Découverte de nouveaux agents pathogènes intracellulaires par amibienne Coculture et approches amibienne enrichissement
Summary
Coculture amibienne est un système de culture cellulaire en utilisant des amibes adhérente à croître sélectivement les pathogènes intracellulaires capables de résister à des cellules phagocytaires telles que les amibes et les macrophages. Il représente donc un outil essentiel pour découvrir de nouveaux agents infectieux. Enrichissement amibienne permet de découvrir de nouvelles espèces amibienne et de leurs bactéries intracellulaires spécifiques.
Abstract
Pathogènes intracellulaires tels que les légionelles, les mycobactéries et organismes Chlamydia-like sont difficiles à isoler car ils poussent souvent mal ou pas du tout sur des milieux sélectifs qui sont habituellement utilisés pour cultiver des bactéries. Pour cette raison, beaucoup de ces agents pathogènes ont été découverts que récemment ou à la suite des flambées importantes. Ces agents pathogènes sont souvent associés à des amibes, qui servent de la cellule hôte et de permettre la survie et la croissance des bactéries. Nous avons l'intention ici de fournir une démonstration de deux techniques qui permettent l'isolement et la caractérisation de pathogènes intracellulaires présents dans les échantillons cliniques ou environnementaux: la co-culture amibienne et l'enrichissement amibienne. Coculture amibienne permet la récupération des bactéries intracellulaires en inoculant l'échantillon étudié sur une pelouse amibienne qui peut être infectée et lysée par des bactéries intracellulaires présentes dans l'échantillon. Amibienne enrichissement permet la récupération d'amibes présent dans un échantillon clinique ou environnementale. Thest peut conduire à la découverte de nouvelles espèces amibienne, mais aussi de nouvelles bactéries intracellulaires croissance spécifiquement dans ces amibes. Ensemble, ces deux techniques permettent de découvrir de nouvelles bactéries intracellulaires capables de se développer dans les amibes. En raison de leur capacité à infecter les amibes et résister à la phagocytose, ces bactéries intracellulaires peuvent aussi échapper à la phagocytose par les macrophages et, par conséquent, être pathogènes pour les eucaryotes supérieurs.
Introduction
Avant l'avènement de diagnostic moléculaire, les micro-organismes présents dans l'environnement niches ou dans des échantillons cliniques sont souvent détectés en les cultivant sur différents milieux sélectifs, principalement sur de la gélose dans des boîtes de Pétri. Le phénotype des colonies bactériennes et leur activité métabolique ensuite laissé classification bactérienne au niveau de l'espèce. Le bouillon peut également être utilisée pour augmenter la sensibilité de détection. Cependant, ces deux techniques ne permettent pas la récupération de bactéries qui se développent lentement ou pas du tout sur ces supports. C'est la raison pour laquelle des approches moléculaires sont si largement utilisés de nos jours. Néanmoins, la détection de l'ADN fournit aucune indication sur la viabilité des bactéries. En outre, contrairement à la culture, les approches moléculaires ne conduisent pas à une souche qui peut être en outre caractérisé.
L'étude des agents pathogènes qui se développent mal sur des supports solides ou que les cellules ont besoin pour grandir est compliqué. La plupart de ces «difficile à cultiver" les bactéries sont intr fastidieuxbactéries acellulaire, souvent découverts et caractérisés suivant les grandes épidémies comme ce fut le cas pour Legionella pneumophila. Cette bactérie a été caractérisé suite à une épidémie qui s'est produite au cours d'un congrès de la Légion américaine. Autant que 182 personnes ont été infectées et 29 sont mortes en raison d'une pneumonie sévère de 1,2. Il a ensuite été démontré que les amibes sont les hôtes naturels de cette bactérie et que leur présence dans les réseaux hôtel de système de climatisation et de l'eau est à l'origine de l'éclosion de la maladie de la soi-disant légionnaire 3.
Les amibes sont présents dans le monde entier et ont été isolés à partir du sol, l'air, l'eau et la muqueuse nasale de volontaires humains (revue en 4). Ces amibes "libre-vie» sont généralement divise de manière autonome dans l'environnement, mais peut parfois envahir hôtes permissives 5. l'alimentation des amibes sur divers micro-organismes par phagocytose et après digestion lysosomale par hydrolases 6. Beaucoup de bactéries intracellulaires facultatives ou obligeront sont capables de résister à la digestion et donc d'infecter et de diviser en amibes comme par exemple des bactéries ou des mycobactéries Legionella, Chlamydia liées (revu en 7 et 8). Amibes libres représentent probablement un réservoir important potentiel pour les bactéries intracellulaires qui l'ont pas encore été découverts. Cela a conduit notre groupe à mettre en œuvre à Lausanne deux techniques principales, appelées co-culture amibienne et l'enrichissement amibienne, qui ont permis d'isoler les différents groupes de plusieurs nouveaux micro-organismes intracellulaires obligatoires à partir de divers échantillons environnementaux 9-15.
Depuis amibes sont des phagocytes professionnels qui paissent sur les bactéries, une bactérie capable de résister à la phagocytose et à se développer à l'intérieur de ces protistes peut également coloniser les phagocytes humains et être pathogène envers les humains. Ceci a été partiellement démontrée pour certaines bactéries Chlamydia liés, tels que Waddlia chondrophila. W. chondrophila peut se développer non seulement dans les amibes, mais également dans plusieurs types de cellules telles que des cellules épithéliales de mammifères, les macrophages, et les lignées cellulaires de poisson de 16 à 18. La co-culture amibienne semble également pertinent pour détecter des bactéries intracellulaires dans des échantillons cliniques, y compris 19,20 selles qui sont fortement contaminés par les différentes espèces bactériennes 21.
Nous décrivons ici les principales étapes de co-culture amibienne et l'enrichissement amibienne, y compris (a) le traitement des échantillons environnementaux ou cliniques; (b) la croissance des amibes sur les médias axéniques et sur une pelouse bactérienne d'Escherichia coli et (c) la sélection et la caractérisation des bactéries intracellulaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Coculture amibienne et l'enrichissement amibienne sont des méthodes efficaces qui ont permis l'isolement de nombreuses nouvelles espèces bactériennes et amibienne. Les résultats obtenus avec ces méthodes confirment la présence ubiquitaire des amibes et les bactéries à la fois d'amibes résistant à l'environnement, et plus intéressant dans les réseaux d'eau d'origine humaine qui sont considérés pour être commandé par des traitements chimiques tels que la chloration, ozonation. Cocul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Pr. Bernard La Scola pour des conseils techniques utiles et intéressante discussion sur coculture amibienne et l'enrichissement amibienne. Nous remercions également le Dr Vincent Thomas pour son aide dans la mise en œuvre de la technique dans notre laboratoire.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 108342 | |
| 0.22 μm pore size membrane | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCVPU11RE | |
| proteose peptone | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 211693 | |
| yeast extract | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 212750 | |
| Cell culture flasks | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 353135 | |
| Kova slide | Hycor, Indianapolis, IN | 87144 | |
| cell culture microplates | Corning Inc, Corning, NY | 3524 | |
| Diff-Quik staining kit | Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany | 130832 | |
| Ziehl fuchsin | Fluka, St-Louis, MI | 21820 | |
| basic fuchsin | Sigma, St-Louis, MI | 857843 | |
| Phenol | Sigma, St-Louis, MI | P1037 | Corrosive and mutagenic |
| malachite green oxalate | Fluka, St-Louis, MI | 63160 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15710 | |
| Saponin | Sigma, St-Louis, MI | 84510 |
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