Methoden zur Untersuchung der Wirkmechanismen von Psychopharmaka in<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
Ansätze zum Testen der Wirkung von Neuroleptika (APD) in Caenorhabditis elegans gezeigt werden. Die Tests werden für die Prüfung Arzneimittelwirkungen auf die Entwicklung und Lebensfähigkeit und Rachenpumprate beschrieben. Diese Methoden sind auch für pharmakogenetische Versuche mit anderen als APDs Medikamentenklassen.
Abstract
Caenorhabditis elegans ist eine einfache genetische Organismus zugänglich Groß Vorwärts-und Rückwärts genetischen Screens und chemisch-genetischen Bildschirme. Die C. elegans Genom umfasst mögliche Antipsychotikum (APD) Ziele im Menschen konserviert, einschließlich der Gene, die Proteine für die Neurotransmitter-Synthese und für die synaptische Struktur und Funktion erforderlich kodiert. APD Exposition produziert Entwicklungsverzögerung und / oder Letalität bei Nematoden in einer konzentrationsabhängigen Weise. Diese Phänotypen verursacht, teilweise durch die APD-induzierte Hemmung der Rachenpump 1,2. Somit hat die Entwicklungs Phänotyp eine neuromuskuläre Basis, so dass es nützlich pharmakogenetische Studien von Neuroleptika. Hier zeigen wir detaillierte Verfahren für die Prüfung APD Auswirkungen auf die Nematodenentwicklung und Rachen Pumpen. Für die Entwicklungs-Assay werden synchronisiert Embryonen auf Nematoden-Wachstumsmedium (NGM)-Platten, die APD, und die Stadien der Entwicklung ani platziertmals werden dann täglich erzielt. Für die Rachenpumprate-Test, inszenierte junge Tiere werden auf NGM-Platten mit APDs getestet. Die Anzahl der Pharynx Pumpen pro Zeiteinheit aufgezeichnet werden, und die Pumpgeschwindigkeit wird berechnet. Diese Assays können zur Untersuchung von vielen anderen Arten von kleinen Molekülen oder sogar großen Molekülen verwendet werden.
Introduction
Caenorhabditis elegans ist eine einfache genetische Organismus zugänglich Groß Vorwärts-und Rückwärts genetischen Screens und chemisch-genetischen Bildschirme. C elegans ist gegenüber einem breiten Spektrum von biologisch aktiven Verbindungen und ist daher nicht erfolgreich verwendet worden, um die Mechanismen der Wirkung von einer Vielzahl von solchen Verbindungen zu definieren. Zum Beispiel mit Schnecken Pharmakogenetik gehören Acetylcholin-Rezeptor-Agonisten (zB Levamisol, Nikotin, Morantel und Pyrantel), Anästhetika (zB Halothan), Koffein, Cholinesterase-Inhibitoren (z. B. Aldicarb, Lannate und Trichlorfon), Fluorid, GABA-verwandten studierte bioaktiven Verbindungen Verbindungen (z. B. GABA und Muscimol), Ivermectin, Paraquat, Phorbolester und Serotonin-bezogene Medikamente (z. B. Serotonin und imiprimine) 3. Außerdem C. elegans hat für große Bildschirme kleines Molekül verwendet worden, so dass Entdeckung von neuen bioaktiven Verbindungs und Identifizierung neuer genetischer Ziele 4.
Die C. elegans Genom umfasst mögliche Antipsychotikum (APD) Ziele im Menschen konserviert, einschließlich der Gene, die Proteine für die Neurotransmitter-Synthese und für die synaptische Struktur und Funktion 5 erforderlich kodiert. So, C. elegans Neurogenetik und Neurobiologie bieten Methoden für die Entdeckung neuer molekularer Wirkmechanismen von APDs. In Nematoden, APD Exposition früh in der Entwicklung produziert Entwicklungsverzögerung, und bei höheren Konzentrationen, Letalität 2,6. APD Exposition im Erwachsenenalter produziert Verhaltens Phänotypen. Zum Beispiel hemmt Clozapin Exposition Fortbewegung und Rachenpump und verbessert Eiablage 1,2,7.
APD-induzierten Entwicklungsverzögerung und Letalität sind starke Phänotypen für Groß chemisch-genetischen Bildschirme. Diese Phänotypen sind komplex, soweit sie wahrscheinlich mehr als einen zellulären und genetischen basis. Daher werden solche genetischen Bildschirme erwartet, dass eine Vielzahl von indirekten Wirkstoffziele ergeben. Allerdings hat unser Labor Kandidaten-Gen-Bildschirme und eine genomweite RNAi-Bildschirm für die Unterdrücker der APD-induzierten Entwicklungsverzögerung und Letalität durchgeführt und erfolgreich wiederhergestellt Gene, die wahrscheinlich zu kodieren direkte Ziele, einschließlich Dopamin, Insulin und Nikotinsäure Acetylcholin-Rezeptoren 2,8. Genetische Screens auf der Grundlage APD-induzierte Verhalten beim Erwachsenen haben auch die Identifizierung neuer APD Ziele führte, und wir jetzt Validierung von Targets sowohl Entwicklungs-und Verhaltens Bildschirme in Säugetieren 7. So scheint, ein wirbel chemisch-genetischen Ansatz für neuartige molekulare Wirkmechanismen von APDs entdecken machbar 5,8 sein.
Die C. elegans Rachen ist ein Organ, 20 Neuronen, Muskelzellen, 20, 20 und akzessorischen Zellen durch eine Basalmembran gewickelt enthält. Ähnlich wie bei der Säugetier-Herz, ist der Rachen eine autonomend Pumpen ständig Essen in von der äußeren Umgebung 9. Die Hemmung der Rachenpumprate beeinträchtigt Nahrungsaufnahme und damit Mutationen oder Medikamente, die Rachenpump Ursache Entwicklungsverzögerung hemmen oder zu verhaften 9. APDs hemmen die Rachenpumprate Anteil zum Teil auf ihre Auswirkungen auf die Entwicklung und Lebensfähigkeit 1,2. Hier verwenden wir die atypische APD Clozapin als Beispiel für Drogentests zur Nematodenentwicklung und Rachenpump demonstrieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier Verfahren zum Testen der Wirkung von APDs auf die Entwicklung und das Verhalten von C beschreiben wir elegans. DMSO oder Ethanol eingesetzt wird Clozapin lösen, da der Wirkstoff in Wasser relativ unlöslich ist. Da Lösungsmittel wurde berichtet, daß C. beeinflussen elegans Biologie 12, DMSO-alone-oder Ethanol-alone-Kontrollgruppen sind unerlässlich. Die höchste Konzentration an DMSO in unseren Tests verwendet wird bis zu 3%, was eine offensichtliche Wirkung auf <e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit wurde durch ein NIH Clinical Scientist Award K08NS002083 Entwicklung, einer Shervert Frazier Research Institute Grant, und ein NARSAD Young Investigator Award an Edgar A. Büttner unterstützt.
Materials
| Clozapine | Sigma | C6305 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 |
| Acetic acid (HAC) | Fisher | BP2401 |
| Sodium hydroxide(NaOH) | EMD | SX0590-13 |
| Hypochlorite | Sigma-Aldrich | 425044 |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | M1246-0006 |
| Low temperature incubator 815 | Precision Scientific | J1790-1B |
| Stereo microscope | Olympus | SZX12 |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 |
| 12-well tissue culture plate | BD Falcon | REF 353043 |
References
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