Ontdekking van nieuwe intracellulaire pathogenen door Amoebal Coculture en Amoebal Verrijking benaderingen
Summary
Amoebal coculture is een celcultuur systeem met aanhangend amoeben om selectief te groeien intracellulaire pathogenen kunnen fagocytcellen zoals amoeben en macrofagen weerstaan. Het vormt dus een belangrijk instrument om nieuwe infectieuze agentia te ontdekken. Amoebal verrijking laat ontdekking van nieuwe amoebal soorten en hun specifieke intracellulaire bacteriën.
Abstract
Intracellulaire pathogenen zoals Legionella, mycobacteriën en Chlamydia-achtige organismen moeilijk te isoleren omdat ze groeien vaak slecht of helemaal niet op selectieve media die gewoonlijk worden gebruikt om bacteriën te kweken. Om deze reden zijn veel van deze pathogenen zijn pas onlangs ontdekt of volgende belangrijke uitbraken. Deze pathogenen zijn vaak geassocieerd met amoeben, die als gastheer-cel en kan de overleving en groei van de bacteriën. We zijn van plan hier een demonstratie van twee technieken die isolatie en karakterisering van intracellulaire pathogenen aanwezig in klinische of milieu monsters laten leveren: de amoebal co-cultuur en de amoebal verrijking. Amoebal coculture maakt terugwinning van intracellulaire bacteriën door het enten van het te onderzoeken monster op een amoebal grasveld dat besmet kan en de intracellulaire bacteriën in het monster gelyseerd. Amoebal verrijking laat herstel van amoeben aanwezig zijn in een klinische of milieu-monster. Thwordt kan leiden tot de ontdekking van nieuwe amoebal soorten, maar ook van nieuwe intracellulaire bacterie die specifiek groeien in deze amoeben. Samen vormen deze twee technieken helpen om nieuwe intracellulaire bacteriën kunnen groeien in amoeben ontdekken. Vanwege hun vermogen om amoeben infecteren en tegen fagocytose, kunnen deze intracellulaire bacteriën ook ontsnappen fagocytose door macrofagen en dus pathogeen hogere eukaryoten.
Introduction
Vóór de komst van de moleculaire diagnostiek, werden micro-organismen in het milieu niches of in klinische monsters vaak gedetecteerd door het cultiveren van hen op verschillende selectieve media, vooral op agar in petrischalen. Het fenotype van de bacteriële kolonies en hun metabolische activiteit toegestaan dan bacteriële classificatie op soortniveau. Bouillon kan ook worden gebruikt om de gevoeligheid van detectie te vergroten. Echter, beide technieken niet het herstel van de bacteriën die langzaam of niet groeien op alle op deze media toe te staan. Dit is de reden waarom moleculaire benaderingen zo wijd tegenwoordig gebruikt. Niettemin detectie van DNA geeft geen aanwijzing op de levensvatbaarheid van de bacteriën. Bovendien, in tegenstelling tot cultuur moleculaire benaderingen niet tot een stam die verder kan worden gekarakteriseerd.
Studeren ziekteverwekkers die slecht groeien op vaste media of die moeten cellen om te groeien is ingewikkeld. De meeste van deze 'moeilijk te kweken' bacteriën fastidious intracellulair bacteriën, vaak ontdekt en gekarakteriseerd volgende grote uitbraken zoals het geval was voor Legionella pneumophila was. Deze bacterie werd gekenmerkt na een uitbraak die is opgetreden tijdens een American Legion conventie. Maar liefst 182 mensen werden besmet en 29 overleden als gevolg van een ernstige longontsteking 1,2. Later werd aangetoond dat amoeben waren de natuurlijke gastheren van deze bacterie en dat hun aanwezigheid in het hotel airconditioning systeem en waternetwerken was aan de oorsprong van de uitbraak van de ziekte de zogenaamde veteranenziekte 3.
Amoeben aanwezig wereldwijd en werden geïsoleerd uit grond, lucht, water en het neusslijmvlies van menselijke vrijwilligers (beoordeeld in 4). Deze "free-living" amoeben zijn over het algemeen verdelen autonoom in het milieu, maar kan af en toe binnenvallen tolerante systemen 5. Amoeben voeden zich met verschillende micro-organismen door middel van fagocytose en de daaropvolgende lysosomale vertering door hydrolases 6. Veel facultatieve of obligate intracellulaire bacteriën kunnen digestie weerstaan en daardoor infecteren en verdelen amoeben bijvoorbeeld Legionella, Chlamydia verwante bacteriën of mycobacteriën (beoordeeld 7 en 8). Amoeben waarschijnlijk een belangrijke potentiële reservoir vormen voor intracellulaire bacteriën die nog niet zijn ontdekt. Dit leidde onze groep te implementeren in Lausanne twee belangrijkste technieken, genaamd amoebal coculture en amoebal verrijking, waardoor verschillende groepen een aantal nieuwe obligaat intracellulaire micro-organismen te isoleren van verschillende milieu-monsters 9-15.
Aangezien amoeben zijn professionele fagocyten grazen op bacteriën, kan een bacterie in staat om fagocytose te weerstaan en te groeien binnen deze protisten ook koloniseren menselijke fagocyten en pathogeen ten opzichte van mensen. Dit werd gedeeltelijk aangetoond voor enkele Chlamydia-verwante bacteriën, zoals Waddlia chondrophila. W. chondrophila kan groeien, niet alleen in amoeben als in verscheidene celtypes zoals zoogdiercellen epitheelcellen, macrofagen, en vis cellijnen 16-18. De amoebal coculture wordt ook relevant voor het detecteren van intracellulaire bacteriën in klinische monsters 19,20, inclusief ontlasting die zwaar verontreinigd met verschillende bacteriesoorten 21.
Hier beschrijven we de belangrijkste stappen van amoebal coculture en amoebal verrijking, waaronder (a) behandeling van milieu of klinische monsters, (b) de groei van amoeben op axenic media en een bacteriedek van Escherichia coli en (c) de selectie en karakterisering van intracellulaire bacteriën.
Protocol
Representative Results
Discussion
Amoebal coculture en amoebal verrijking zijn efficiënte methoden die de isolatie van veel nieuwe bacteriële en amoebal soorten toegestaan. Resultaten verkregen met deze methoden bevestigen de alomtegenwoordige aanwezigheid van zowel amoeben en-amoebe weerstand bacteriën in het milieu, en het meest interessant in de mens veroorzaakte water netwerken die worden geacht te zijn gecontroleerd door chemische behandelingen, zoals chloreren en ozonisatie. Amoebal coculture en amoebal verrijking zijn essentiële instrumenten …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Pr. Bernard La Scola naar nuttige technische adviezen en interessante discussie over amoebal coculture en amoebal verrijking. We danken ook Dr Vincent Thomas voor zijn hulp bij de uitvoering van de techniek in ons laboratorium.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 108342 | |
| 0.22 μm pore size membrane | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCVPU11RE | |
| proteose peptone | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 211693 | |
| yeast extract | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 212750 | |
| Cell culture flasks | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 353135 | |
| Kova slide | Hycor, Indianapolis, IN | 87144 | |
| cell culture microplates | Corning Inc, Corning, NY | 3524 | |
| Diff-Quik staining kit | Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany | 130832 | |
| Ziehl fuchsin | Fluka, St-Louis, MI | 21820 | |
| basic fuchsin | Sigma, St-Louis, MI | 857843 | |
| Phenol | Sigma, St-Louis, MI | P1037 | Corrosive and mutagenic |
| malachite green oxalate | Fluka, St-Louis, MI | 63160 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15710 | |
| Saponin | Sigma, St-Louis, MI | 84510 |
References
- Fraser, D. W., et al. Legionnaires’ disease: description of an epidemic of pneumonia. New Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).
- McDade, J. E., et al. Legionnaires’ disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. New Engl. J. Med. 297, 1197-1203 (1977).
- Rowbotham, T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).
- Rodriguez-Zaragoza, S. Ecology of free-living amoebae. Crit. Rev. Microbiol. 20, 225-241 (1994).
- Booton, G. C., Visvesvara, G. S., Byers, T. J., Kelly, D. J., Fuerst, P. A. Identification and distribution of Acanthamoeba species genotypes associated with nonkeratitis infections. J Clin. Microbiol. 43, 1689-1693 (2005).
- Brussow, H. Bacteria between protists and phages: from antipredation strategies to the evolution of pathogenicity. Molecular microbiology. 65, 583-589 (2007).
- Greub, G., Raoult, D. Microorganisms resistant to free-living amoebae. Clin. Microbiol. Rev. 17, 413-433 (2004).
- Thomas, V., McDonnell, G., Denyer, S. P., Maillard, J. Y. Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality. FEMS Microbiol Rev. 34, 231-259 (2010).
- Birtles, R. J., Rowbotham, T. J., Storey, C., Marrie, T. J., Raoult, D. Chlamydia-like obligate parasite of free-living amoebae. Lancet. 349, 925-926 (1997).
- Amann, R., et al. Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp. Appl. Environ. Microbiol. 63, 115-121 (1997).
- Birtles, R. J., et al. Candidatus Odyssella thessalonicensis’ gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 63-72 (2000).
- Thomas, V., Casson, N., Greub, G. Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture. Environ. Microbiol. 8, 2125-2135 (2006).
- Pagnier, I., Raoult, D., La Scola, B. Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure. Environ. Microbiol. 10, 1135-1144 (2008).
- Thomas, V., Loret, J. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environ. Microbiol. 10, 2728-2745 (2008).
- Corsaro, D., et al. Novel Chlamydiales strains isolated from a water treatment plant. Environ. Microbiol. 11, 188-200 (2009).
- Goy, G., Croxatto, A., Greub, G. Waddlia chondrophila enters and multiplies within human macrophages. Microbes Infect. 10, 556-562 (2008).
- Kebbi-Beghdadi, C., Cisse, O., Greub, G. Permissivity of Vero cells, human pneumocytes and human endometrial cells to Waddlia chondrophila. Microbes Infect. 13, 566-574 (2011).
- Kebbi-Beghdadi, C., Batista, C., Greub, G. Permissivity of fish cell lines to three Chlamydia-related bacteria: Waddlia chondrophila, Estrella lausannensis and Parachlamydia acanthamoebae. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 339-345 (2011).
- Fry, N. K., Rowbotham, T. J., Saunders, N. A., Embley, T. M. Direct amplification and sequencing of the 16S ribosomal DNA of an intracellular Legionella species recovered by amoebal enrichment from the sputum of a patient with pneumonia. FEMS Microbiol. Lett. 67, 165-168 (1991).
- Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila serogroup 1 from human feces with use of amebic cocultures. Clin. Infect. Dis. 26, 502-503 (1998).
- Greub, G., La Scola, B., Raoult, D. Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture. Emerging Infect. Dis. 10, 470-477 (2004).
- Isenberg, H. D. . Clinical microbiology procedures handbook. , (1992).
- Gimenez, D. F. Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures. Stain Technol. 39, 135-140 (1964).
- Thomas, V., Herrera-Rimann, K., Blanc, D. S., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-resisting bacteria in a hospital water network. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2428-2438 (2006).
- Miyamoto, H., et al. Development of a new seminested PCR method for detection of Legionella species and its application to surveillance of legionellae in hospital cooling tower water. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2489-2494 (1997).
- Lienard, J., et al. Development of a new chlamydiales-specific real-time PCR and its application to respiratory clinical samples. J. Clin. Microbiol. 49, 2637-2642 (2011).
- Wang, Y., Ogawa, M., Fukuda, K., Miyamoto, H., Taniguchi, H. Isolation and identification of mycobacteria from soils at an illegal dumping site and landfills in Japan. Microbiol. Immunol. 50, 513-524 (2006).
- Corsaro, D., Pages, G. S., Catalan, V., Loret, J. F., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-associated bacteria in water treatment plants. Int. J. Hygiene Environ. Health. 213, 158-166 (2010).
- La Scola, B., et al. Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 699-703 (2004).
- Thomas, V., Casson, N., Greub, G. New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources by amoebal co-culture. Syst. Appl. Microbiol. 30, 572-579 (2007).
- La Scola, B., et al. Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia. Emerging Infect. Dis. 9, 815-821 (2003).
- Collingro, A., et al. Recovery of an environmental Chlamydia strain from activated sludge by co-cultivation with Acanthamoeba sp. Microbiology. 151, 301-309 (2005).
- Lienard, J., Croxatto, A., Prod’hom, G., Greub, G. Estrella lausannensis, a new star in the Chlamydiales order. Microbes Infect. 13, 1232-1241 (2011).
- La Scola, B., et al. A giant virus in amoebae. Science. 299, 2033 (2003).
- Boyer, M., et al. Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).
- Thomas, V., et al. Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets. Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).
- Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. Laboratory infection of a technician by mimivirus. Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).
- Greub, G. Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia. Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).
- Lamoth, F., Greub, G. Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia. FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).
- Lienard, J. G., Ashbolt, K., Sen, N. J. Ch. 6. Environmental microbiology, current technology and water applications. , 143-162 (2011).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ. Microbiol. , (2012).
- Ovrutsky, A. R., et al. Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata. Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).
