إثراء وتطهير الخلايا الجذعية الجنينية البشرية عن طريق الكشف عن مستضدات سطح الخلية باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة TG30 و GCTM-2
Summary
ونصف استخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة TG30 (CD9) وGCTM-2 للكشف المشترك عن مستضدات سطح الخلية عن طريق فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) لتحديد وإثراء الخلايا الجذعية الجنينية البشرية الحية (hESC) باستخدام الاختيار الإيجابي وكذلك استخدام الاختيار السلبي لتطهير hESCs من مجموعة خلايا مختلطة.
Abstract
يمكن للخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) أن تجدد نفسها إلى أجل غير مسمى في المختبر، ومع الإشارات المناسبة يمكن حثها على التفريق إلى جميع أنساب الخلايا الجسدية المحتملة. يمكن استخدام مشتقات hESC المتمايزة في علاجات الزرع لعلاج مجموعة متنوعة من الأمراض التنكسية للخلايا. ومع ذلك، عادة ما تسفر بروتوكولات التمايز hESC عن خليط من أنواع الخلايا المستهدفة وغير المستهدفة، فضلا عن الخلايا المتبقية غير المتمايزة. من أجل ترجمة مشتقات hESC المتمايزة من المختبر إلى العيادة ، من المهم أن تكون قادرا على التمييز بين الخلايا غير المتمايزة (متعددة القدرات) والخلايا المتمايزة ، وتوليد طرق لفصل هذه المجموعات السكانية. لا يمكن تحقيق التطبيق الآمن لأنواع الخلايا الجسدية المشتقة من hESC إلا مع مجموعات خالية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات ، حيث يمكن أن تحفز hESCs المتبقية الأورام المعروفة باسم الأورام المسخية بعد الزرع. وتحقيقا لهذه الغاية، نقوم هنا بوصف منهجية للكشف عن المستضدات السطحية المرتبطة بالخلايا المتعددة الخلايا مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة TG30 (CD9) وGCTM-2 عن طريق فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) لتحديد TG30 Hi-GCTM-2Hi hESCs باستخدام الاختيار الإيجابي. باستخدام الاختيار السلبي مع منهجية TG30/GCTM-2 FACS ، تمكنا من اكتشاف وتطهير hESCs غير المتمايزة في المجموعات السكانية التي تمر بمرحلة مبكرة جدا من التمايز (TG30Neg-GCTM-2Neg). في دراسة أخرى، عينات متعددة القدرات خالية من الخلايا الجذعية من TG30متمايزةNeg-GCTM-2خلايا Neg التي تم اختيارها باستخدام بروتوكول TG30/GCTM-2 FACS لم تشكل المسخ زرع مرة واحدة في الفئران المناعية للخطر، ودعم قوة بروتوكولنا. من ناحية أخرى، TG30/GCTM-2 FACS بوساطة التمرير المتتالية من TG30 متعدد القدرات المخصبمرحبا-GCTM-2مرحبا hESCs لم يؤثر على قدرتها على تجديد الذات في المختبر أو متعددة الجوهرية. لذلك، فإن خصائص منهجية TG30/GCTM-2 FACS توفر فحصا حساسا للحصول على مجموعات غنية للغاية من hPSC كمدخلات لإجراء فحوصات التمايز وتخليص hESC الورمي المحتمل (أو المتبقي) من مجموعات الخلايا المشتقة.
Introduction
تشمل HPSC (hPSC) الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) والخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من قبل الإنسان (hIPSC). يمكن أن تجدد HPSC نفسها إلى أجل غير مسمى في ظروف ثقافية مناسبة دون أن تفقد قدرتها المعروفة باسم “متعددة”. يعرف تعدد الخلايا بأنه إمكانية تمييز الخلية إلى أي نسب خلايا جسدية بشكل أساسي بما في ذلك الخلايا الممثلة لكل طبقة من طبقات الخلايا الجرثومية الجنينية الثلاث. توفر الإمكانات الرائعة ل hPSC وسيلة لمجموعة كبيرة ومتنوعة من التطبيقات القائمة على الخلايا بما في ذلك الخيارات العلاجية. على سبيل المثال ، هناك اضطرابات تنطوي على موت الخلايا وانحطاطها ، حيث تتعرض الوظائف الطبيعية للخلايا في جسم الإنسان للخطر ، كما هو الحال في قصور القلب وإصابات العمود الفقري والسكري ومرض باركنسون وبعض أنواع السرطان وغيرها من الأمراض السريرية. المرضى الذين يعانون من هذه الشروط يمكن أن تعالج عن طريق زرع خلايا جسدية صحية ووظيفية التي تم اشتقاقها من hPSC في المختبر. ومع ذلك، فإن بروتوكولات التمايز hPSC الحالية ليست فعالة 100٪ وتسفر عن خليط من أنواع الخلايا المستهدفة وغير المستهدفة، فضلا عن hPSCs المتبقية التي لم تخضع للتمايز، بدلا من الاستمرار في التجديد الذاتي1-3. وجود حتى عدد قليل من hPSC في عينة من الخلايا الجسدية المشتقة من hPSC المخصصة لزرعها في المرضى يشكل خطرا سريريا خطيرا لأن هذه الخلايا بطبيعتها المتأصلة لتشكيل أنسجة جميع الطبقات الجرثومية الجنينية الثلاث ، يمكن أن تشكل في الجسم الحي نوعا من الورم المعروف باسم المسخ. لذلك ، يمكن اعتبار مجموعات الخلايا المستهدفة فقط التي تقرر أنها خالية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات آمنة لزرعها في المرضى. وهناك عدة نهج أبلغ عنها لاحتمال إنجاز تطهير مركبات الكربون الهيدروفلورية المتبقية بعد التمايز (انظر الاستعراض بولانكو ولاسليت4). وقد أبلغنا سابقا عن استخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة TG30 (CD9) وGCTM-2 إلى جانب فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) لتحديد الخلايا الجذعية متعددة القدرات والتمييز بينها وبين الخلايا التي تمر بمرحلة مبكرة من التمايز في ثقافات خطوط hESC5-7.
إحدى مزايا استخدام الأجسام المضادة للكشف عن مستضدات سطح الخلية هي أن الخلايا المستهدفة عادة ما تكون قابلة للحياة بعد ربط الأجسام المضادة و / أو وضع العلامات. لذلك، يمكن جمع الخلايا المستهدفة بعد وضع العلامات على الأجسام المضادة وإعادة استزراعها للتوسع وتطبيقات أخرى قبل زرعها. ومن المحاذير بالنسبة للمضادات السطحية للخلايا المعبر عنها في hPSC أنها ليست مقصورة على المرحلة المتعددة القدرات، وفي كثير من الحالات يعاد التعبير عنها مؤقتا أثناء التنمية، وبالتالي سيتم اكتشافها في بعض أنواع الخلايا المتمايزة. لذلك، إذا كان الهدف هو استخدام الأجسام المضادة للكشف عن الخلايا البشرية متعددة القدرات وتطهيرها من عينة من الخلايا المشتقة من hPSC، يجب ألا تتفاعل الأجسام المضادة المختارة أيضا مع المستضدات على أنواع الخلايا المتمايزة المحددة المخصصة للزرع. لسوء الحظ، هناك أعداد محدودة من الأجسام المضادة التي تكشف علامات سطح الخلية على hPSCs الحية 4،مما يجعل خيارات الاختيار محدودة. وبالإضافة إلى ذلك، أشارت بعض الدراسات إلى أن الكشف عن علامة واحدة سطح الخلية ليست كافية للقضاء على جميع hPSC، مما يشير إلى أن أي محاولة للقضاء على جميع الخلايا الفرعية متعددة القدرات hPSC يجب أن تعتمد على الأساليب التي تستخدم اثنين أو أكثر من الأجسام المضادة الكشف عن epitopes مختلفة التي أعرب عنها hPSCs 9-10. وكما ذكر أعلاه، فإن الخلايا المشتقة من hPSC فقط التي يمكن تحديدها على أنها مجموعات خلايا جذعية متعددة القدرات خالية من الخلايا هي الخلايا المناسبة لزرع البشر. قد لا يتحقق الوصول إلى هذا المستوى من الصرامة بتمريرة واحدة من خلال تقنية فرز الخلايا بوساطة الأجسام المضادة. وقد يلزم إعادة زراعة السكان المخصبين من الخلايا المستهدفة المتمايزة والجولات اللاحقة لفرز الخلايا للحصول نهائيا على عينات متعددة القدرات خالية من الخلايا الجذعية.
في مختبرنا، قمنا على نطاق واسع بتوصيف جسمين مضادين لسطح الخلية hES، TG30 (CD9) و GCTM-2، للكشف عن الخلايا الحية متعددة القدرات. وقد أظهرت دراساتنا أن الكشف المشترك بين كل من TG30 وGCTM-2 يرتبط ارتباطا وثيقا مع التعبير عن الجينات الكنسية المرتبطة pluripotency في خطوط hESC 5-7. TG30/GCTM-2 FACS مناعة أظهرت باستمرار أن الثقافات hESC تشكل تدرجا كميا مستمرا للتعبير TG30/GCTM-2 5-7. لقد أنشأنا بشكل تعسفي أربعة مجموعات سكانية (P) من الخلايا داخل هذا التدرج TG30/GCTM-2: P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)، P5 (TG30Low-GCTM-2Low)، P6 (TG30 Mid-GCTM-2Mid)و P7 (TG30 Hi -GCTM-2Hi) 5-7. وقد أظهر وصفنا لهذه المجموعات خلايا P4 و P5 و P6 و P7 أن الكسور الفرعية P6 و P7 تعبر عن عدد كبير من الجينات المرتبطة بالانبعاس إلى متعددة الأشكال وتشكل بكفاءة مستعمرات تشبه الجذعية عند إعادة زراعة ما بعد FACS 2-3. من ناحية أخرى، P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)الخلايا تعبر عن عدد كبير من علامات التمايز وتشكل أنواع الخلايا المتمايزة تلقائيا التي تحدث عادة في توسيع ثقافات خطوط hESC 5-6. قررنا اختبار إمكانات FACS TG30/GCTM-2 للإزالة الانتقائية لمركبات الكربون الهيدروفلورية المتبقية بعد التمايز في المراحل المبكرة، وكذلك لإثراء مجموعات الخلايا الجذعية متعددة القدرات. البروتوكول المذكور أدناه يبين كيفية جمع وإعادة زراعة P4 متمايزة (TG30Neg-GCTM-2Neg) خلايا ما بعد FACS لإنجاز تطهير P7 متعدد القدرات (TG30مرحبا-GCTM-2مرحبا). وعلاوة على ذلك، فإننا نفسر أيضا جمع وإعادة زراعة خلايا P7 متعددة القدرات (TG30Hi-GCTM-2Hi)للحصول على ثقافة غنية من الخلايا متعددة القدرات، والتي يمكن استخدامها لاحقا كمحتوى مدخلات محدد لزيادة كفاءة واتساق المقايسات التفاضلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في السياق السريري ، أنواع الخلايا الجسدية المتمايزة هي المنتج النهائي المطلوب للزرع والتطبيقات العلاجية ، وhPSC هي مصدر ذاتي التجديد وقابل للتطوير لتوليد تلك الخلايا الجسدية أو ذريتها في المختبر. وجود hESCs المتبقية غير المتمايزة مع إمكانية متأصلة لتشكيل المسخ هو خطر على السلامة عند النظر في الخلايا الجسدية المشتقة من hESC لزرعها في المرضى. لمراجعة هذه المخاطر وغيرها من المخاطر المرتبطة بالعلاج بالخلايا يرجى الاطلاع على شارب وآخرون. 16 ولذلك، لتحقيق مثل هذه التطبيقات، من الضروري أن يهدف الباحثون إلى توليد مجموعات مستهدفة من الخلايا التي هي أيضا متعددة القدرات خالية من الخلايا الجذعية. وتحقيقا لهذه الغاية، فإننا نثبت هنا أنه باستخدام منهجية TG30/GCTM-2 FACS، من الممكن رصد وجود خلايا متعددة القدرات (TG30Hi-GCTM-2Hi)في مجموعة خلايا متمايزة والحصول على مشتقات قابلة للحياة متمايزة من hESC يمكن إثراءها وإعادة استزراعها بعد FACS. على الرغم من أنه ليس من الممكن الحصول على عينات خالية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات بنسبة 100٪ مع تمريرة واحدة من بروتوكولنا ، يمكن إعادة زراعة مشتقات hESC المخصبة وبعد تمرير متتالي يتم تحقيق نقاء الخلايا الجسدية بنسبة 100٪. كما أن الجدوى الواضحة للخلايا الجسدية للتوسع بعد FACS تسمح أيضا بإنتاج أعداد كافية من الخلايا المناسبة لعلاجات الزرع المحتملة.
دفعتنا النتائج المشجعة لهذه الدراسة التجريبية إلى إجراء تحقيق أكثر شمولا باستخدام بروتوكول TG30/GCTM-2 في دراسة مقارنة مع العديد من خطوط الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريا (hiPSC)15. في تلك الدراسة، وجدنا أن العينات الخالية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي تم الحصول عليها باستخدام بروتوكول FACS TG30/GCTM-2 لم تولد المسخ عند زرعها في الفئران المحرومة من المناعة. لذلك، يمكننا أن نقول بثقة أنه مع استخدام هذا البروتوكول في المختبر، في مرحلة مبكرة التمايز ثقافات الخلية مصممة على أن تكون خالية من TG30 متعدد القدراتمرحبا-GCTM-2مرحبا الخلايا لا تتطور المسخ في الجسم الحي. وهذا يدعم بقوة قوة المقايسة لدينا، وتوفير نهج محتمل للقضاء على خطر تكوين المسخ قبل استخدام الخلايا المشتقة من hPSC في التطبيقات السريرية.
وعلى العكس من ذلك، فإننا نظهر أيضا أن TG30/GCTM-2 FACS يمكن استخدامها في استرداد مجموعة خلايا متعددة القدرات مع مستوى عال من التعبير عن هذين المستضدين السطحيين (TG30Hi-GCTM-2Hi). وقد أظهرت الدراسات السابقة أن TG30مرحبا-GCTM-2مرحبا الخلايا تظهر أعلى ارتباط مع OCT4مرحبا التعبير وتشكل أكبر عدد من المستعمرات مثل hESC5,6,13,15. ولذلك السبب أن يتم تنشيط شبكة متعددة المستويات في مستوياتها القصوى في TG30مرحبا-GCTM-2مرحبا التعبير عن الخلايا. ونحن نعتبر أن استخدام بروتوكولنا TG30/GCTM-2 FACS واسترجاع P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)يمكن أن تسمح لتنقية واسعة النطاق لثقافات hESC الحية المخصبة ، كمدخلات لمقايسات التمايز.
في الختام، نحن نثبت هنا إمكانية عمليات الفحص الخاصة ب FACS استنادا إلى التعبير المشترك للمضادين السطحيين TG30 و GCTM-2 لكل من تطهير وإثراء hESCs. ومن المرجح أيضا أن تكون الدراسات المقبلة التي تحتوي على بروتوكولات للتمايز الموجه بين مركبات الكربون الهيدروفلورية مفيدة فيما يتعلق بهذه الإمكانية. ونحن ندرك أنه في بعض المقايسات حيث المتمايزة hESC-المشتقات تعبر مؤقتا TG30 (CD9) أو GCTM-2، قد لا تكون هذه الأجسام المضادة اثنين مناسبة أو كافية لتطهير الخلايا متعددة القدرات من السكان المتمايزة في نقطة زمنية معينة في المقايسة6. لذلك، هناك حاجة مستمرة لإيجاد أجسام مضادة جديدة تعترف على وجه التحديد بمركبات hESCs الحية للتغلب على الحد المحتمل من التفاعل المتبادل مع بعض أنواع الخلايا المتباينة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر منشأة StemCore في جامعة موناش على توفير خطوط hESC ومرفق FlowCore في جامعة موناش لخدمات FACS. وقد دعم هذا العمل منح بحثية من المركز الأسترالي للخلايا الجذعية، وبرنامج منحة أبحاث الخلايا الجذعية التابع لحكومة نيو ساوث ويلز وحكومة فيكتوريا للجميع. ALL هو الباحث الشريك في مبادرة البحوث الخاصة لمجلس البحوث الأسترالي (ARC) في علوم الخلايا الجذعية، الخلايا الجذعية في أستراليا.
Materials
| Short Name | Company | Catalog Number | Long Name |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Long Name: Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | Long Name: GlutaMAX supplement |
| Nonessential Amino Acids | Life Technologies | 11140050 | Long Name: MEM Nonessential Amino Acids Solution |
| Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | Long Name: 2-Mercaptoethanol |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | Long Name: Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, no calcium, no magnesium |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604039 | Long Name: TrypLE Express (1x), no Phenol Red |
| AF-488 | Life Technologies | A21131 | Long Name: Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a |
| AF-647 | Life Technologies | A21238 | Long Name: Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgM |
| PE-anti IgG2a | Life Technologies | P21139 | Long Name: R-Phycoerythrin Goat Anti-Mouse IgG2a (γ2a) Conjugate |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Long Name: Penicillin-Streptomycin, Liquid |
| Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Long Name: Sterile Distilled Water |
| PI | SIGMA | P4864 | Long Name: Propidium iodide solution |
| FBS | SIGMA | 12203C | Long Name: Fetal Bovine Serum |
| Gelatin | SIGMA | G-1890 | Long Name: Gelatin from porcine skin |
| Human FGF-2 | Millipore | GF003AF-100UG | Long Name: Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Long Name: Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized |
| 70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Long Name: Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
| 35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
| 5 ml Polystyrene round bottom test tube | Becton Dickinson | 352054 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, sterile |
| IgG2a Isotype Control | Becton Dickinson | 554126 | Long Name: Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control |
| IgM Isotype Control | Becton Dickinson | 553472 | Long Name: Purified Mouse IgM, κ Isotype Control |
| PE-CD90.2 | Becton Dickinson | 553014 | Long Name: PE Rat Anti-Mouse CD90.2 |
| 8-peaks calibration | Becton Dickinson | 559123 | Long Name: Rainbow Calibration Particles (8 peaks) |
| 50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | Long Name: 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | Long Name: CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
| TG30 | Merck Millipore | MAB4427 | Long Name: TG30 Antibody, clone TG30 |
| GCTM-2 | Merck Millipore | MAB4346 | Long Name: GCTM-2 is not commercially available but TG343 and equivalent monoclonal antibody is |
| Table 4. List of materials and reagent | |||
| [header] | |||
| FACS machine | Becton Dickinson | FACSVantage SE with FACSDiva option | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Table 5. List of equipment. |
References
- Pera, M. F., Tam, P. P. Extrinsic regulation of pluripotent stem cells. Nature. 10 (7299), 713-720 (2010).
- Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Healy, L., Young, L., Stacey, G. Standardization of pluripotent stem cell cultures for toxicity testing. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8 (2), 239-257 (2012).
- Miura, K., Okada, Y., Aoi, T., Okada, A., Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Koyanagi, M., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines. Nat. Biotechnol. 27 (8), 743-745 (2009).
- Polanco, J. C., Laslett, A. L., Lenka, N. Safety Assessment of Reprogrammed Cells Prior to Clinical Applications: Potential Approaches to Eliminate Teratoma Formation. Pluripotent Stem Cells. , (2013).
- Laslett, A. L., Grimmond, S., et al. Transcriptional analysis of early lineage commitment in human embryonic stem cells. BMC Dev. Biol. 7, 12 (2007).
- Kolle, G., Ho, M., et al. Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling. Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).
- Zhou, Q., Chy, H., Laslett, A. L. Preparation of defined human embryonic stem cell populations for transcriptional profiling. Current protocols in stem cell biology. Chapter 1, Unit1B 7 (2010).
- Fong, C. Y., Peh, G. S., Gauthaman, K. Separation of SSEA-4 and TRA-1-60 labelled undifferentiated human embryonic stem cells from a heterogeneous cell population using magnetic-activated cell sorting (MACS) and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Stem Cell Rev. 5, 72-80 (2009).
- Schriebl, K., Satianegara, G., et al. Selective removal of undifferentiated human embryonic stem cells using magnetic activated cell sorting followed by a cytotoxic antibody. Tissue Eng. Part A. 18, 899-909 (2012).
- Adewumi, O., Aflatoonian, B., et al. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25, 803-816 (2007).
- Michalska, A. E. Isolation and propagation of mouse embryonic fibroblasts and preparation of mouse embryonic feeder layer cells. Current protocols in stem cell biology. Chapter 1, Unit1C 3 (2007).
- Hough, S. R., Laslett, A. L., Grimmond, S. B., Kolle, G., Pera, M. F. A continuum of cell states spans pluripotency and lineage commitment in human embryonic stem cells. PLoS One. 4, e7708 (2009).
- Filipczyk, A. A., Laslett, A. L., Mummery, C., Pera, M. F. Differentiation is coupled to changes in the cell cycle regulatory apparatus of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 1, 45-60 (2007).
- Polanco, J. C., Ho, M. S. H., Wang, B., Zhou, Q., Wolvetang, E., Mason, E., Wells, C., Kolle, G., Grimmond, S. M., Bertoncello, I., O’Brien, C., Laslett, A. L. Identification of unsafe human IPSC lines using a robust surrogate assay for pluripotency. Stem Cells. 31 (8), 1498-1510 (2013).
- Sharpe, M. E., Morton, D., Rossi, A. Nonclinical safety strategies for stem cell therapies. Toxicol. Appl. Pharmacol. 262 (3), 223-231 (2012).
