העשרה וטיהור של תאי גזע עובריים אנושיים על ידי זיהוי אנטיגנים משטח התא באמצעות נוגדנים חד שבטיים TG30 ו GCTM-2
Summary
אנו מתארים את השימוש בנוגדנים חד שבטיים TG30 (CD9) ו- GCTM-2 לגילוי משולב של אנטיגנים משטח התא באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) לזיהוי והעשרה של תאי גזע עובריים אנושיים חיים (hESC) באמצעות בחירה חיובית וגם שימוש בבחירה שלילית כדי לטהר hESCs מאוכלוסיית תאים מעורבת.
Abstract
תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) יכולים לחדש את עצמם ללא הגבלת זמן במבחנה, ועם הרמזים המתאימים ניתן לגרום להבדיל לתוך פוטנציאל כל שושלת התא סומטי. נגזרות hESC מובחנות יכולות לשמש באופן פוטנציאלי בטיפולי השתלה לטיפול במגוון מחלות ניווניות של תאים. עם זאת, פרוטוקולי בידול hESC בדרך כלל מניבים תערובת של סוגי תאים מובחנים של יעדים ומחוץ ליעד, כמו גם תאים לא מובחנים שיורית. לתרגום נגזרות hESC מובחנות מהמעבדה למרפאה, חשוב להיות מסוגלים להפלות בין תאים לא מובחנים (פלוריפוטנטיים) לבין תאים מובחנים, וליצור שיטות להפרדת אוכלוסיות אלה. יישום בטוח של סוגי תאים סומטיים שמקורם ב- hESC יכול להתבצע רק עם אוכלוסיות נטולות תאי גזע פלוריפוטנטיים, שכן שאריות hESCs יכולות לגרום לגידולים הידועים בשם טרטומות לאחר ההשתלה. לקראת מטרה זו, כאן אנו מתארים מתודולוגיה לגילוי אנטיגנים משטח תא הקשורים pluripotency עם נוגדנים חד שבטיים TG30 (CD9) ו GCTM-2 באמצעות מיון תאים המופעלים פלואורסצנטיות (FACS) לזיהוי של pluripotent TG30היי-GCTM-2היי hESCs באמצעות בחירה חיובית. באמצעות בחירה שלילית עם מתודולוגיית ה- FACS TG30/GCTM-2 שלנו, הצלחנו לזהות ולטהר HESCs לא מובחנים באוכלוסיות שעברו בידול בשלב מוקדם מאוד (TG30Neg-GCTM-2Neg). במחקר נוסף, דגימות ללא תאי גזע פלוריפוטנטיים של תאי TG30Neg-GCTM-2Neg מובחנים שנבחרו באמצעות פרוטוקול FACS TG30/GCTM-2 שלנו לא יצרו טרטומות שהושתלו בעבר בעכברים עם פגיעה במערכת החיסון, התומכים בחוזק הפרוטוקול שלנו. מצד שני, TG30 /GCTM-2 FACS בתיווך פסוקים רצופים של TG30 Hi-GCTM-2Hi hESCs מועשרים לא השפיעו על יכולתם לחדש את עצמם במבחנה או על הפלוריפוטנציה המהותית שלהם. לכן, המאפיינים של מתודולוגיית ה- FACS TG30/GCTM-2 שלנו מספקים מבחנים רגישים להשגת אוכלוסיות מועשרות מאוד של hPSC כתשומות למבחני בידול ולפטור hESC גידולי פוטנציאלי (או שיורית) מאוכלוסיות תאים נגזרים.
Introduction
HPSC (hPSC) כוללים תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) ותאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם (hIPSC). HPSC יכול לחדש את עצמו ללא הגבלת זמן בתנאי תרבות מתאימים מבלי לאבד את יכולתם המכונה “pluripotency”. Pluripotency מוגדר כפוטנציאל לתא להבדיל לתוך כל שושלת תאים סומטית כולל תאים המייצגים כל אחת משלוש שכבות תא נבט עוברי. הפוטנציאל המדהים של hPSC מספק אמצעי למגוון רחב של יישומים מבוססי תאים כולל אפשרויות טיפוליות. לדוגמה, ישנן הפרעות הכרוכות במוות תאי ונ ניוון, שבהן פונקציונליות תקינה של תאים בגוף האדם נפגעת, כמו באי ספיקת לב, פציעות בעמוד השדרה, סוכרת, מחלת פרקינסון, כמה סוגי סרטן ופתולוגיות קליניות אחרות. חולים הסובלים מתנאים אלה עלולים להיות מטופלים על ידי השתלת תאים סומטיים בריאים ותפקודיים שנגזרו מ- hPSC במעבדה. עם זאת, פרוטוקולי הבידול הנוכחיים של hPSC אינם יעילים ב -100% ומניבים תערובת של סוגי תאים מובחנים של יעדים וסוגי תאים מחוץ ליעד, כמו גם שאריות hPSCs שלא עברו בידול, במקום זאת ממשיכים לחדש את עצמם1-3. הנוכחות של אפילו מספר קטן של hPSC במדגם של תאים סומטיים שמקורם hPSC המיועד להשתלה לחולים מהווה סיכון קליני רציני כמו תאים אלה מטבעם הטבעי כדי ליצור רקמות של כל שלוש שכבות נבט עוברי, יכול להיווצר vivo סוג של גידול המכונה טרטומה. לכן, רק אוכלוסיות תאי יעד שנקבעו כנקיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים יכולות להיחשב בטוחות להשתלה בחולים. ישנן מספר גישות שדווחו כדי להשיג פוטנציאל טיהור של hPSCs שיורית בעקבות בידול, (לסקירה ראה פולנקו ולאסלט4). דיווחנו בעבר על השימוש בנוגדנים חד שבטיים TG30 (CD9) ו- GCTM-2 יחד עם מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) כדי לזהות תאי גזע פלוריפוטנטיים ולהפלות אותם מתאים העוברים שלב מוקדם של בידול בתרבויות של קווי hESC5-7.
אחד היתרונות של שימוש בנוגדנים כדי לזהות אנטיגנים משטח התא הוא כי תאי היעד הם בדרך כלל קיימא לאחר איגוד נוגדנים ו / או תיוג. לכן, תאי היעד ניתן לאסוף לאחר תיוג נוגדנים recultured להתרחבות ויישומים נוספים לפני ההשתלה. אזהרה אחת עבור אנטיגנים משטח התא לידי ביטוי על hPSC היא כי הם אינם בלעדיים לשלב pluripotent והם במקרים רבים מחדש לידי ביטוי זמני במהלך הפיתוח ולכן יזוהו בכמה סוגי תאים מובחנים. לכן, אם המטרה היא להשתמש בנוגדנים כדי לזהות תאים פלוריפוטנטיים אנושיים ולנטהר אותם מדגם של תאים שמקורם ב- hPSC, נוגדנים נבחרים לא צריכים להגיב גם עם אנטיגנים על סוגי התאים המבודלים הספציפיים המיועדים להשתלה. למרבה הצער, ישנם מספר מוגבל של נוגדנים המזהים סמני משטח תא על hPSCs חי 4, מה שהופך מוגבל את האפשרויות לבחירה. בנוסף, מספר מחקרים הצביעו על כך שזיהוי של סמן אחד משטח תא יחיד אינו מספיק כדי לחסל את כל hPSC, מה שמרמז כי כל ניסיון לחסל את כל תת-אוכלוסיות ה- hPSC pluripotent צריך להסתמך על שיטות המשתמשות בשני נוגדנים או יותר המזהים אפיטופים שונים המבוטאים על ידי hPSCs 9-10. כפי שהוזכר לעיל, רק תאים שמקורם hPSC שניתן לקבוע כמו אוכלוסיות תאים ללא תאי גזע pluripotent מתאימים להשתלה אנושית. הגעה לרמה זו של ההקפדה לא ניתן להשיג עם מעבר אחד באמצעות טכנולוגיית מיון תאים בתיווך נוגדנים. Reculture של האוכלוסייה המועשרת של תאי יעד מובחנים וסבבים הבאים של מיון תאים עשויים להידרש כדי להשיג באופן סופי דגימות ללא תאי גזע פלוריפוטנטיים.
במעבדה שלנו, אפיינו בהרחבה שני נוגדני פני תא hES, TG30 (CD9) ו- GCTM-2, לגילוי תאים פלוריפוטנטיים חיים. המחקרים שלנו הראו כי זיהוי משולב של TG30 ו- GCTM-2 מאוד בקורלציה עם הביטוי של גנים הקשורים פלוריפוטנציה קנונית בשורות hESC 5-7. TG30/GCTM-2 חיסוני FACS הראה באופן עקבי כי תרבויות hESC מהוות שיפוע רציף כמותי של ביטוי TG30/GCTM-2 5-7. הקמנו באופן שרירותי ארבע אוכלוסיות (P) של תאים בתוך שיפוע TG30/GCTM-2 זה: P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg),P5 (TG30נמוך-GCTM-2נמוך),P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid)ו- P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) האפיון שלנו של אוכלוסיות אלה P4, P5, P6 ו- P7 תאים הראה כי P6 ו P7 תתי-שברים להביע מספר רב של גנים הקשורים pluripotency ביעילות ליצור מושבות דמויי גזע כאשר recultured שלאחר FACS 2-3. מצד שני, P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)תאים להביע מספר רב של סמני בידול ומהווים את סוגי התאים מובחנים באופן ספונטני המתרחשים בדרך כלל בהרחבת תרבויות של קווי hESC 5-6. החלטנו לבדוק את הפוטנציאל של FACS TG30/GCTM-2 שלנו לחיסול סלקטיבי של שאריות hPSCs לאחר בידול בשלב מוקדם, וגם להעשרה של אוכלוסיות תאי גזע פלוריפוטנטיים. הפרוטוקול המתואר להלן מראה כיצד לאסוף ולפתוח מחדש תאים מובחנים P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)לאחר FACS כדי להשיג טיהור של P7 פלוריפוטנטי (TG30Hi-GCTM-2Hi). יתר על כן, אנו מסבירים גם את האוסף וההתרבות של תאי P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)כדי להשיג תרבות מועשרת של תאים פלוריפוטנטיים, אשר לאחר מכן יכול לשמש כאוכלוסיית קלט מוגדרת כדי להגדיל את היעילות והעקביות של מבחני הבידול.
Protocol
Representative Results
Discussion
בהקשר הקליני, סוגי תאים סומטיים מובחנים הם המוצר הרצוי הסופי להשתלה ויישומים טיפוליים, ו- hPSC הם מקור לחידוש עצמי ומדרגי ליצירת אותם תאים סומטיים או אבותיהם במעבדה. נוכחותם של שאריות hESCs מובחנות עם פוטנציאל אינהרנטי להיווצרות טרטומה היא סיכון בטיחותי כאשר בוחנים תאים סומטיים שמקורם ב- hESC להשתלה בחולים. לסקירה של זה וסיכונים אחרים הקשורים לטיפול בתאים אנא ראה שארפ ואח ‘. 16 לכן, כדי לממש יישומים כאלה, זה הכרחי כי החוקרים שואפים ליצור אוכלוסיות תא היעד כי הם גם פלוריפוטנטי תאי גזע חינם. לקראת מטרה זו, אנו מראים כאן כי באמצעות מתודולוגיית TG30/GCTM-2 FACS שלנו ניתן לפקח על נוכחותם של תאים פלוריפוטנטיים (TG30Hi-GCTM-2Hi)באוכלוסיית תאים מבדילה ולקבל נגזרות מובנות hESC קיימא שניתן להעשיר ולשקול מחדש לאחר FACS. למרות שלא ניתן להשיג 100% דגימות ללא תאי גזע פלוריפוטנטיים עם מעבר אחד של הפרוטוקול שלנו, נגזרות hESC מועשר ניתן לחשב מחדש ולאחר מעבר רצוף 100% טוהר תא סומטי מושגת. הכדאיות המוכחה של תאים סומטיים להתרחבות שלאחר FACS גם מאפשרת ייצור של מספר מספיק של תאים המתאימים לטיפולי השתלה פוטנציאליים.
התוצאות המעודדות של מחקר פיילוט זה גרמו לנו לבצע חקירה מקיפה יותר באמצעות פרוטוקול TG30/GCTM-2 שלנו במחקר השוואתי עם מספר תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC) קווים15. במחקר זה, מצאנו כי דגימות ללא תאי גזע פלוריפוטנטיים שהושגו באמצעות פרוטוקול FACS TG30/GCTM-2 שלנו לא יצרו טרטומות כאשר הושתלו בעכברים ללא חיסון. לכן, אנו יכולים לציין בביטחון כי עם השימוש בפרוטוקול זה במבחנה, בשלב מוקדם בידול תרביות התא נקבע להיות חופשי של תאי pluripotent TG30 Hi-GCTM-2 Hi אינם מפתחים טרטומות vivo. זה תומך מאוד את החוסן של ההסתערות שלנו, מתן גישה פוטנציאלית כדי למנוע את הסיכון של היווצרות טרטומה לפני השימוש בתאים שמקורם hPSC ביישומים קליניים.
לעומת זאת, אנו גם מראים כי TG30 / GCTM-2 FACS assay ניתן להשתמש כדי לאחזר אוכלוסיית תאים pluripotent עם רמה גבוהה של ביטוי של שני אנטיגנים אלה פני השטח (TG30היי-GCTM-2היי). מחקרים קודמים הראו כיתאי Hi-GCTM-2Hi של TG30 מציגים את המתאם הגבוה ביותר עם ביטויHI OCT4 ויוצרים את המספר הגבוה ביותר של מושבות דמויי hESC5,6,13,15. לכן אנו סיבה כי רשת pluripotency מופעלת ברמות המרביות שלה TG30היי-GCTM-2היי הבעת תאים. אנו רואים כי באמצעות פרוטוקול TG30/GCTM-2 FACS שלנו ואחזור תאי P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)עלולים לאפשר טיהור בקנה מידה גדול של תרבויות hESC חיות מועשרות, כמו תשומות למבחני בידול.
לסיכום, אנו מדגימים כאן את הפוטנציאל של מבחני FACS שלנו המבוססים על הביטוי המשולב של אנטיגנים משטח TG30 ו- GCTM-2 הן לטיהור והן להעשרה של hESCs. מחקרים עתידיים עם פרוטוקולים לבידול מכוון של hPSCs צפויים גם להיות אינפורמטיבי לגבי פוטנציאל זה. אנו מודעים לכך שבכמה מבחנים שבהם נגזרות hESC מובחנות מבטאות זמנית TG30 (CD9) או GCTM-2, שני נוגדנים אלה עשויים שלא להיות מתאימים או מספיקים כדי לטהר תאים פלוריפוטנטיים מאוכלוסייה מובחנת בנקודת זמן מסוימת ב- assay6. לכן, יש צורך מתמשך למצוא נוגדנים חדשניים המזהים במיוחד hESCs חיים כדי להתגבר על המגבלה האפשרית של תגובה צולבת עם כמה סוגי תאים מובחנים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למתקן StemCore באוניברסיטת מונאש על אספקת קווי hESC ומתקן FlowCore באוניברסיטת מונאש עבור שירותי FACS. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר ממרכז תאי הגזע האוסטרלי, ניו סאות’ ויילס ותוכנית המענקים לחקר תאי הגזע של ממשלת ויקטוריה לכולם. ALL היא חוקרת שותפה של יוזמת המחקר המיוחדת של מועצת המחקר האוסטרלית (ARC) במדע תאי גזע, תאי גזע באוסטרליה.
Materials
| Short Name | Company | Catalog Number | Long Name |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Long Name: Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | Long Name: GlutaMAX supplement |
| Nonessential Amino Acids | Life Technologies | 11140050 | Long Name: MEM Nonessential Amino Acids Solution |
| Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | Long Name: 2-Mercaptoethanol |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | Long Name: Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, no calcium, no magnesium |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604039 | Long Name: TrypLE Express (1x), no Phenol Red |
| AF-488 | Life Technologies | A21131 | Long Name: Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a |
| AF-647 | Life Technologies | A21238 | Long Name: Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgM |
| PE-anti IgG2a | Life Technologies | P21139 | Long Name: R-Phycoerythrin Goat Anti-Mouse IgG2a (γ2a) Conjugate |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Long Name: Penicillin-Streptomycin, Liquid |
| Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Long Name: Sterile Distilled Water |
| PI | SIGMA | P4864 | Long Name: Propidium iodide solution |
| FBS | SIGMA | 12203C | Long Name: Fetal Bovine Serum |
| Gelatin | SIGMA | G-1890 | Long Name: Gelatin from porcine skin |
| Human FGF-2 | Millipore | GF003AF-100UG | Long Name: Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Long Name: Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized |
| 70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Long Name: Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
| 35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
| 5 ml Polystyrene round bottom test tube | Becton Dickinson | 352054 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, sterile |
| IgG2a Isotype Control | Becton Dickinson | 554126 | Long Name: Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control |
| IgM Isotype Control | Becton Dickinson | 553472 | Long Name: Purified Mouse IgM, κ Isotype Control |
| PE-CD90.2 | Becton Dickinson | 553014 | Long Name: PE Rat Anti-Mouse CD90.2 |
| 8-peaks calibration | Becton Dickinson | 559123 | Long Name: Rainbow Calibration Particles (8 peaks) |
| 50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | Long Name: 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | Long Name: CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
| TG30 | Merck Millipore | MAB4427 | Long Name: TG30 Antibody, clone TG30 |
| GCTM-2 | Merck Millipore | MAB4346 | Long Name: GCTM-2 is not commercially available but TG343 and equivalent monoclonal antibody is |
| Table 4. List of materials and reagent | |||
| [header] | |||
| FACS machine | Becton Dickinson | FACSVantage SE with FACSDiva option | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Table 5. List of equipment. |
References
- Pera, M. F., Tam, P. P. Extrinsic regulation of pluripotent stem cells. Nature. 10 (7299), 713-720 (2010).
- Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Healy, L., Young, L., Stacey, G. Standardization of pluripotent stem cell cultures for toxicity testing. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8 (2), 239-257 (2012).
- Miura, K., Okada, Y., Aoi, T., Okada, A., Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Koyanagi, M., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines. Nat. Biotechnol. 27 (8), 743-745 (2009).
- Polanco, J. C., Laslett, A. L., Lenka, N. Safety Assessment of Reprogrammed Cells Prior to Clinical Applications: Potential Approaches to Eliminate Teratoma Formation. Pluripotent Stem Cells. , (2013).
- Laslett, A. L., Grimmond, S., et al. Transcriptional analysis of early lineage commitment in human embryonic stem cells. BMC Dev. Biol. 7, 12 (2007).
- Kolle, G., Ho, M., et al. Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling. Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).
- Zhou, Q., Chy, H., Laslett, A. L. Preparation of defined human embryonic stem cell populations for transcriptional profiling. Current protocols in stem cell biology. Chapter 1, Unit1B 7 (2010).
- Fong, C. Y., Peh, G. S., Gauthaman, K. Separation of SSEA-4 and TRA-1-60 labelled undifferentiated human embryonic stem cells from a heterogeneous cell population using magnetic-activated cell sorting (MACS) and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Stem Cell Rev. 5, 72-80 (2009).
- Schriebl, K., Satianegara, G., et al. Selective removal of undifferentiated human embryonic stem cells using magnetic activated cell sorting followed by a cytotoxic antibody. Tissue Eng. Part A. 18, 899-909 (2012).
- Adewumi, O., Aflatoonian, B., et al. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25, 803-816 (2007).
- Michalska, A. E. Isolation and propagation of mouse embryonic fibroblasts and preparation of mouse embryonic feeder layer cells. Current protocols in stem cell biology. Chapter 1, Unit1C 3 (2007).
- Hough, S. R., Laslett, A. L., Grimmond, S. B., Kolle, G., Pera, M. F. A continuum of cell states spans pluripotency and lineage commitment in human embryonic stem cells. PLoS One. 4, e7708 (2009).
- Filipczyk, A. A., Laslett, A. L., Mummery, C., Pera, M. F. Differentiation is coupled to changes in the cell cycle regulatory apparatus of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 1, 45-60 (2007).
- Polanco, J. C., Ho, M. S. H., Wang, B., Zhou, Q., Wolvetang, E., Mason, E., Wells, C., Kolle, G., Grimmond, S. M., Bertoncello, I., O’Brien, C., Laslett, A. L. Identification of unsafe human IPSC lines using a robust surrogate assay for pluripotency. Stem Cells. 31 (8), 1498-1510 (2013).
- Sharpe, M. E., Morton, D., Rossi, A. Nonclinical safety strategies for stem cell therapies. Toxicol. Appl. Pharmacol. 262 (3), 223-231 (2012).
