylon gaas op een vacuüm filtratie. Breng het extract aan een vooraf gewogen zuur gewassen buis en bevriezen. Breng het vaste residu nest een vooraf gewogen aluminium pan en droog bij 60 ° C. Weeg pan en strooisel na het drogen aan warm water residu massa te bepalen. Freeze droog het warm water extract en weeg tot het extract in warm water massa te bepalen. Analyseer de oven gedroogd (60 ° C) nest, gevriesdroogd warm waterextract, en in de oven gedroogd warm water residu in een Elemental Analyzer – isotoop ratio massaspectrometer (EA-IRMS).

Representative Results

Onze etikettering kamer is 1,2 mx 2,4 mx 3,6 m groot en houdt 40,15 L potten (figuur 1). De geautomatiseerde irgA controlesysteem onderhouden CO 2-concentraties tussen onze ingestelde waarden van 360 en 400 ppm tijdens de fotosynthetisch actieve periode van de dag (Figuur 2a). De lage CO 2-alarm functie op de irgA getriggerd magneetventielen om CO 2 uit de 13 C verrijkt en natuurlijke overvloed tanks in de kamer wanneer de concentratie gedaald tot onder het minimum (bv. 360 ppm). De dode band functie stopte de stroom wanneer de concentratie bereikt het bovenste instelpunt (bijv. 400 ppm). De iSeries temperatuur en vochtigheid monitoring systeem aangesloten op de airconditioner en ontvochtiger gehouden klimatologische omstandigheden binnen de ingestelde parameters gedurende het groeiseizoen (Figuur 2b). We gebruikten een ton (3,5 kW) airconditioning unit te keep de kamer koel. De remote monitoring-systeem mag de geregistreerde gegevens op elk gewenst moment worden bekeken door een standaard web browser. De CO 2-concentraties, temperatuur en vochtigheid waarden werden naar beneden bemonsterd door de webapplicatie om grafieken weer te geven van de afgelopen 24-240 uur, in stappen van 24 uur. Dit zorgde voor een snelle visuele om te bevestigen dat de dagelijkse schommelingen waren binnen de verwachte grenzen. Bekijk de webinterface toonde ook de huidige kamer status en ontvangen signaleringen potentiële problemen zoals ontvangt recente gegevens. Op elk moment van de volledige dataset ook kan worden gedownload van de web-interface. We meten fotosynthetisch actieve straling (PAR) in de onmiddellijke binnen-en buitenkant van de kamer op vier punten met en zonder de lichten aan in het midden van de zomer en het midden van de dag met behulp van een kwantum sensor. De PAR in de kamer was 31,5% lager dan de buitenkant wanneer de kamer lichten wwondermooi uit en 22% lager dan de buitenkant als de lichten waren. Aldus de kamerlichten helpen om aanzienlijke verhoging PAR penetratie binnen de kamer met 9,5% (P <0,05). Onze continue labeling systeem was in staat om 2.759 g A. produceren gerardii biomassa, 37% daarvan was bovengrondse biomassa en 63% van die ondergrondse biomassa. We behaalden een 4,4% op atomaire 13C hele plant label in ons uniform plantmateriaal door de magneetventielen op de twee CO 2 tanks dienovereenkomstig (figuur 1, tabel 1). We bereikten een 6,7 atoom% 15 N hele plant label in ons uniform plantmateriaal door mengen 98 atoom% 15 N-KNO3 0,37 atoom% 15 N-KNO3 in de KNO3 subsolution van een gemodificeerde Hoagland's oplossing 23 (Tabel 1) . We drenkte de A. gerardii wekelijks met 750 ml totale vloeistof (water plus Hoagland's oplossing) gedurende het groeiseizoenzoon. We bemest met 200-500 ml 15 N gelabeld Hoagland's oplossing per week, afhankelijk van de productiviteit van planten. We gebruik het warme water extractie methode om te bepalen of er isotopische verschillen tussen de uniforme en verschillend gemerkte plantmateriaal. Voor de verschillend gemerkte planten, na de oogst hebben we verwijderd alle bladeren die helemaal dood waren en behandelde deze afzonderlijk als ze waren waarschijnlijk niet verschillend gemerkte. Wanneer we kijken naar 13 C gehalte, vier dagen opname significant verschillend van elkaar de hele plant en warm water verkregen, maar voor het warme water residu dag 14 en 22 waren niet significant verschillend van elkaar (tabel 1). Bij vergelijking van plantenweefsel fracties in elke dag, het warm water extract residu significant verschillend van elkaar vier dagen en 22 dagen de gehele plant extract, en residu waren significantly verschillend van elkaar (tabel 1). Voor de 15 N opname in plantaardige bestanddelen, waren er verschillen tussen de dagen van oprichting en plantenweefsel fracties. Voor de warm water extract alle vier de opneming dagen waren significant verschillend van elkaar 15 N, en de hele plant en warm water residu de kortere dagen statuten significant anders dan de langere tijd van opname (tabel 1). Het plantenweefsel fracties uniforme planten waren niet significant verschillend van elkaar 15 N, maar het hete water extract residu significant verschillend van elkaar 15 N voor de verschillend gemerkte nest. Alle isotopische waarden worden gerapporteerd volgens de atoomprocent (atoom%) notatie (vergelijking 1), hetgeen een nauwkeuriger notatie dan% te gebruiken hoge zwareisotoop verrijking 21. Bijvoorbeeld: (1) Voor deze studie, liepen we statistische analyses met behulp van SAS versie 9.2. We testten de verschillen tussen de kamer binnen en buiten licht niveaus met behulp van een gepaarde t-test. We testten de verschillen tussen de 13 C en 15 N etikettering van heetwaterextracten en warm water resten met behulp van one-way variantie analyse (ANOVA) in PROC ANOVA. We gebruikten Duncan's multiple range test voor meervoudige vergelijkingen analyse. Significantie werd op een P-niveau van 0,05 aanvaard. We gebruikten een Wilcoxon rank sum test om te testen of de data voldoet aan de uitgangspunten van de analyse. Figuur 1. Schematic diagram van de 40 pot capaciteit continue multi-isotoop labeling kamer van eye view van een vogel. Stippellijnen elektrische bedrading, terwijl volle lijnen stellen gas of water tubing. Klik hier voor grotere afbeelding. . Figuur 2 A) gemiddelde CO 2-concentratie (ppm) (+ / -. SE) over een periode van vierentwintig uur voor een heel groeiseizoen B) Gemiddelde temperatuur (º C), open cirkels, en vochtigheid (%), gesloten cirkels . (+ / – SE) over een periode van vierentwintig uur voor een heel groeiseizoen Klik hier om een grotere im bekijkenleeftijd. Uniform (0) Differential (7) Differential (14) Differential (22) Hele nest 13 C Atom% 4.46 ± 0.02 Aab 3,93 ± 0,05 Ba 3.64 ± 0.03 Ca 3.35 ± 0.06 Db 15 N Atom% 6.69 ± 0.07 Aa 6.72 ± 0.01 Aa 6,33 ± 0,06 Ba 6.41 ± 0.07 Ba <td height="38" rowspan = "2" style = "height: 38px; width: 77px;"> Hot Water Extract 13 C Atom% 4.59 ± 0.04 Aa 3.35 ± 0.06 Bb 2.79 ± 0.06 Cb 2.37 ± 0.03 Dc 15 N Atom% 6.69 ± 0.03 Aa 6.43 ± 0.01 Bb 5.89 ± 0.07 Db 6.16 ± 0.05 Cb Hot Water Residu 13 C Atom% 4.37 ± 0.06 Ab 4.1 ± 0.03 Ba 3.79 ± 0.10 Ca 3.66 ± 0.05 Ca 15 N Atom% 6.57 ± 0.04 Ba 6.71 ± 0.02 Aa 6.45 ± 0.02 Ca 6.44 ± 0.03 Ca Tabel 1. <strong> Isotoopsamenstelling en zwerfvuil chemie voor uniforme en verschillend gemerkte nest. Dagen van differentiële labeling buiten de kamer staan ​​tussen haakjes. Vergelijkingen tussen dag van oprichting zijn in hoofdletters (over rijen) en tussen strooisel fracties zijn in kleine letters (beneden kolommen) voor elke variabele.

Discussion

Dit ontwerp voor een continue isotooplabelen kamer werd gebruikt om uniform en differentieel produceren 13C en 15N gelabelde A. gerardii voor volgende veld en laboratoriumexperimenten. Gedurende drie groeiseizoenen van de werking, heeft de kamer met succes gehandhaafd temperatuur, vochtigheid en CO 2-concentraties binnen de ingestelde parameters (figuur 2). De betrouwbaarheid van de temperatuurregeling is cruciaal tijdens de piek van de zomer, wanneer hoge zonnestraling oververhitting in de luchtdichte kamer kan veroorzaken. Het wegwerken van overtollig vocht veroorzaakt door transpiratie van de groeiende planten zorgt ervoor dat planten huidmondjes open blijven voor fotosynthetische opname 22 en dat condensatie van water niet lichtinval belemmeren of schade aan de structuur van de kamer.

De bijna continue bewaking van de CO 2-concentratie door de irgA software continu onderhouden13 C etikettering van de planten, terwijl ze in de kamer groeiden. Door de hoge fotosynthetische activiteit van A. gerardii groeien in deze kamer, CO 2 werd geïnjecteerd in het systeem vaak overdag van de piek groeiseizoen wanneer fotosynthetische activiteit trok CO 2-concentraties beneden tot 360 ppm, ongeveer elke 15-20 minuten. De dosering van het verrijkte natuurlijke abundantie 13 C-CO 2 tanks toegestaan ​​voor een gecontroleerde 4,4 atoom% C 13 atmosfeer door het groeiseizoen uniforme plantenweefsel etikettering. 13C-CO 2 productie kan ook worden bereikt door het mengen van 13 C-natrium bicarbonaat of 13 C-natriumcarbonaat en zoutzuur, maar dit type systeem is ingewikkelder en vereist meer controle en onderhoud, dus we raden het gebruik van 13 C-CO 2 gas. Een belangrijke overweging voor de bewaking van de CO 2-concentrations met behulp van een Irga is dat infrarood analyzers verliest tweederde van hun gevoeligheid bij het ​​meten van 13 C-CO 2. Deze onderschatting van ongeveer 2,9% ppm voor onze 4.4% 13 C-CO 2 mengsel was niet van groot belang voor ons, maar kon een kwestie aan belang toenemen bij het ​​benoemen op hogere 13 C niveau 27.

A. gerardii is een warme seizoen eeuwigdurende tallgrassprairie graminoid soorten. Het ontwerp van deze kamer werd geoptimaliseerd voor A. gerardii productie (figuur 1). De grootte en hoogte van de kamer werden gekozen als tegenprestatie voor de maximale hoogte productiviteit van A. gerardii in het veld, evenals voor de gewenste plantaardige biomassa voor toekomstige experimenten. A. gerardii is bekend dat licht in het veld 24,25 beperkt zijn. PAR binnen een kas kan worden verminderd door 30-47% ten opzichte van de buitenkant niveau 26. Aangezien onze fabrieks werden gekweekt in een acryl glazen kamer binnen een serre, PAR beperking was een punt van zorg. Wanneer deze is ingeschakeld, de tl-verlichting vergroot PAR binnen de kamer met 9,5%, die kan hebben bijgedragen aan de productiviteit in dit licht gevoelige soorten te verhogen. Bij gebruik van deze kamer ontwerp op andere soorten planten specifieke fysiologische behoeften zoals grootte, verlichting, voedingsbehoefte, temperatuurgevoeligheid en bodemvocht groeien moeten zorgvuldig worden aangepast om optimale groeiomstandigheden voor de planten te handhaven.

Bij het ​​werken met dure isotopisch gemerkte verbindingen, zoals 10 atoom% 13 C-CO 2 en 98 atoom% 15 N-KNO3, efficiëntie van etikettering een belangrijke overweging. Deze kamer-ontwerp optimaliseert 13C labeling door alle inspanningen om de kamer te verzegelen en het minimaliseren van luchtlekken in en uit de kamer. Als deze kamer nooit tijdens het groeiseizoen wordt geopend, is geen van de 13 C-labeled CO 2 uit de kamer is uitgelekt aan de atmosfeer. De CO 2 op te bouwen tijdens nachtelijke ademhaling niet verschijnt op de groeiende planten beschadigen en wordt snel na zonsopgang (figuur 2) genomen. Tijdens differentiële labeling, werd de kamer kort geopend om de verschillend gemerkte potten te verwijderen, maar dit bleek niet de beoogde 4,4% op atomaire 13 C etikettering van de continu gelabelde planten (tabel 1) te verdunnen. 13C labeling werd ook geoptimaliseerd door schrobben uit de initiële atmosferische lucht in de kamer bij het afdichten. Tijdens voorproeven op de kamer zonder een eerste scrub van de atmosferische CO 2 werden planten gemeten om een verdunde 13 C-niveau in de eerste bladeren geproduceerd dan in de latere bladeren geproduceerd hebben. De eerste scrub van de atmosferische CO 2 na sluiting kamer lijkt dit probleem te elimineren door en maakt de continue 13 C-etikettering vanzaadje tot volwassenheid. Het handhaven van een bodem vrij potgrond mengsel van zand, vermiculiet, en klei elimineert ook natuurlijke overvloed CO 2 vervuiling uit de bodem ademhaling. De eliminatie van de bodem van het systeem vereist een zorgvuldige bemesting en inenting overwegingen, die uniek zijn voor verschillende plantensoorten kunnen zijn. 15 N etikettering door de beoogde 7 atoom% 15 N Hoegland's oplossing geproduceerd zeer gelabeld plantmateriaal op 6,7% op atomaire 15 N (Tabel 1). Een lichte verdunning van de beoogde 15 N merker kan worden veroorzaakt door een natuurlijke overvloed N in de potgrond of de geboortegrond inoculatie.

Tijdens biosynthese van verbindingen, natuurlijke discriminatie 13 C (of 15 N) optreedt als gevolg van kinetische fractionering en nonstatistical isotoop verdeling in de gesynthetiseerde verbindingen. Dus in het geval van C, secundaire producten (bijvoorbeeld lipiden, Fenolverbindingen) algemeen waaruit 13C vergeleken met primaire producten (koolhydraten). Deze natuurlijke discriminatie 13 C blijkt ook blijven bestaan ​​wanneer planten worden gekweekt in een 13 C verrijkte atmosfeer, zoals blijkt uit het geringe verschil in atoom% 13 C van het heetwaterextracten en warm water resten van het uniform gelabelde planten (Tabel 1 ). Deze natuurlijke kinetische fractionering is zeer klein in vergelijking met de verrijking en heeft de uniformiteit van de etikettering niet in gevaar brengen.

Differentiële etikettering van structurele en metabole plantenweefsel is een nieuwe techniek met potentieel voor hogere studies in afbraak van afval, microbiële ecologie en vorming aan organisch bodemmateriaal. Het verschil in 13 C en 15 N van het warm water extracten en warm water residuen wijst op een aanzienlijke verwatering van 13 C en 15 N in de uitloogbare, lagemolecuulgewicht (warm water uittreksels) van de structurele plantmateriaal (warm water residuen) na 7, 14, en 22 dagen van differentiële labeling (P <0,005). Dit verschil etikettering van plantaardige weefsels kunnen worden gebruikt om het lot van structurele en metabole componenten afzonderlijk bijhouden via een ecosysteem. De 13 C differentiële labeling was extremer dan 15 N differentiële labeling. Dit kan te wijten aan de nabijheid van 13C verdunning wanneer het verwijderen van de planten uit de 13 C-gelabeld CO 2 atmosfeer, terwijl de 15 N etiket blijft in de potgrond enige tijd 15 N verdunning optreedt langzamer. Voor meer drastische differentiële labeling van 15 N, kan men overwegen het spoelen van de potten met water voorafgaand aan de natuurlijke overvloed bemesting tijdens de laatste weken van de groei buiten de kamer.

De opzet en werking van deze continue 13 </ Sup> C en 15 N systeem voor de etikettering uniform of differentiële, metabole en structurele, plantenweefsel etikettering voorziet in een nieuwe werkwijze voor het produceren isotoopgelabelde plantmateriaal voor geavanceerd onderzoek. Het ontwerp en de operationele details van deze kamer is gekozen voor 4,4 atoom% 13 C en 7 atoom% 15 N etikettering van A. gerardii, maar kan worden aangepast aan andere vaste isotopen niveaus. De hier beschreven groeiomstandigheden moet worden afgestemd op de grootte, temperatuur, vochtigheid, licht, water en voedingsstoffen eisen van de bijzondere plantensoorten van interesse. Labeling met 18 O of 2 H kan ook worden bereikt door het merken van het water van het irrigatiesysteem. Het hier beschreven systeem behandelt veel van de uitdagingen van een uniforme en differentiële 13C etikettering van plantaardig materiaal. Deze fundamentele kamer-ontwerp kan worden gebruikt door andere onderzoeksgroepen tot zeer gelabeld plantmateriaal voor adv producerenwichtige studies in ecosysteem biogeochemie.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Speciale dank aan de Plant Groeifaciliteit en EcoCore analytische faciliteit in Colorado State University en de vele studenten en docenten die aan dit project geholpen. Dit werk wordt gefinancierd door de NSF DEB subsidie ​​# 0918482, USDA National Needs Fellowship, en de Cotrufo-Hoppess fonds voor bodemecologie onderzoek.

Materials

40 in Remote Tower Fan Living Accents FS10-S3R-A
42 in Electric Tower Fan with remote control LASKO 2559
Mr. Slim Split-type air conditioner Mitsubishi Electric R410A
Electronic 24 hr time switches Intermatic ET100C Operates Fluorescent Light System
iSeries Humidity and Temp Controller Omega CHiTH-i8DV33-5-El
Solid State Relay Omega SSRL240
CKR Series Solid State Relay Crydon
Solenoid Coils Dayton 6X543
GasHound CO2 Analyzer LI-COR LI-800
Dehumidifier Dayton 1DGX4
Specialty gas regulator Airgas CGA 580
T5 Hight Output Commercial Fluorescent Light System Hydro Farm FLT48
Air pump Thermo Scientific 420-1901
Masterflex Cartridge Pump HeadSystem Cole Parmer 7553-70
1900 Series Network Switch Catalyst
Profile Porus Ceramic Top Dressing Greens Grade
Industrial Quartz 40 mesh Unimin 4095
Mycorrhizae Professional Growing Medium ProMix
Vermiculite and Perlite Thermo-Ran C633
Potassium Nitrate- 15N 98 atom % Sigma-Aldrich 335134
Carbon-13C Dioxide 10 atom % Sigma-Aldrich 600180
Medical grade CO2 Airgas
Regulator Airgas  CGA 350
4 in box fans Grainger
Masterflex PharMed BPT Tubing Cole Parmer HV-06508-24
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bird, J. A., Torn, M. S. Fine roots vs. Needles: A comparison of (13)C and (15)N dynamics in a ponderosa pine forest soil. Biogeochemistry. 79, 361-382 (2006).
  2. Bird, J. A., van Kessel, C., Horwath, W. R. Stabilization of C-13-carbon and immobilization of N-15-nitrogen from rice straw in humic fractions. Soil Sci. Soc. Am. J. 67, 806-816 (2003).
  3. Denef, K., Six, J. Contributions of incorporated residue and living roots to aggregate-associated and microbial carbon in two soils with different clay mineralogy. Eur. J. Soil Sci. 57, 774-786 (2006).
  4. Rubino, M. Carbon input belowground is the major C flux contributing to leaf litter mass loss: Evidences from a C-13 labelled-leaf litter experiment. Soil Biol. Biochem. 42, 1009-1016 (2010).
  5. Cotrufo, M. F., Wallenstein, M. D., Boot, C. M., Denef, K., Paul, E. The Microbial Efficiency-Matrix Stabilization (MEMS) framework integrates plant litter decomposition with soil organic matter stabilization: do labile plant inputs form stable soil organic matter. Glob. Change Biol. 19, 988-995 (2013).
  6. Mambelli, S., Bird, J. A., Gleixner, G., Dawson, T. E., Torn, M. S. Relative contribution of foliar and fine root pine litter to the molecular composition of soil organic matter after in situ degradation. Org. Geochem. 42, 1099-1108 (2011).
  7. Prescott, C. E. Litter decomposition: what controls it and how can we alter it to sequester more carbon in forest soils. Biogeochemistry. 101, 133-149 (2010).
  8. Denef, K., Roobroeck, D., Wadu, M., Lootens, P., Boeckx, P. Microbial community composition and rhizodeposit-carbon assimilation in differently managed temperate grassland soils. Soil Biol. Biochem. 41, 144-153 (2009).
  9. Bird, J. A., Kleber, M., Torn, M. S. C-13 and N-15 stabilization dynamics in soil organic matter fractions during needle and fine root decomposition. Org. Geochem. 39, 465-477 (2008).
  10. Andresen, L. C., Jonasson, S., Strom, L., Michelsen, A. Uptake of pulse injected nitrogen by soil microbes and mycorrhizal and non-mycorrhizal plants in a species-diverse subarctic heath ecosystem. Plant Soil. 313, 283-295 (2008).
  11. Horwath, W. R., Pregitzer, K. S., Paul, E. A. C-14 Allocation in tree soil systems. Tree Physiol. 14, 1163-1176 (1994).
  12. Denef, K. Community shifts and carbon translocation within metabolically-active rhizosphere microorganisms in grasslands under elevated CO2. Biogeosciences. 4, 769-779 (2007).
  13. Pollierer, M. M., Langel, R., Korner, C., Maraun, M., Scheu, S. The underestimated importance of belowground carbon input for forest soil animal food webs. Ecol. Lett. 10, 729-736 (2007).
  14. Stewart, D. P. C., Metherell, A. K. Carbon (C-13) uptake and allocation in pasture plants following field pulse-labelling. Plant Soil. 210, 61-73 (1999).
  15. Santos, F., Torn, M. S., Bird, J. A. Biological degradation of pyrogenic organic matter in temperate forest soils. Soil Biol. Biochem. 51, 115-124 (2012).
  16. Bromand, S., Whalen, J. K., Janzen, H. H., Schjoerring, J. K., Ellert, B. H. A pulse-labelling method to generate 13C- enriched plant materials. Plant Soil. 235, 253-257 (2001).
  17. Putz, B. A simple method for in situ-labelling with 15N and 13C of grassland plant species by foliar brushing. Methods Ecol. Evol. 2, 326-332 (2011).
  18. Wichern, F., Mayer, J., Joergensen, R., Müller, T. Evaluation of the wick method for in situ &lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C and &lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N labelling of annual plants using sugar-urea mixtures. Plant Soil. 329, 105-115 (2010).
  19. Fahey, T. J. Transport of Carbon and Nitrogen Between Litter and Soil Organic Matter in a Northern Hardwood Forest. Ecosystems. 14, 326-340 (2011).
  20. Stewart, C. E., Paustian, K., Conant, R. T., Plante, A. F., Six, J. Soil carbon saturation: Evaluation and corroboration by long-term incubations. Soil Biol. Biochem. 40, 1741-1750 (2008).
  21. Fry, B. . Stable Isotope Ecology. , (2006).
  22. Nippert, J. B., Fay, P. A., Carlisle, J. D., Knapp, A. K., Smith, M. D. Ecophysiological responses of two dominant grasses to altered temperature and precipitation regimes. Acta Oecol. Int. J. Ecol. 35, 400-408 (2009).
  23. Hoagland, D. R. a. A., I, D. . The Water-Culture Method for Growing Plants without Soil. , (1950).
  24. Lett, M. S., Knapp, A. K. Consequences of shrub expansion in mesic grassland: Resource alterations and graminoid responses. J. Veg. Sci. 14, 487-496 (2003).
  25. Knapp, A. K., Seastedt, T. R. Detritus Aaccumulation limits productivity of tallgrass prairie. Bioscience. 36, 662-668 (1986).
  26. Ting, K. C., Giacomelli, G. A. Solar photosynthetically active radiation transmission through greenhouse glazings. Energy Agric. 6, 121-132 (1987).
  27. McDermitt, D. K., Welles, J. M., Eckles, R. D. Effects of Temperature, Pressure and Water Vapor on Gas Phase Infrared Absorption by CO2. , .

Tags

13C15NIsotope LabelingContinuous LabelingUniform LabelingDifferential LabelingPlant MaterialEcosystem ProcessesBiogeochemical TransformationsLitter DecompositionSoil Organic MatterStructural ComponentsMetabolic Components

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Soong, J. L., Reuss, D., Pinney, C., Boyack, T., Haddix, M. L., Stewart, C. E., Cotrufo, M. F. Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling. J. Vis. Exp. (83), e51117, doi:10.3791/51117 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image