Monoklonal Antikorlar TG30 ve GCTM-2 Kullanılarak Hücre Yüzey Antijenlerinin Tespiti ile İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Zenginleştirilmesi ve Temizlenmesi
Summary
Monoklonal antikorlar TG30 (CD9) ve GCTM-2’nin floresan aktif hücre sıralama (FACS) yoluyla hücre yüzeyi antijenlerinin kombine tespiti için pozitif seçim kullanılarak canlı insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC) tanımlanması ve zenginleştirilmesi ve ayrıca hESC’lerin karışık hücre popülasyonundan arındırılması için negatif seçimin kullanılmasını açıklıyoruz.
Abstract
İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) süresiz in vitroolarak kendini yenileyebilir ve uygun ipuçları ile potansiyel olarak tüm somatik hücre soylarına farklılaşmak için indüklenebilir. Farklılaştırılmış hESC türevleri, çeşitli hücre dejeneratif hastalıkların tedavisinde transplantasyon tedavilerinde potansiyel olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, hESC farklılaşma protokolleri genellikle farklılaştırılmış hedef ve hedef dışı hücre tiplerinin yanı sıra artık farklılaşmamış hücrelerin bir karışımını verir. Farklılaştırılmış hESC türevlerinin laboratuvardan kliniğe çevirisi için, farklılaşmamış (pluripotent) ve farklılaştırılmış hücreler arasında ayrım yapabilmek ve bu popülasyonları ayırmak için yöntemler üretebilmek önemlidir. HESC türevi somatik hücre tiplerinin güvenli uygulaması ancak pluripotent kök hücre içermeyen popülasyonlarla gerçekleştirilebilir, çünkü artık hESC’ler transplantasyondan sonra teratom olarak bilinen tümörlere neden olabilir. Bu amaçla, burada pluripotent TG30Hi-GCTM-2Hi hESC’lerin pozitif seçim kullanılarak tanımlanması için floresan aktif hücre sıralama (FACS) yoluyla monoklonal antikorlar TG30 (CD9) ve GCTM-2 ile ilişkili hücre yüzey antijenlerini tespit etmek için bir metodoloji açıklıyoruz. TG30/GCTM-2 FACS metodolojimiz ile negatif seçim kullanarak, çok erken evre farklılaşma geçiren popülasyonlarda farklılaşmamış hESC’leri tespit edebildik ve temizleyebildik (TG30Neg-GCTM-2Neg). Daha sonraki bir çalışmada, TG30/GCTM-2 FACS protokolümüz kullanılarak seçilen farklılaştırılmış TG30Neg-GCTM-2Neg hücrelerinin pluripotent kök hücre içermeyen örnekleri, bağışıklık sistemi zayıf farelere nakledildikten sonra teratom oluşturmadı ve protokolümüzün sağlamlığını destekledi. Öte yandan, TG30/GCTM-2 FACS aracılı ardışık zenginleştirilmiş pluripotent TG30Hi-GCTM-2Hi hESC’ler in vitro veya içsel pluripotency kendi kendini yenileme yeteneklerini etkilemedi. Bu nedenle, TG30/GCTM-2 FACS metodolojimizin özellikleri, farklılaşma tahlilleri için girdiler olarak yüksek oranda zenginleştirilmiş hPSC popülasyonları elde etmek ve potansiyel olarak tümörojenik (veya artık) hESC’yi türev hücre popülasyonlarından kurtarmak için hassas bir test sağlar.
Introduction
HPSC (hPSC) insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve insan indüklenmiş pluripotent kök hücreleri (hIPSC) içerir. HPSC, “pluripotency” olarak bilinen yeteneklerini kaybetmeden uygun kültür koşullarında süresiz olarak kendini yenileyebilir. Pluripotency, bir hücrenin üç embriyonik mikrop hücre katmanının her birinin hücrelerini temsil etmesi de dahil olmak üzere esasen herhangi bir somatik hücre soyuna farklılaşma potansiyeli olarak tanımlanır. hPSC’nin dikkat çekici potansiyeli, terapötik seçenekler de dahil olmak üzere çok çeşitli hücre tabanlı uygulamalar için bir araç sağlar. Örneğin, kalp yetmezliği, omurga yaralanmaları, diyabet, Parkinson hastalığı, bazı kanserler ve diğer klinik patolojilerde olduğu gibi, insan vücudundaki hücrelerin normal işlevselliğinin tehlikeye girdiği hücre ölümü ve dejenerasyon içeren bozukluklar vardır. Bu durumlara maruz kalan hastalar, laboratuvarda hPSC’den elde edilen sağlıklı ve fonksiyonel somatik hücrelerin nakledilmesiyle potansiyel olarak tedavi edilebilir. Bununla birlikte, mevcut hPSC farklılaşma protokolleri% 100 verimli değildir ve farklılaştırılmış hedef ve hedef dışı hücre türlerinin yanı sıra farklılaşmaya uğramamış artık hPSC’lerin bir karışımını verir, bunun yerine kendi kendini yenilemeye devam eder1-3. Hastalara nakli amaçlanan hPSC türevli somatik hücrelerin bir örneğinde az sayıda hPSC’nin bile bulunması, bu hücrelerin doğası gereği üç embriyonik mikrop tabakasının dokularını oluşturmak için ciddi bir klinik risk oluşturmaktadır, potansiyel olarak teratoma olarak bilinen bir tümör türü oluşturabilir. Bu nedenle hastalara nakil için sadece pluripotent kök hücre içermeyen olduğu belirlenen hedef hücre popülasyonları güvenli olarak kabul edilebilir. Farklılaşmadan sonra artık hPSC’lerin temizlenmesini potansiyel olarak gerçekleştirmek için bildirilen çeşitli yaklaşımlar vardır (inceleme için bkz: Polanco ve Laslett4). Daha önce pluripotent kök hücreleri tanımlamak ve hESC hatlarının kültürlerinde erken farklılaşma aşamasına geçen hücrelerden ayırt etmek için floresan aktif hücre sıralama (FACS) ile birleştirilmiş monoklonal antikorların TG30 (CD9) ve GCTM-2’nin kullanımını bildirdik5-7.
Hücre yüzeyi antijenlerini tespit etmek için antikor kullanmanın bir avantajı, hedef hücrelerin genellikle antikor bağlama ve/ veya etiketlemeden sonra uygulanabilir olmasıdır. Bu nedenle, hedef hücreler antikor etiketlemesinden sonra toplanabilir ve transplantasyondan önce genişleme ve daha fazla uygulama için yeniden şekillendirilebilir. HPSC’de ifade edilen hücre yüzeyi antijenleri için bir uyarı, pluripotent evreye özel olmadıkları ve çoğu durumda gelişim sırasında zamansal olarak yeniden ifade edildikleri ve bu nedenle bazı farklılaştırılmış hücre tiplerinde tespit edilecekleridir. Bu nedenle, amaç insan pluripotent hücrelerini tespit etmek ve hPSC türevi hücrelerin bir örneğinden temizlemek için antikor kullanmaksa, seçilen antikorlar da transplantasyon için amaçlanan spesifik farklılaştırılmış hücre tipleri üzerinde antijenlerle reaksiyona almamalıdır. Ne yazık ki, canlı hPSC 4’tehücre yüzeyi işaretleyicilerini tespit eden sınırlı sayıda antikor vardır. Ek olarak, birkaç çalışma, tek bir hücre-yüzey işaretleyicisinin tespitinin tüm hPSC’yi ortadan kaldırmak için yeterli olmadığına işaret etti, tüm hPSC pluripotent subpopulations ortadan kaldırmaya yönelik herhangi bir girişimin, hPSC 9-10tarafından ifade edilen farklı epitopları tespit eden iki veya daha fazla antikor kullanan yöntemlere dayanması gerektiğini öne sürdü. Yukarıda bahsedildiği gibi, insan nakli için sadece pluripotent kök hücre içermeyen hücre popülasyonları olarak belirlenebilecek hPSC türevi hücreler uygundur. Antikor aracılı hücre sıralama teknolojisinden tek bir geçişle bu katılık seviyesine ulaşmak sağlanamayabilir. Pluripotent kök hücre içermeyen örnekleri kesin olarak elde etmek için farklılaştırılmış hedef hücrelerin zenginleştirilmiş popülasyonunun yeniden şekillendirilmesi ve sonraki hücre sıralama turları gerekebilir.
Laboratuvarımızda, canlı pluripotent hücrelerin tespiti için TG30 (CD9) ve GCTM-2 olmak üzere iki hES hücre yüzeyi antikorlarını kapsamlı bir şekilde karakterize ettik. Çalışmalarımız, hem TG30 hem de GCTM-2’nin kombine tespitinin hESC hatlarında kanonik pluripotency ile ilişkili genlerin ekspresyonu ile güçlü bir şekilde ilişkili olduğunu göstermiştir 5-7. TG30/GCTM-2 FACS immünprofiling sürekli olarak hESC kültürlerinin TG30/GCTM-2 ekspresyonunun nicel sürekli gradyanını oluşturduğunu göstermiştir 5-7. Bu TG30/GCTM-2 gradyanın içinde keyfi olarak dört hücre popülasyonu (P) oluşturduk: P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg),P5 (T)G30Düşük-GCTM-2Düşük), P6 (TG30Orta-GCTM-2Orta)ve P7 (TG30Hi-GCTM-2Merhaba) 5-7. Bu P4, P5, P6 ve P7 hücre popülasyonlarını karakterize etmek, P6 ve P7 alt ihlallerinin çok sayıda pluripotency ile ilişkili geni ifade ettiğini ve FACS 2-3sonrası yeniden şekillendirildiğinde etkili bir şekilde kök benzeri koloniler oluşturduğunu göstermiştir. Öte yandan, P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)hücreleri çok sayıda farklılaşma işaretleyicisini ifade eder ve tipik olarak hESC hatlarının 5-6kültürlerinin genişlemesinde meydana gelen kendiliğinden farklılaşmış hücre tiplerini oluşturur. Erken evre farklılaşmasından sonra artık hPSC’lerin seçici olarak ortadan kaldırılması ve ayrıca pluripotent kök hücre popülasyonlarının zenginleştirilmesi için TG30/GCTM-2 FACS’imizin potansiyelini test etmeye karar verdik. Aşağıda açıklanan protokol, pluripotent P7’nin (TG30Hi-GCTM-2Hi)temizlenmesini gerçekleştirmek için FACS sonrası farklılaştırılmış P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg)hücrelerinin nasıl toplandığını ve yeniden şekillendirildiğini göstermektedir. Ayrıca, pluripotent P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)hücrelerinin, daha sonra farklılaşma testlerinin verimliliğini ve tutarlılığını potansiyel olarak artırmak için tanımlanmış bir girdi popülasyonu olarak kullanılabilecek zenginleştirilmiş bir pluripotent hücre kültürü elde etmek için toplanması ve yeniden şekillendirilmesini de açıklıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Klinik bağlamda, farklılaştırılmış somatik hücre tipleri transplantasyon ve terapötik uygulamalar için son istenen ürün olup, hPSC bu somatik hücreleri veya laboratuvardaki atalarını üretmek için kendi kendini yenileyen ve ölçeklenebilir bir kaynaktır. Teratoma oluşumu için doğal bir potansiyele sahip artık farklılaşmamış hESC’lerin varlığı, hastalara nakil için hESC türevi somatik hücreler düşünüldüğünde bir güvenlik riskidir. Bu ve hücre tedavisi ile ilgili diğer risklerin gözden geçirilmesi için lütfen Sharpe ve ark. 16 Bu nedenle, bu tür uygulamaları gerçekleştirmek için, araştırmacıların aynı zamanda pluripotent kök hücre içermeyen hedef hücre popülasyonları oluşturmayı hedeflemeleri zorunludur. Bu amaçla, burada TG30/GCTM-2 FACS metodolojimizi kullanarak, farklılaşan bir hücre popülasyonunda pluripotent hücrelerin (TG30Hi-GCTM-2Hi)varlığını izlemenin ve FACS sonrası zenginleştirilebilen ve yeniden şekillendirilebilen uygulanabilir hESC-farklılaştırılmış türevler elde etmenin mümkün olduğunu gösteriyoruz. Protokolümüzün tek geçişi ile %100 pluripotent kök hücre içermeyen numuneler elde etmek mümkün olmasa da zenginleştirilmiş hESC türevleri yeniden şekillendirilebilir ve ardışık geçtikten sonra %100 somatik hücre saflığı elde edilir. FACS sonrası genişleme için somatik hücrelerin gösterilmiş canlılığı, potansiyel transplantasyon tedavileri için uygun yeterli sayıda hücrenin üretilmesine de olanak sağlamaktadır.
Bu pilot çalışmanın cesaret verici sonuçları, birkaç insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) hattı15ile karşılaştırmalı bir çalışmada TG30/ GCTM-2 protokolümüzü kullanarak daha kapsamlı bir araştırma yapmamızı istedi. Bu çalışmada, TG30/GCTM-2 FACS protokolümüz kullanılarak elde edilen pluripotent kök hücre içermeyen örneklerin bağışıklıktan yoksun farelere nakledildiğinde teratom üretmediğini tespit ettik. Bu nedenle, bu in vitro protokolün kullanımıyla, pluripotent TG30Hi-GCTM-2Hi hücrelerinden arındırılmış olduğu belirlenen erken evre farklılaşma hücre kültürlerinin teratomageliştirmediğini güvenle belirtebiliriz vivo . Bu, hPSC türevi hücrelerin klinik uygulamalarda kullanılmadan önce teratom oluşumu riskini ortadan kaldırmak için potansiyel bir yaklaşım sağlayarak testimizin sağlamlığını güçlü bir şekilde desteklemektedir.
Tersine, TG30/GCTM-2 FACS testinin, bu iki yüzey antijeninin (TG30Hi-GCTM-2Hi)yüksek düzeyde ekspresyosuna sahip pluripotent hücre popülasyonu almak için kullanılabileceğini de gösteriyoruz. Önceki çalışmalar, TG30Hi-GCTM-2Hi hücrelerinin OCT4hi ekspresyasyonu ile en yüksek korelasyonu sergilediğini ve en yüksek hESC benzeri koloni sayısını oluşturduğunu göstermiştir5,6,13,15. Bu nedenle pluripotency ağının TG30Hi-GCTM-2Hi ekspresyon hücrelerinde maksimum seviyelerinde aktive olmasının nedeni budur. TG30/GCTM-2 FACS protokolümüzü kullanarak ve P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi)hücrelerini alarak zenginleştirilmiş canlı hESC kültürlerinin büyük ölçekli saflaştırılmasına izin verebileceğini düşünüyoruz.
Sonuç olarak, burada, HESK’lerin hem tasfiyesi hem de zenginleştirilmesi için yüzey antijenleri TG30 ve GCTM-2’nin birleşik ifadesine dayanan FACS tahlillerimizin potansiyelini gösteriyoruz. HPSC’lerin yönlendirilmiş farklılaşmasına yönelik protokollerle gelecekteki çalışmaların da bu potansiyel konusunda bilgilendirici olması muhtemeldir. Farklılaştırılmış hESC türevlerinin zamansal olarak TG30 (CD9) veya GCTM-2’yi ifade ettiği bazı tahlillerde, bu iki antikorun pluripotent hücrelerini testte belirli bir zaman noktasında farklılaşmış bir popülasyondan arındırmak için uygun veya yeterli olmayabileceğinin farkındayız6. Bu nedenle, bazı farklılaştırılmış hücre tipleriyle çapraz reaksiyonun olası sınırlamasının üstesinden gelmek için canlı hESK’leri özellikle tanıyan yeni antikorlar bulmaya ihtiyaç vardır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HESC hatlarının sağlanması için Monash Üniversitesi’ndeki StemCore tesisine ve FACS hizmetleri için Monash Üniversitesi’ndeki FlowCore tesisine teşekkür ederiz. Bu çalışma Avustralya Kök Hücre Merkezi, Yeni Güney Galler ve Victoria Hükümeti Kök Hücre Araştırma Hibe Programı’ndan ALL’ye yapılan araştırma hibeleri ile desteklendi. ALL, Kök Hücre Bilimi, Kök Hücreler Avustralya’daki Avustralya Araştırma Konseyi (ARC) Özel Araştırma Girişimi’nin Ortak Araştırmacısıdır.
Materials
| Short Name | Company | Catalog Number | Long Name |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Long Name: Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | Long Name: GlutaMAX supplement |
| Nonessential Amino Acids | Life Technologies | 11140050 | Long Name: MEM Nonessential Amino Acids Solution |
| Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | Long Name: 2-Mercaptoethanol |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | Long Name: Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, no calcium, no magnesium |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604039 | Long Name: TrypLE Express (1x), no Phenol Red |
| AF-488 | Life Technologies | A21131 | Long Name: Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a |
| AF-647 | Life Technologies | A21238 | Long Name: Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgM |
| PE-anti IgG2a | Life Technologies | P21139 | Long Name: R-Phycoerythrin Goat Anti-Mouse IgG2a (γ2a) Conjugate |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Long Name: Penicillin-Streptomycin, Liquid |
| Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Long Name: Sterile Distilled Water |
| PI | SIGMA | P4864 | Long Name: Propidium iodide solution |
| FBS | SIGMA | 12203C | Long Name: Fetal Bovine Serum |
| Gelatin | SIGMA | G-1890 | Long Name: Gelatin from porcine skin |
| Human FGF-2 | Millipore | GF003AF-100UG | Long Name: Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Long Name: Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized |
| 70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Long Name: Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
| 35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
| 5 ml Polystyrene round bottom test tube | Becton Dickinson | 352054 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, sterile |
| IgG2a Isotype Control | Becton Dickinson | 554126 | Long Name: Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control |
| IgM Isotype Control | Becton Dickinson | 553472 | Long Name: Purified Mouse IgM, κ Isotype Control |
| PE-CD90.2 | Becton Dickinson | 553014 | Long Name: PE Rat Anti-Mouse CD90.2 |
| 8-peaks calibration | Becton Dickinson | 559123 | Long Name: Rainbow Calibration Particles (8 peaks) |
| 50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | Long Name: 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | Long Name: CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
| TG30 | Merck Millipore | MAB4427 | Long Name: TG30 Antibody, clone TG30 |
| GCTM-2 | Merck Millipore | MAB4346 | Long Name: GCTM-2 is not commercially available but TG343 and equivalent monoclonal antibody is |
| Table 4. List of materials and reagent | |||
| [header] | |||
| FACS machine | Becton Dickinson | FACSVantage SE with FACSDiva option | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Table 5. List of equipment. |
References
- Pera, M. F., Tam, P. P. Extrinsic regulation of pluripotent stem cells. Nature. 10 (7299), 713-720 (2010).
- Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Healy, L., Young, L., Stacey, G. Standardization of pluripotent stem cell cultures for toxicity testing. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 8 (2), 239-257 (2012).
- Miura, K., Okada, Y., Aoi, T., Okada, A., Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Koyanagi, M., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. Variation in the safety of induced pluripotent stem cell lines. Nat. Biotechnol. 27 (8), 743-745 (2009).
- Polanco, J. C., Laslett, A. L., Lenka, N. Safety Assessment of Reprogrammed Cells Prior to Clinical Applications: Potential Approaches to Eliminate Teratoma Formation. Pluripotent Stem Cells. , (2013).
- Laslett, A. L., Grimmond, S., et al. Transcriptional analysis of early lineage commitment in human embryonic stem cells. BMC Dev. Biol. 7, 12 (2007).
- Kolle, G., Ho, M., et al. Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling. Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).
- Zhou, Q., Chy, H., Laslett, A. L. Preparation of defined human embryonic stem cell populations for transcriptional profiling. Current protocols in stem cell biology. Chapter 1, Unit1B 7 (2010).
- Fong, C. Y., Peh, G. S., Gauthaman, K. Separation of SSEA-4 and TRA-1-60 labelled undifferentiated human embryonic stem cells from a heterogeneous cell population using magnetic-activated cell sorting (MACS) and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Stem Cell Rev. 5, 72-80 (2009).
- Schriebl, K., Satianegara, G., et al. Selective removal of undifferentiated human embryonic stem cells using magnetic activated cell sorting followed by a cytotoxic antibody. Tissue Eng. Part A. 18, 899-909 (2012).
- Adewumi, O., Aflatoonian, B., et al. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25, 803-816 (2007).
- Michalska, A. E. Isolation and propagation of mouse embryonic fibroblasts and preparation of mouse embryonic feeder layer cells. Current protocols in stem cell biology. Chapter 1, Unit1C 3 (2007).
- Hough, S. R., Laslett, A. L., Grimmond, S. B., Kolle, G., Pera, M. F. A continuum of cell states spans pluripotency and lineage commitment in human embryonic stem cells. PLoS One. 4, e7708 (2009).
- Filipczyk, A. A., Laslett, A. L., Mummery, C., Pera, M. F. Differentiation is coupled to changes in the cell cycle regulatory apparatus of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 1, 45-60 (2007).
- Polanco, J. C., Ho, M. S. H., Wang, B., Zhou, Q., Wolvetang, E., Mason, E., Wells, C., Kolle, G., Grimmond, S. M., Bertoncello, I., O’Brien, C., Laslett, A. L. Identification of unsafe human IPSC lines using a robust surrogate assay for pluripotency. Stem Cells. 31 (8), 1498-1510 (2013).
- Sharpe, M. E., Morton, D., Rossi, A. Nonclinical safety strategies for stem cell therapies. Toxicol. Appl. Pharmacol. 262 (3), 223-231 (2012).
