גילוי של פתוגנים תאיים חדשים על ידי Amoebal Coculture וגישות Amoebal העשרה
Summary
coculture Amoebal היא מערכת תרבית תאים באמצעות אמבות חסיד לגדול באופן סלקטיבי פתוגנים תאיים מסוגלים להתנגד תאי phagocytic כגון אמבות ומקרופאגים. בכך הוא מהווה כלי מפתח כדי לגלות חומרים מזהמים חדשים. העשרת Amoebal מאפשרת גילוי של מיני amoebal החדשים ושל החיידקים תאיים הספציפיים שלהם.
Abstract
פתוגנים תאיים כגון legionella, mycobacteria ואורגניזמים כמו כלמידיה קשים לבודד מפני שהם לעתים קרובות לגדול בצורה גרועה או בכלל לא בתקשורת סלקטיבית המשמשים בדרך כלל כדי לטפח חיידקים. מסיבה זו, רבים של פתוגנים אלה התגלו רק לאחרונה או בעקבות התפרצויות חשובות. פתוגנים אלה קשורים לעתים קרובות עם אמבות, המשמשים כמארח תאים ומאפשרות את ההישרדות וצמיחה של החיידקים. בכוונתנו כאן כדי לספק הדגמה של שתי טכניקות המאפשרות בידוד ואפיון של פתוגנים תאיים הנמצאים בדגימות קליניות או סביבתיות: coculture amoebal והעשרת amoebal. coculture Amoebal מאפשר התאוששות של חיידקים תאיים על ידי inoculating המדגם נחקר על דשא amoebal שיכול להיות נגוע וlysed ידי החיידקים תאיים בהווה במדגם. העשרת Amoebal מאפשרת התאוששות של אמבות הווה במדגם קליני או סביבתי. ההוא יכול להוביל לגילוי של מיני amoebal חדשים, אלא גם של חיידקים תוך תאי חדשים צומחים במיוחד באמבות אלה. יחד, שתי טכניקות אלה לעזור לגלות חיידקים תאיים חדשים מסוגלים לגדול באמבות. בגלל היכולת שלהם להדביק אמבות ולהתנגד phagocytosis, חיידקים תאיים אלה עשויים גם לברוח phagocytosis ידי מקרופאגים וכך, להיות פתוגניים לאאוקריוטים גבוהים יותר.
Introduction
לפני הופעתו של אבחון מולקולרי, מיקרואורגניזמים הנמצאים בנישות סביבתיות או בדגימות קליניות לעתים קרובות זוהו על ידי טיפוחם בתקשורת סלקטיבית שונה, בעיקר על אגר בצלחות פטרי. הפנוטיפ של מושבות חיידקים והפעילות המטבולית שלהם ולאחר מכן אפשר סיווג חיידקים ברמת מין. גם מרק יכול לשמש כדי להגדיל את הרגישות של זיהוי. עם זאת, שתי הטכניקות לא מאפשרות ההתאוששות של חיידקים שגדלים לאט או בכלל לא בתקשורת אלה. זו הסיבה מדוע גישות מולקולריות משמשות כל כך נרחבת בימינו. עם זאת, זיהוי של ה-DNA מספק אין מושג על יכולת הקיום של החיידקים. יתר על כן, לעומת זאת לתרבות, גישות מולקולריות לא לגרום למתח שיכול להיות מאופיין נוסף.
לומדים פתוגנים שגדלים בצורה גרועה על תקשורת מוצקה או שתאי הצורך לגדול הוא מסובך. רוב אלה "קשים לגדול" חיידקים הם סופית אניניםחיידקי acellular, לעתים קרובות גילו ואפיין הבא התפרצויות גדולות כפי שהיה במקרה של pneumophila הלגיונלה. חיידק זה התאפיין בעקבות התפרצות שהתרחשה במהלך כינוס של לגיון האמריקאי. רבים ככל 182 אנשים נדבקו ו29 מתו עקב 1,2 דלקת ריאות חמור. מאוחר יותר הראה כי אמבות היו המארחים הטבעיים של חיידק זה, וכי נוכחותם ברשתות מערכת מיזוג אוויר במלון ומים הייתה במקורו של פרוץ מחלת הלגיונרים שנקרא 3.
האמבות נמצאות ברחבי העולם והיו מבודדות מהקרקע, אוויר, מים ורירית האף של מתנדבים אנושיים (הנסקרת ב 4). אמבות "חיים ללא" אלה הן בדרך כלל החלוקה באופן עצמאי בסביבה, אך ייתכן שמדי פעם לפלוש מארחים מתירנית 5. הזנת אמבות במיקרואורגניזמים שונים באמצעות phagocytosis ועיכול lysosomal לאחר מכן על ידי הי"דdrolases 6. חיידקים תאיים פקולטטיביים או לחייב רבים מסוגלים להתנגד לעיכול ובכך להדביק ולחלק באמבות כמו למשל חיידקים או mycobacteria קשורות כלמידיה הלגיונלה, (הנסקרת ב 7 ו -8). אמבות חיים נטולי סיכוי לייצג את המאגר פוטנציאלי חשוב עבור חיידקים תאיים שעדיין לא התגלו. זה הוביל את הקבוצה שלנו ליישם בלוזאן שתי טכניקות עיקריות, הנקראות coculture amoebal והעשרת amoebal, שאפשרו לקבוצות שונות כדי לבודד כמה מיקרואורגניזמים תאיים לחייב חדשים מדגימות סביבתיות שונות 9-15.
מאז אמבות הן phagocytes המקצועי מרעה על חיידקים, חיידק מסוגל להתנגד phagocytosis ולגדול בתוך הפרוטיסטים אלה עשויים גם ליישב phagocytes אדם ולהיות פתוגניים כלפי בני אדם. זה הודגם באופן חלקי עבור חלק מחיידקים הקשורים לכלמידיה, כגון Waddlia צndrophila. וו chondrophila יכול לגדול לא רק באמבות, אלא גם בכמה סוגי תאים, כגון תאי יונקים אפיתל, מקרופאגים, ושורות תאי דגי 16-18. Coculture amoebal מופיע גם רלוונטי לאיתור חיידקים תאיים בדגימות קליניות 19,20, כוללים צואה שהם מזוהמים בכבדות עם מיני חיידקים שונים 21.
כאן אנו מתארים את השלבים העיקריים של coculture amoebal והעשרת amoebal, כוללים (א) טיפול בדגימות קליניות או סביבתיות, (ב) הגידול של אמבות בתקשורת axenic ועל דשא חיידקים של Escherichia coli ו (ג) הבחירה ואפיון של חיידקים תוך תאיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
coculture Amoebal והעשרת amoebal שיטות יעילים שאפשרו את בידודם של מינים רבים של חיידקים וamoebal חדשים. תוצאות שהושגו עם שיטות אלה לאשר את הקיום בכל מקום של שני אמבות וחיידקים עמידים לאמבה בסביבה, ודבר המעניין ביותר ברשתות מים מעשה ידי אדם שנחשבים להיות נשלטו על ידי טיפולים כימיים ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ליחסי ציבור. ברנרד לה סקולה לעצות טכניות מועילות ודיון מעניין על coculture amoebal והעשרת amoebal. אנו מודים גם לד"ר וינסנט תומאס על עזרתו ביישום הטכניקה במעבדה שלנו.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 108342 | |
| 0.22 μm pore size membrane | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCVPU11RE | |
| proteose peptone | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 211693 | |
| yeast extract | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 212750 | |
| Cell culture flasks | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 353135 | |
| Kova slide | Hycor, Indianapolis, IN | 87144 | |
| cell culture microplates | Corning Inc, Corning, NY | 3524 | |
| Diff-Quik staining kit | Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany | 130832 | |
| Ziehl fuchsin | Fluka, St-Louis, MI | 21820 | |
| basic fuchsin | Sigma, St-Louis, MI | 857843 | |
| Phenol | Sigma, St-Louis, MI | P1037 | Corrosive and mutagenic |
| malachite green oxalate | Fluka, St-Louis, MI | 63160 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15710 | |
| Saponin | Sigma, St-Louis, MI | 84510 |
References
- Fraser, D. W., et al. Legionnaires’ disease: description of an epidemic of pneumonia. New Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).
- McDade, J. E., et al. Legionnaires’ disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. New Engl. J. Med. 297, 1197-1203 (1977).
- Rowbotham, T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).
- Rodriguez-Zaragoza, S. Ecology of free-living amoebae. Crit. Rev. Microbiol. 20, 225-241 (1994).
- Booton, G. C., Visvesvara, G. S., Byers, T. J., Kelly, D. J., Fuerst, P. A. Identification and distribution of Acanthamoeba species genotypes associated with nonkeratitis infections. J Clin. Microbiol. 43, 1689-1693 (2005).
- Brussow, H. Bacteria between protists and phages: from antipredation strategies to the evolution of pathogenicity. Molecular microbiology. 65, 583-589 (2007).
- Greub, G., Raoult, D. Microorganisms resistant to free-living amoebae. Clin. Microbiol. Rev. 17, 413-433 (2004).
- Thomas, V., McDonnell, G., Denyer, S. P., Maillard, J. Y. Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality. FEMS Microbiol Rev. 34, 231-259 (2010).
- Birtles, R. J., Rowbotham, T. J., Storey, C., Marrie, T. J., Raoult, D. Chlamydia-like obligate parasite of free-living amoebae. Lancet. 349, 925-926 (1997).
- Amann, R., et al. Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp. Appl. Environ. Microbiol. 63, 115-121 (1997).
- Birtles, R. J., et al. Candidatus Odyssella thessalonicensis’ gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 63-72 (2000).
- Thomas, V., Casson, N., Greub, G. Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture. Environ. Microbiol. 8, 2125-2135 (2006).
- Pagnier, I., Raoult, D., La Scola, B. Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure. Environ. Microbiol. 10, 1135-1144 (2008).
- Thomas, V., Loret, J. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environ. Microbiol. 10, 2728-2745 (2008).
- Corsaro, D., et al. Novel Chlamydiales strains isolated from a water treatment plant. Environ. Microbiol. 11, 188-200 (2009).
- Goy, G., Croxatto, A., Greub, G. Waddlia chondrophila enters and multiplies within human macrophages. Microbes Infect. 10, 556-562 (2008).
- Kebbi-Beghdadi, C., Cisse, O., Greub, G. Permissivity of Vero cells, human pneumocytes and human endometrial cells to Waddlia chondrophila. Microbes Infect. 13, 566-574 (2011).
- Kebbi-Beghdadi, C., Batista, C., Greub, G. Permissivity of fish cell lines to three Chlamydia-related bacteria: Waddlia chondrophila, Estrella lausannensis and Parachlamydia acanthamoebae. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 339-345 (2011).
- Fry, N. K., Rowbotham, T. J., Saunders, N. A., Embley, T. M. Direct amplification and sequencing of the 16S ribosomal DNA of an intracellular Legionella species recovered by amoebal enrichment from the sputum of a patient with pneumonia. FEMS Microbiol. Lett. 67, 165-168 (1991).
- Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila serogroup 1 from human feces with use of amebic cocultures. Clin. Infect. Dis. 26, 502-503 (1998).
- Greub, G., La Scola, B., Raoult, D. Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture. Emerging Infect. Dis. 10, 470-477 (2004).
- Isenberg, H. D. . Clinical microbiology procedures handbook. , (1992).
- Gimenez, D. F. Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures. Stain Technol. 39, 135-140 (1964).
- Thomas, V., Herrera-Rimann, K., Blanc, D. S., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-resisting bacteria in a hospital water network. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2428-2438 (2006).
- Miyamoto, H., et al. Development of a new seminested PCR method for detection of Legionella species and its application to surveillance of legionellae in hospital cooling tower water. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2489-2494 (1997).
- Lienard, J., et al. Development of a new chlamydiales-specific real-time PCR and its application to respiratory clinical samples. J. Clin. Microbiol. 49, 2637-2642 (2011).
- Wang, Y., Ogawa, M., Fukuda, K., Miyamoto, H., Taniguchi, H. Isolation and identification of mycobacteria from soils at an illegal dumping site and landfills in Japan. Microbiol. Immunol. 50, 513-524 (2006).
- Corsaro, D., Pages, G. S., Catalan, V., Loret, J. F., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-associated bacteria in water treatment plants. Int. J. Hygiene Environ. Health. 213, 158-166 (2010).
- La Scola, B., et al. Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 699-703 (2004).
- Thomas, V., Casson, N., Greub, G. New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources by amoebal co-culture. Syst. Appl. Microbiol. 30, 572-579 (2007).
- La Scola, B., et al. Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia. Emerging Infect. Dis. 9, 815-821 (2003).
- Collingro, A., et al. Recovery of an environmental Chlamydia strain from activated sludge by co-cultivation with Acanthamoeba sp. Microbiology. 151, 301-309 (2005).
- Lienard, J., Croxatto, A., Prod’hom, G., Greub, G. Estrella lausannensis, a new star in the Chlamydiales order. Microbes Infect. 13, 1232-1241 (2011).
- La Scola, B., et al. A giant virus in amoebae. Science. 299, 2033 (2003).
- Boyer, M., et al. Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).
- Thomas, V., et al. Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets. Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).
- Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. Laboratory infection of a technician by mimivirus. Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).
- Greub, G. Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia. Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).
- Lamoth, F., Greub, G. Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia. FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).
- Lienard, J. G., Ashbolt, K., Sen, N. J. Ch. 6. Environmental microbiology, current technology and water applications. , 143-162 (2011).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ. Microbiol. , (2012).
- Ovrutsky, A. R., et al. Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata. Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).
