Entdeckung neuer intrazelluläre Erreger von Amöben Amöben Cokultur und Enrichment Ansätze
Summary
Amöben Kokultur ein Zellkultursystem mit adhärenten Amöben, selektiv wachsen intrazelluläre Pathogene in der Lage, phagozytische Zellen wie Amöben und Makrophagen zu widerstehen. Es stellt somit ein wichtiges Instrument, um neue Infektionserreger entdecken. Amöben Bereicherung ermöglicht Entdeckung neuer Amöbenarten und ihrer spezifischen intrazellulären Bakterien.
Abstract
Die intrazelluläre Erreger wie Legionellen, Mykobakterien und Chlamydien-ähnlichen Organismen sind schwierig zu isolieren, weil sie schlecht oder gar nicht wachsen oft überhaupt auf selektiven Medien, die üblicherweise verwendet werden, um Bakterien zu kultivieren. Aus diesem Grund sind viele dieser Krankheitserreger wurden erst vor kurzem oder folgenden wichtigen Ausbrüche entdeckt. Diese Erreger sind oft mit Amöben, die als Wirtszelle dienen und ermöglichen es, das Überleben und das Wachstum der Bakterien verbunden. Wir wollen hier, um eine Demonstration von zwei Techniken, die Isolierung und Charakterisierung von intrazellulären Erregern in der klinischen oder Umweltproben vorhanden ermöglichen bieten: die Amöben Co-Kultur und die Amöben Bereicherung. Amöben Co-Kultur ermöglicht die Wiederherstellung der intrazellulären Bakterien, die durch Impfen der untersuchten Probe auf einem Rasen, der Amöben infiziert werden können und lysiert durch die in der Probe vorhanden sind intrazelluläre Bakterien. Amöben Anreicherung ermöglicht die Wiederherstellung von Amöben in einer klinischen oder Umweltprobe vorhanden. Thwird, kann auf Entdeckung von neuen Amöbenarten, sondern auch von neuen intrazellulären Bakterien wachsen speziell in diesen Amöben führen. Zusammen helfen diese beiden Techniken, um neue intrazelluläre Bakterien in der Lage, in Amöben wachsen zu entdecken. Aufgrund ihrer Fähigkeit, Amöben infizieren und wider Phagozytose, intrazelluläre Bakterien könnten diese auch zu entkommen Phagozytose durch Makrophagen und somit sein pathogen für höhere Eukaryonten unterschieden.
Introduction
Vor dem Aufkommen der molekularen Diagnostik, wurden in der Umwelt Nischen oder in klinischen Proben vorhandenen Mikroorganismen oft durch Kultivierung auf verschiedenen selektiven Medien, vor allem auf Agar in Petrischalen nachgewiesen. Der Phänotyp der Bakterienkolonien und ihre Stoffwechselaktivität erlaubt dann bakterielle Einstufung auf Artenebene. Brühe kann auch verwendet werden, um die Nachweisempfindlichkeit zu erhöhen. Allerdings haben beide Techniken erlauben die Gewinnung von Bakterien, die langsam oder gar nicht auf diesen Medien wachsen. Dies ist der Grund, warum molekulare Ansätze werden so heute weit verbreitet. Dennoch Nachweis von DNA bietet keine Ahnung, auf die Lebensfähigkeit der Bakterien. Darüber hinaus im Gegensatz zu Kultur, Molekularbiologie Ansätze nicht in einem Stamm, der ferner dadurch gekennzeichnet ist, führen.
Studieren Krankheitserreger, die schlecht wachsen auf festen Medien oder dass Bedarf Zellen wachsen ist kompliziert. Die meisten dieser "schwierig zu wachsen" Bakterien sind anspruchsvoll intrazellulären Bakterien, oft entdeckt und folgende große Ausbrüche, wie es der Fall bei Legionella pneumophila war gekennzeichnet. Dieses Bakterium wurde nach einem Ausbruch, die während eines American Legion Convention aufgetreten ist. So viel, wie 182 Menschen wurden infiziert und 29 starben an einer schweren Lungenentzündung 1,2. Es wurde später gezeigt, dass Amöben waren die natürlichen Wirte dieses Bakteriums und dass ihre Anwesenheit im Hotelklimaanlage und Wassernetze war der Ursprung des Ausbruchs der sogenannten Legionärskrankheit 3.
Amöben sind weltweit präsent und wurden aus Boden, Luft, Wasser und die Nasenschleimhaut von Freiwilligen (in 4 Bewertung) isoliert. Diese "freilebenden" Amöben sind in der Regel selbstständig Aufteilung in die Umwelt, sondern kann gelegentlich dringen zügigen Gastgeber fünf. Amöben ernähren sich von verschiedenen Mikroorganismen durch Phagozytose und anschließende lysosomale Verdauung durch hydrolases 6. Viele fakultativ oder obligat intrazelluläre Bakterien sind in der Lage, um die Verdauung zu widerstehen und damit zu infizieren und zu teilen in Amöben wie beispielsweise Legionellen, Chlamydien-verwandten Bakterien oder Mykobakterien (in 7 überprüft und 8). Freilebende Amöben wahrscheinlich eine wichtige potenzielle Reservoir für die intrazelluläre Bakterien, die noch nicht entdeckt wurden. Dies führte unsere Gruppe in Lausanne implementieren zwei Haupttechniken, die so genannte Amöben Co-Kultur und Amöben Bereicherung, die verschiedenen Gruppen zu mehreren neuen obligat intrazelluläre Mikroorganismen aus verschiedenen Umweltproben zu isolieren 9-15 erlaubt.
Da Amöben sind professionelle Phagozyten Beweidung auf Bakterien, könnte ein Bakterium in der Lage, die Phagozytose zu widerstehen und innerhalb dieser Protisten wachsen auch kolonisieren menschlichen Phagozyten und sein gegenüber Menschen pathogen. Dies wurde teilweise für einige Chlamydia-verwandten Bakterien, wie gezeigt Waddlia chondrophila. W. chondrophila nicht nur in Amöben, sondern auch in verschiedenen Zelltypen, wie Säuger Epithelzellen, Makrophagen und Fischzelllinien 16-18 wachsen. Die Amöben Kokultur erscheint auch zum Nachweis von intrazellulären Bakterien in klinischen Proben 19,20, darunter Stühle, die stark mit verschiedenen Bakterienarten 21 verunreinigt sind relevant.
Hier beschreiben wir die wichtigsten Schritte Amöben Co-Kultur und Amöben Bereicherung, einschließlich (a) Behandlung von Umwelt-oder klinischen Proben, (b) das Wachstum von Amöben auf axenischen Medien und auf einem Bakterienrasen von Escherichia coli und (c) der Auswahl und Charakterisierung intrazelluläre Bakterien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Amöben Co-Kultur und Amöben Bereicherung sind effiziente Methoden, die die Trennung von vielen neuen Bakterien-und Amöbenarten erlaubt. Ergebnisse mit diesen Methoden erhaltenen bestätigen die allgegenwärtige Präsenz der beiden Amöben und Amöbe beständigen Bakterien in der Umwelt und am interessantesten in künstlichen Wassernetze, die als durch chemische Behandlungen wie Chlorung und Ozonierung gesteuert werden. Amöben Co-Kultur und Amöben Bereicherung sind wesentliche Instrumente zu isolieren und kultiviere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Pr. Bernard La Scola für hilfreiche technische Ratschläge und interessante Diskussion über Amöben Co-Kultur und Amöben Bereicherung. Wir danken auch Dr. Vincent Thomas für seine Hilfe bei der Umsetzung der Technik in unserem Labor.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 108342 | |
| 0.22 μm pore size membrane | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCVPU11RE | |
| proteose peptone | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 211693 | |
| yeast extract | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 212750 | |
| Cell culture flasks | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 353135 | |
| Kova slide | Hycor, Indianapolis, IN | 87144 | |
| cell culture microplates | Corning Inc, Corning, NY | 3524 | |
| Diff-Quik staining kit | Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany | 130832 | |
| Ziehl fuchsin | Fluka, St-Louis, MI | 21820 | |
| basic fuchsin | Sigma, St-Louis, MI | 857843 | |
| Phenol | Sigma, St-Louis, MI | P1037 | Corrosive and mutagenic |
| malachite green oxalate | Fluka, St-Louis, MI | 63160 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15710 | |
| Saponin | Sigma, St-Louis, MI | 84510 |
References
- Fraser, D. W., et al. Legionnaires’ disease: description of an epidemic of pneumonia. New Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).
- McDade, J. E., et al. Legionnaires’ disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. New Engl. J. Med. 297, 1197-1203 (1977).
- Rowbotham, T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).
- Rodriguez-Zaragoza, S. Ecology of free-living amoebae. Crit. Rev. Microbiol. 20, 225-241 (1994).
- Booton, G. C., Visvesvara, G. S., Byers, T. J., Kelly, D. J., Fuerst, P. A. Identification and distribution of Acanthamoeba species genotypes associated with nonkeratitis infections. J Clin. Microbiol. 43, 1689-1693 (2005).
- Brussow, H. Bacteria between protists and phages: from antipredation strategies to the evolution of pathogenicity. Molecular microbiology. 65, 583-589 (2007).
- Greub, G., Raoult, D. Microorganisms resistant to free-living amoebae. Clin. Microbiol. Rev. 17, 413-433 (2004).
- Thomas, V., McDonnell, G., Denyer, S. P., Maillard, J. Y. Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality. FEMS Microbiol Rev. 34, 231-259 (2010).
- Birtles, R. J., Rowbotham, T. J., Storey, C., Marrie, T. J., Raoult, D. Chlamydia-like obligate parasite of free-living amoebae. Lancet. 349, 925-926 (1997).
- Amann, R., et al. Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp. Appl. Environ. Microbiol. 63, 115-121 (1997).
- Birtles, R. J., et al. Candidatus Odyssella thessalonicensis’ gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 63-72 (2000).
- Thomas, V., Casson, N., Greub, G. Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture. Environ. Microbiol. 8, 2125-2135 (2006).
- Pagnier, I., Raoult, D., La Scola, B. Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure. Environ. Microbiol. 10, 1135-1144 (2008).
- Thomas, V., Loret, J. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environ. Microbiol. 10, 2728-2745 (2008).
- Corsaro, D., et al. Novel Chlamydiales strains isolated from a water treatment plant. Environ. Microbiol. 11, 188-200 (2009).
- Goy, G., Croxatto, A., Greub, G. Waddlia chondrophila enters and multiplies within human macrophages. Microbes Infect. 10, 556-562 (2008).
- Kebbi-Beghdadi, C., Cisse, O., Greub, G. Permissivity of Vero cells, human pneumocytes and human endometrial cells to Waddlia chondrophila. Microbes Infect. 13, 566-574 (2011).
- Kebbi-Beghdadi, C., Batista, C., Greub, G. Permissivity of fish cell lines to three Chlamydia-related bacteria: Waddlia chondrophila, Estrella lausannensis and Parachlamydia acanthamoebae. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 339-345 (2011).
- Fry, N. K., Rowbotham, T. J., Saunders, N. A., Embley, T. M. Direct amplification and sequencing of the 16S ribosomal DNA of an intracellular Legionella species recovered by amoebal enrichment from the sputum of a patient with pneumonia. FEMS Microbiol. Lett. 67, 165-168 (1991).
- Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila serogroup 1 from human feces with use of amebic cocultures. Clin. Infect. Dis. 26, 502-503 (1998).
- Greub, G., La Scola, B., Raoult, D. Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture. Emerging Infect. Dis. 10, 470-477 (2004).
- Isenberg, H. D. . Clinical microbiology procedures handbook. , (1992).
- Gimenez, D. F. Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures. Stain Technol. 39, 135-140 (1964).
- Thomas, V., Herrera-Rimann, K., Blanc, D. S., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-resisting bacteria in a hospital water network. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2428-2438 (2006).
- Miyamoto, H., et al. Development of a new seminested PCR method for detection of Legionella species and its application to surveillance of legionellae in hospital cooling tower water. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2489-2494 (1997).
- Lienard, J., et al. Development of a new chlamydiales-specific real-time PCR and its application to respiratory clinical samples. J. Clin. Microbiol. 49, 2637-2642 (2011).
- Wang, Y., Ogawa, M., Fukuda, K., Miyamoto, H., Taniguchi, H. Isolation and identification of mycobacteria from soils at an illegal dumping site and landfills in Japan. Microbiol. Immunol. 50, 513-524 (2006).
- Corsaro, D., Pages, G. S., Catalan, V., Loret, J. F., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-associated bacteria in water treatment plants. Int. J. Hygiene Environ. Health. 213, 158-166 (2010).
- La Scola, B., et al. Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 699-703 (2004).
- Thomas, V., Casson, N., Greub, G. New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources by amoebal co-culture. Syst. Appl. Microbiol. 30, 572-579 (2007).
- La Scola, B., et al. Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia. Emerging Infect. Dis. 9, 815-821 (2003).
- Collingro, A., et al. Recovery of an environmental Chlamydia strain from activated sludge by co-cultivation with Acanthamoeba sp. Microbiology. 151, 301-309 (2005).
- Lienard, J., Croxatto, A., Prod’hom, G., Greub, G. Estrella lausannensis, a new star in the Chlamydiales order. Microbes Infect. 13, 1232-1241 (2011).
- La Scola, B., et al. A giant virus in amoebae. Science. 299, 2033 (2003).
- Boyer, M., et al. Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).
- Thomas, V., et al. Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets. Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).
- Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. Laboratory infection of a technician by mimivirus. Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).
- Greub, G. Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia. Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).
- Lamoth, F., Greub, G. Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia. FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).
- Lienard, J. G., Ashbolt, K., Sen, N. J. Ch. 6. Environmental microbiology, current technology and water applications. , 143-162 (2011).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ. Microbiol. , (2012).
- Ovrutsky, A. R., et al. Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata. Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).
