שיטות לחקר מנגנוני פעולה של אנטי פסיכוטיות סמים ב<em> Elegans Caenorhabditis</em
Summary
גישות לבדיקת ההשפעות של תרופות אנטיפסיכוטיות (APDs) בelegans Caenorhabditis הם הפגינו. מבחני מתוארים לבדיקת השפעות תרופה בפיתוח וכדאיות ועל קצב שאיבת בלוע. שיטות אלה חלות גם על ניסויי pharmacogenetic עם כיתות סמים אחרות מאשר APDs.
Abstract
elegans Caenorhabditis הוא אורגניזם גנטי פשוט מקובל בקנה מידה גדולה קדימה לאחור מסכי גנטיים והמסכים גנטיים כימיים. ג הגנום elegans כולל תרופה פוטנציאלית אנטיפסיכוטיות (APD) מטרות נשמרים בבני אדם, ובם גנים המקודדים חלבונים דרושים לסינתזת נוירוטרנסמיטר ולמבנה ותפקוד הסינפטי. חשיפת APD מייצרת עיכוב ו / או קטלני בנמטודות התפתחותיים באופן תלוי ריכוז. פנוטיפים אלה נגרמים, בין שאר, על ידי עיכוב הנגרם APD של בלוע שאיבת 1,2. לפיכך, פנוטיפ התפתחותית יש בסיס התוקפת, מה שהופך אותו לשימושי ללימודי pharmacogenetic של נוירולפטיות. כאן אנו מדגימים נהלים מפורטים לבדיקת השפעות APD בפיתוח נמטודות ושאיבת בלוע. עבור assay התפתחותי, עוברים מסונכרנים מונחים על מדיום נמטודות צמיחת צלחות (NGM) המכילות APDs, והשלבים של פיתוח aniאז Mals הם הבקיע יומי. עבור assay קצב שאיבת בלוע, מבוים בעלי חיים מבוגרים צעירים נבדקים על צלחות NGM המכילות APDs. מספר משאבות בלוע ליחידת זמן הוא רשם, ושיעור השאיבה מחושב. מבחני אלה יכולים לשמש ללימוד סוגים רבים אחרים של מולקולות קטנות או אפילו מולקולות גדולות.
Introduction
elegans Caenorhabditis הוא אורגניזם גנטי פשוט נוח למסכים בקנה מידה גדולה קדימה לאחור גנטיים והמסכים גנטיים כימיים. ג elegans הוא רגיש לספקטרום רחב של תרכובות ביו ולכן שמש בהצלחה להגדיר את מנגנוני פעולה של מגוון רחב של תרכובות מסוג זה. לדוגמא, תרכובות ביו למדו באמצעות פרמקוגנטיקה התולעת כוללת אגוניסטים קולטן האצטילכולין (למשל levamisole, ניקוטין, morantel, וpyrantel), חומרי הרדמה (למשל halothane), קפאין, חוסמי כולינסטרז (למשל aldicarb, lannate, וtrichlorfon), פלואוריד, GABA-קשורים תרכובות (למשל GABA וmuscimol), ivermectin, Paraquat, אסטרים phorbol, ותרופות הקשורים לסרוטונין (למשל סרוטונין וimiprimine) 3. יתר על כן, ג elegans שמש במשך מסכי מולקולה קטנה בקנה מידה גדולה, המאפשר גילוי של מתחם ביו חדשים וזיהוי של מטרות גנטיות רומן 4.
ג הגנום elegans כולל תרופה פוטנציאלית אנטיפסיכוטיות (APD) מטרות נשמרים בבני אדם, ובם גנים המקודדים חלבונים דרושים לסינתזת נוירוטרנסמיטר ולמבנה ותפקוד 5 הסינפטי. לכן, ג elegans Neurogenetics והצעת נוירוביולוגיה שיטות לגילוי מנגנונים מולקולריים רומן של פעולה של APDs. בנמטודות, חשיפת APD מוקדם בהתפתחות מייצרת עיכוב התפתחותי, ובריכוזים גבוהים יותר, קטלני 2,6. חשיפת APD במהלך הבגרות מייצרת פנוטיפים התנהגותיים. לדוגמא, חשיפת קלוזאפין מעכבת תנועה ושאיבת בלוע ומשפרת את הטלת ביצים 1,2,7.
עיכוב התפתחותי מושרה APD וקטלני הם פנוטיפים רבי עוצמה למסכים גנטיים כימיים בקנה מידה גדולה. פנוטיפים אלה הם מורכבים במידה שסבירה להניח שיש להם בשיא יותר מפעם אחת תאי והגנטיs. לכן, מסכי גנטיים כגון צפויים להניב מגוון רחב של מטרות תרופה עקיפות. עם זאת, המעבדה שלנו ביצעה מסכי גן מועמד ומסך RNAi הגנום למדכאים של עיכוב התפתחותי מושרה APD והקטלניות והתאוששה בהצלחה גנים אשר צפוי לקודד יעדים ישירים, ובם דופאמין, אינסולין, וקולטני אצטילכולין ניקוטינית 2,8. גם מסכי גנטיים המבוססים על התנהגויות הנגרמות APD במבוגרים הביאו לזיהוי מטרות APD רומן, וכעת אנו מאמתים מטרות ממסכים הן התפתחות והתנהגות ביונקים 7. לפיכך, גישה חסר חוליות כימיות גנטית כדי לגלות את המנגנונים מולקולריים רומן של פעולה של APDs מופיעה להיות ריאלי 5,8.
ג לוע elegans הוא איבר הכולל 20 נוירונים, 20 תאי שריר, ו20 תאי אבזר, עטופים בקרום במרתף. דומה ללב היונקים, הלוע הוא אוטונומיnd משאבות כל הזמן אוכל מהסביבה החיצונית 9. עיכוב של קצב שאיבת בלוע פשרות ספיגת מזון, וכך מוטציות או תרופות המעכבים עיכוב גורם שאיבת בלוע התפתחותית או לעצור 9. APDs לעכב את קצב שאיבת בלוע, והיוו בחלקו להשפעות שלהם על פיתוח ו1,2 כדאיות. כאן, אנו משתמשים קלוזאפין APD לא טיפוסי לדוגמא ירושלים להפגין מבחני תרופה לפיתוח נמטודות ושאיבת בלוע.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים שיטות לבדיקת ההשפעות של APDs על ההתפתחות וההתנהגות של ג elegans. DMSO או אתנול משמש כדי לפזר קלוזאפין, שכן התרופה היא יחסית בלתי מסיס במים. מכיוון שכבר דיווחו ממסים להשפיע ג הביולוגיה elegans 12, DMSO-לבד או בקבוצות שליטת אתנול לבד הן חיוניות. הריכ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכה על ידי הפרס פיתוח מדען הקליני K08NS002083-NIH, גרנט Shervert פרייזר מכון המחקר, ופרס לחוקר צעיר NARSAD לאדגר א Büttner.
Materials
| Clozapine | Sigma | C6305 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 |
| Acetic acid (HAC) | Fisher | BP2401 |
| Sodium hydroxide(NaOH) | EMD | SX0590-13 |
| Hypochlorite | Sigma-Aldrich | 425044 |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810 000.017 |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | M1246-0006 |
| Low temperature incubator 815 | Precision Scientific | J1790-1B |
| Stereo microscope | Olympus | SZX12 |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher Scientific | NC9434271 |
| 12-well tissue culture plate | BD Falcon | REF 353043 |
References
- Donohoe, D. R., Jarvis, R. A., Weeks, K., Aamodt, E. J., Dwyer, D. S. Behavioral adaptation in C. elegans produced by antipsychotic drugs requires serotonin and is associated with calcium signaling and calcineurin inhibition. Neurosci. Res. 64, 280-289 (2009).
- Karmacharya, R., et al. Clozapine interaction with phosphatidyl inositol 3-kinase (PI3K)/insulin-signaling pathway in Caenorhabditis elegans. Neuropsychopharmacology. 34, 1968-1978 (2009).
- Rand, J. B., Johnson, C. D., Estein, H. F., Shakes, D. C. . Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 187-204 (1995).
- Kwok, T. C., et al. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441, 91-95 (2006).
- Wang, X., Sliwoski, G. R., Buttner, E. A. The relevance of Caenorhabditis elegans genetics for understanding human psychiatric disease. Harv. Rev. Psychiatry. 19, 210-218 (2011).
- Donohoe, D. R., Aamodt, E. J., Osborn, E., Dwyer, D. S. Antipsychotic drugs disrupt normal development in Caenorhabditis elegans via additional mechanisms besides dopamine and serotonin receptors. Pharmacol. Res. 54, 361-372 (2006).
- Karmacharya, R., et al. Behavioral effects of clozapine: involvement of trace amine pathways in C. elegans and M. musculus. Brain Res. 1393, 91-99 (2011).
- Saur, T., et al. A Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans Identifies the Nicotinic Acetylcholine Receptor Subunit ACR-7 as an Antipsychotic Drug Target. PLoS Genet. 9, (2013).
- Avery, L., You, Y. J. . C. elegans feeding. WormBook, ed. The C. elegans Research Community, doi:10.1895/wormbook.1.150.1. , (2012).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. 47, (2011).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T., Estein, H. F., Shakes, D. C. . Carnorhabditis elegans Modern Biological Analysis of an Organism. 48, 3-29 (1995).
- Davis, J. R., Li, Y., Rankin, C. H. Effects of developmental exposure to ethanol on Caenorhabditis elegans. Alcohol Clin. Exp. Res. 32, 853-867 (2008).
- Kage-Nakadai, E., et al. Two very long chain fatty acid acyl-CoA synthetase genes, acs-20 and acs-22, have roles in the cuticle surface barrier in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5, (2010).
- Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis. Dev. Biol. 317, 549-559 (2008).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. J. Vis. Exp. (51), (2011).
