Metodi per studiare i meccanismi d'azione di farmaci antipsicotici in<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
Approcci per testare gli effetti dei farmaci antipsicotici (APD) in Caenorhabditis elegans sono dimostrati. I dosaggi sono descritti per testare gli effetti della droga sullo sviluppo e la redditività e sulla faringe velocità di pompaggio. Questi metodi sono applicabili per esperimenti di farmacogenetica con classi di farmaci diversi da APD anche.
Abstract
Caenorhabditis elegans è un organismo semplice genetica suscettibili di larga scala in avanti e retromarcia schermi genetici e schermi genetici chimici. La C. elegans genoma include potenziale farmaco antipsicotico (APD) obiettivi conservati negli esseri umani, compresi i geni che codificano le proteine necessarie per la sintesi dei neurotrasmettitori e per la struttura e la funzione sinaptica. L'esposizione APD produce ritardo di sviluppo e / o letalità in nematodi in modo concentrazione-dipendente. Questi fenotipi sono causati, in parte, mediante inibizione APD-indotta faringeo pompaggio 1,2. Così, il fenotipo di sviluppo ha una base neuromuscolare, rendendolo utile per studi di farmacogenetica dei neurolettici. Qui mostriamo le procedure dettagliate per testare gli effetti APD sullo sviluppo nematode e della faringe pompaggio. Per il saggio di sviluppo, gli embrioni sincronizzati sono immessi sul (NGM) piastre contenenti APD nematode mezzo di crescita, e le fasi di sviluppo di animali vengono quindi segnati giornalmente. Per il saggio faringeo tasso di pompaggio, in scena giovani animali adulti sono testati su piastre NGM contenenti APD. Il numero di pompe faringei per unità di tempo viene registrato, e la velocità di pompaggio è calcolato. Questi saggi possono essere utilizzati per studiare molti altri tipi di piccole molecole o anche grandi molecole.
Introduction
Caenorhabditis elegans è un organismo semplice genetica suscettibili di grandi schermi genetiche in avanti e all'indietro e schermi genetici chimici. C. elegans è sensibile ad un ampio spettro di composti bioattivi e pertanto è stato usato con successo per definire i meccanismi di azione di una varietà di tali composti. Ad esempio, i composti bioattivi studiate usando farmacogenetica vermi sono agonisti del recettore dell'acetilcolina (ad esempio Levamisolo, nicotina, morantel, e Pyrantel), anestetici (es. alotano), la caffeina, gli inibitori della colinesterasi (ad esempio aldicarb, Lannate, e triclorfon), fluoruro, GABA-correlate composti (ad esempio GABA e muscimolo), ivermectina, paraquat, esteri del forbolo, e farmaci serotonina legati (es. serotonina e imiprimine) 3. Inoltre, C. elegans è stato usato per grandi schermi piccole molecole, permettendo scoperta di nuovi composti bioattivis e identificazione di nuovi bersagli genetici 4.
La C. elegans genoma include potenziale farmaco antipsicotico (APD) obiettivi conservati negli esseri umani, compresi i geni che codificano le proteine necessarie per la sintesi dei neurotrasmettitori e per la struttura e la funzione sinaptica 5. Così, C. elegans neurogenetica e offrono neurobiologia metodi per la scoperta di nuovi meccanismi molecolari d'azione di APD. In nematodi, l'esposizione APD precoce dello sviluppo produce ritardo dello sviluppo, e a concentrazioni più elevate, letalità 2,6. L'esposizione APD durante l'età adulta produce fenotipi comportamentali. Ad esempio, l'esposizione clozapina inibisce la locomozione e faringea pompaggio e migliora la deposizione delle uova 1,2,7.
APD-indotta ritardo e letalità dello sviluppo sono fenotipi potenti per grandi schermi genetici chimici. Questi fenotipi sono complesse nella misura in cui probabilmente hanno più di un BASI cellulari e geneticis. Pertanto, tali schermi genetici dovrebbero produrre una varietà di bersagli indiretti droga. Tuttavia, il nostro laboratorio ha condotto candidati schermi di geni e uno schermo RNAi genome-wide per soppressori di APD indotta ritardi e letalità dello sviluppo e ha recuperato con successo geni che codificano probabili bersagli diretti, tra cui la dopamina, l'insulina, e recettori nicotinici 2,8. Schermi genetici basati sui comportamenti APD-indotte nel adulti hanno portato anche all'identificazione di nuovi bersagli APD, e ora stiamo convalida bersagli dagli schermi sia sviluppo e comportamentali nei mammiferi 7. Così, un approccio invertebrato chimica genetica per scoprire i meccanismi molecolari d'azione delle APD sembra essere fattibile 5,8.
La C. elegans faringe è un organo che include 20 neuroni, cellule muscolari, 20 e 20 cellule accessorie, avvolto da una membrana basale. Simile al cuore dei mammiferi, la faringe è un autonomond pompe costantemente cibo dall'ambiente esterno 9. L'inibizione del tasso di pompaggio faringeo compromette l'assorbimento di cibo, e quindi le mutazioni o farmaci che inibiscono faringeo pompaggio causa ritardo nello sviluppo o arresto 9. APD inibiscono il tasso faringeo di pompaggio, che rappresentano in parte per i loro effetti sullo sviluppo e la redditività 1,2. Qui, usiamo il atipico APD clozapina come esempio per dimostrare saggi di droga per lo sviluppo nematode e della faringe pompaggio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, descriviamo metodi per testare gli effetti della APD sullo sviluppo e comportamento di C. elegans. DMSO o etanolo è usato per sciogliere clozapina, in quanto il farmaco è relativamente insolubile in acqua. Dato che i solventi sono stati segnalati per influenzare C. elegans biologia 12, DMSO-alone o gruppi di controllo etanolo-alone sono essenziali. La massima concentrazione di DMSO utilizzata nei nostri test è fino al 3%, che non ha un effetto evidente sul C. elegans svilupp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato supportato da un NIH premio Sviluppo Scienziato Clinico K08NS002083, un Shervert Frazier Research Institute Grant, e un NARSAD Young Investigator Award di Edgar A. Buttner.
Materials
| Clozapine | Sigma | C6305 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 |
| Acetic acid (HAC) | Fisher | BP2401 |
| Sodium hydroxide(NaOH) | EMD | SX0590-13 |
| Hypochlorite | Sigma-Aldrich | 425044 |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | M1246-0006 |
| Low temperature incubator 815 | Precision Scientific | J1790-1B |
| Stereo microscope | Olympus | SZX12 |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 |
| 12-well tissue culture plate | BD Falcon | REF 353043 |
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