モノクローナル抗体TG30およびGCTM-2を用いた細胞表面抗原の検出によるヒト胚性幹細胞の濃縮とパージ
Summary
我々は、正の選択を用いた生きたヒト胚性幹細胞(hESC)の同定および濃縮のための蛍光活性化細胞分類(FACS)を介した細胞表面抗原の複合検出のためのモノクローナル抗体TG30(CD9)およびGCTM-2の使用と、混合細胞集団からのhESCCをパージするための否定的選択の使用について述べた。
Abstract
ヒト胚性幹細胞(hESC)は、インビトロで無期限に自己更新することができ、適切な手がかりを持つ可能性のあるすべての体細胞系統に分化するように誘導することができる。分化されたhESC誘導体は、移植療法で様々な細胞変性疾患を治療するために使用される可能性がある。しかし、hESC分化プロトコルは通常、異分化された標的細胞とオフターゲット細胞タイプの混合物と、残存未分化細胞を生じる。分化したhESC誘導体を研究室からクリニックに翻訳する場合、未分化(多能性)と分化細胞を区別し、これらの集団を分離する方法を生成できることが重要です。hESC由来の体細胞タイプの安全な適用は、移植後に奇形腫として知られている腫瘍を誘発する可能性があるため、多能性幹細胞フリー集団でのみ達成できる。この目的に向けて、多能性TG30 Hi-GCTM-2Hi hESCsを同定するための蛍光活性化細胞分類(FACS)を介してモノクローナル抗体TG30(CD9)およびGCTM-2を用いて多能性関連細胞表面抗原を検出する方法論を説明する。TG30/GCTM-2 FACSの手法で負の選択を行い、非常に初期段階の分化を行っている集団の未分化のhESCを検出およびパージすることができました(TG30Neg-GCTM-2Neg)。さらなる研究では、当社のTG30/GCTM-2 FACSプロトコルを使用して選択された分化TG30陰細胞-GCTM-2陰性細胞の多能性幹細胞フリーサンプルは、一度免疫不全マウスに移植されたテラトマを形成せず、当社のプロトコルの堅牢性を支えた。一方、TG30/GCTM-2 FACSは、富化多能性TG30 Hi-GCTM-2HihESCsの連続的な受架は、インビトロで自己更新する能力またはその固有の多能性に影響を与えなかった。したがって、当社のTG30/GCTM-2 FACS方法論の特性は、分化アッセイの入力としてhPSCの高濃縮集団を得て、誘導細胞集団から潜在的に腫瘍性(または残留)hESCを取り除くために、敏感なアッセイを提供します。
Introduction
HPSC(hPSC)は、ヒト胚性幹細胞(hESC)およびヒト人工多能性幹細胞(hIPSC)を含む。HPSCは、適切な培養条件で「多能性」と呼ばれる能力を失うことなく、無期限に自己更新することができます。多能性は、細胞が本質的に3つの胚性生殖細胞層のそれぞれを代表する細胞を含む任意の体細胞系統に分化する可能性と定義される。hPSCの顕著な可能性は、治療オプションを含む細胞ベースの多種多様なアプリケーションのための手段を提供する。例えば、心不全、脊髄損傷、糖尿病、パーキンソン病、いくつかの癌、および他の臨床病理のように、人体の細胞の正常な機能が損なわれる細胞死および変性を伴う障害がある。これらの状態に苦しむ患者は、実験室でhPSCに由来した健康で機能的な体細胞を移植することによって治療される可能性がある。しかし、現在のhPSC分化プロトコルは、100%効率的ではなく、分化された標的とオフターゲットの細胞タイプの混合物を得るだけでなく、分化を受けていない残留hPSCを、代わりに自己更新1-3に続ける。患者への移植を目的としたhPSC由来の体細胞のサンプル中に少数のhPSCが存在することは、これらの細胞が固有の性質によって3つの胚性胚層の組織を形成することによって、奇形腫として知られている腫瘍の一種を 生体内に 形成する可能性があるため、深刻な臨床リスクを構成する可能性がある。したがって、多能性幹細胞を含まないと判断された標的細胞集団のみが、患者への移植に対して安全であると考えることができる。分化後の残留hPSCのパージを達成する可能性があると報告されているいくつかのアプローチがあります(レビューについては、ポランコとラスレット4を参照してください)。我々は、多能性幹細胞を同定し、hESCライン5-7の培養において早期分化を受けている細胞からそれらを区別するために蛍光活性化細胞選別(FACS)に結合したモノクローナル抗体TG30(CD9)およびGCTM-2の使用を以前に報告した。
抗体を使用して細胞表面抗原を検出する利点の1つは、標的細胞が通常、抗体結合および/または標識後に生存可能である点である。したがって、抗体標識後に標的細胞を回収し、移植前に拡大およびさらなる適用のために再培養することができる。hPSC上で発現される細胞表面抗原の注意点の1つは、多能性の段階に排他的ではなく、多くの場合、開発中に一時的に再発現され、したがっていくつかの分化された細胞タイプで検出されることである。したがって、ヒト多能性細胞を検出し、それらをhPSC由来細胞のサンプルからパージするために抗体を使用することを目的とする場合、選択された抗体は、移植を目的とした特異的分化細胞タイプ上の抗原とも反応してはならない。残念ながら、生きたhPSC 4上の細胞表面マーカーを検出する抗体の数は限られており、選択の選択肢は限られています。さらに、いくつかの研究は、1つの単一の細胞表面マーカーの検出がすべてのhPSCを排除するのに十分ではないことを指摘しており、hPSC 9-10で発現する異なるエピトープを検出する2つ以上の抗体を使用する方法に依存すべきであることを示唆している。前述のように、多能性幹細胞集団として決定できるhPSC由来細胞のみがヒト移植に適している。このレベルのストリンジェンシーに到達することは、抗体媒介細胞選別技術を介した単一の通過では達成できない可能性がある。分化された標的細胞の富化集団の再培養および細胞選別のその後のラウンドは、多能性幹細胞フリーサンプルを確実に得るために必要とされ得る。
当研究室では、生きた多能性細胞の検出のために、2つのhES細胞表面抗体TG30(CD9)とGCTM-2を広範囲に特徴づけている。我々の研究は、TG30とGCTM-2の両方を組み合わせた検出が、hESC行5-7における正規多能性関連遺伝子の発現と強く相関することを示している。TG30/GCTM-2 FACS免疫プロファイリングは、hESC培養がTG30/GCTM-2発現5-7の定量的連続勾配を構成することを一貫して示している。このTG30/GCTM-2勾配内の細胞の4つの集団(P)を任意に確立しました: P4 (TG30ネグ-GCTM-2ネグ), P5 (TG30低-GCTM-2低), P6 (TG30ミッド-GCTM-2ミッド) およびP7 (TG30Hi-GCM-2 Hi-Hi-Hi- Hi-2Hi-7)これらのP4、P5、P6およびP7細胞集団の特徴は、P6およびP7亜分数が多数の多能性関連遺伝子を発現し、FACS後2-3を再培養したときにステム様コロニーを効率的に形成することを示している。一方、P4(TG30陰-GCTM-2Neg)細胞は、多数の分化マーカーを発現し、hESC行5~6行の培養物の拡大に典型的に生じる自発的分化細胞型を構成する。初期段階の分化後の残留hPSCの選択的排除、および多能性幹細胞集団の濃縮に関するTG30/GCTM-2 FACSの可能性を試験することにしました。以下に説明するプロトコルは、多能性P7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)のパージを達成するために、FACS後の分化P4(TG30Neg-GCTM-2陰性)細胞を収集および再培養する方法を示す。また、多能性P7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)細胞の回収・再培養を説明し、多能性細胞の培養物を豊富に得るとともに、その後、定義された入力集団として使用して分化アッセイの効率と一貫性を高める可能性を説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
臨床文脈では、分化された体細胞タイプは移植および治療用途のための最終的な望ましい産物であり、hPSCは、実験室でそれらの体細胞またはそれらの前駆細胞を生成する自己更新およびスケーラブルなソースである。奇形腫形成の可能性を有する残存未分化のhESCの存在は、患者への移植のためのhESC由来の体細胞を考慮する際の安全上のリスクである。これおよび細胞療法に関連する他のリスクのレビューについては、Sharpeらをご覧ください。16したがって、このような応用を実現するためには、研究者が多能性幹細胞を含まない標的細胞集団を生成することを目指することが不可欠である。この目的に向けて、TG30/GCTM-2 FACSの方法論を用いて、細胞集団を区別する多能性細胞(TG30 Hi-GCTM-2Hi)の存在を監視し、FACS後に濃縮および再培養できる生存可能なhESC分化誘導体を得ることができることを示す。プロトコルの単一パスで100%多能性幹細胞を得ることができないが、濃縮されたhESC誘導体を再培養し、連続通過後100%体細胞純度を達成することができる。FACS後の拡張のための体細胞の実証された生存率はまた潜在的な移植療法に適した細胞の十分な数の生産を可能にする。
この試験研究の励ましの結果は、いくつかのヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)行15との比較研究において、TG30/GCTM-2プロトコルを用いてより包括的な調査を行うよう促した。その研究では、TG30/GCTM-2 FACSプロトコルを用いて得られた多能性幹細胞フリーサンプルは、免疫奪われたマウスに移植しても奇形腫を生成しないことがわかった。したがって、このin vitroプロトコルを使用することで、多能性TG30 Hi-GCTM-2Hi細胞が生体内で奇形腫を発症しないと判断した初期段階の分化細胞培養を自信を持って述べることができる。これは、臨床応用におけるhPSC由来細胞の使用前に奇形腫形成のリスクを排除する潜在的なアプローチを提供し、我々のアッセイの堅牢性を強く支持する。
逆に、TG30/GCTM-2 FACSアッセイは、これら2つの表面抗原の発現レベルの高い多能性細胞集団を取り出すために使用できることを示している(TG30 Hi-GCTM-2Hi)。これまでの研究では、TG30Hi-GCTM-2Hi細胞が OCT4hi発現と最も高い相関を示し、hESC様コロニーの数が5,6,13,15の最も多い。そこで、多能性ネットワークがTG30 Hi-GCTM-2Hi発現細胞の最大レベルで活性化される理由です。TG30/GCTM-2 FACSプロトコルを用いて、P7(TG30 Hi-GCTM-2Hi)細胞を取得することで、分化アッセイへの入力として、濃縮された生きたhESC培養物の大規模な精製が可能になる可能性があると考えています。
結論として、我々は、表面抗原TG30とGCTM-2の両方のhESCのパージと濃縮の組み合わせに基づくFACSアッセイの可能性をここで示す。hPSCの指向分化のためのプロトコルを用いた今後の研究も、この可能性に関する有益なものである可能性が高い。我々は、分化hESC誘導体がTG30(CD9)またはGCTM-2を一時的に発現するアッセイでは、アッセイ6の特定の時点で多能性細胞を分化した集団から多能性細胞をパージするのに適切ではないか、または十分でない可能性があることを認識している。したがって、いくつかの分化された細胞タイプとの交差反応の可能性のある限界を克服するために、生きたhESCを特異的に認識する新規抗体を見つける必要が続いています。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、FACSサービスのためのモナッシュ大学のhESCラインとフローコア施設の提供のためのモナッシュ大学のステムコア施設に感謝します. この研究は、オーストラリア幹細胞センター、ニューサウスウェールズ州、ビクトリア州政府幹細胞研究助成プログラムの研究助成金によって支援されました。ALLは、オーストラリア幹細胞科学に関するオーストラリア研究評議会(ARC)特別研究イニシアチブのパートナー研究者です。
Materials
| Short Name | Company | Catalog Number | Long Name |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Long Name: Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | Long Name: GlutaMAX supplement |
| Nonessential Amino Acids | Life Technologies | 11140050 | Long Name: MEM Nonessential Amino Acids Solution |
| Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | Long Name: 2-Mercaptoethanol |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | Long Name: Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, no calcium, no magnesium |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604039 | Long Name: TrypLE Express (1x), no Phenol Red |
| AF-488 | Life Technologies | A21131 | Long Name: Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a |
| AF-647 | Life Technologies | A21238 | Long Name: Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgM |
| PE-anti IgG2a | Life Technologies | P21139 | Long Name: R-Phycoerythrin Goat Anti-Mouse IgG2a (γ2a) Conjugate |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Long Name: Penicillin-Streptomycin, Liquid |
| Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Long Name: Sterile Distilled Water |
| PI | SIGMA | P4864 | Long Name: Propidium iodide solution |
| FBS | SIGMA | 12203C | Long Name: Fetal Bovine Serum |
| Gelatin | SIGMA | G-1890 | Long Name: Gelatin from porcine skin |
| Human FGF-2 | Millipore | GF003AF-100UG | Long Name: Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Long Name: Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized |
| 70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Long Name: Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
| 35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
| 5 ml Polystyrene round bottom test tube | Becton Dickinson | 352054 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, sterile |
| IgG2a Isotype Control | Becton Dickinson | 554126 | Long Name: Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control |
| IgM Isotype Control | Becton Dickinson | 553472 | Long Name: Purified Mouse IgM, κ Isotype Control |
| PE-CD90.2 | Becton Dickinson | 553014 | Long Name: PE Rat Anti-Mouse CD90.2 |
| 8-peaks calibration | Becton Dickinson | 559123 | Long Name: Rainbow Calibration Particles (8 peaks) |
| 50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | Long Name: 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | Long Name: CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
| TG30 | Merck Millipore | MAB4427 | Long Name: TG30 Antibody, clone TG30 |
| GCTM-2 | Merck Millipore | MAB4346 | Long Name: GCTM-2 is not commercially available but TG343 and equivalent monoclonal antibody is |
| Table 4. List of materials and reagent | |||
| [header] | |||
| FACS machine | Becton Dickinson | FACSVantage SE with FACSDiva option | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Table 5. List of equipment. |
References
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