Anreicherung und Reinigung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Nachweis von Zelloberflächenantigenen unter Verwendung der monoklonalen Antikörper TG30 und GCTM-2
Summary
Wir beschreiben die Verwendung der monoklonalen Antikörper TG30 (CD9) und GCTM-2 zum kombinierten Nachweis von Zelloberflächenantigenen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) zur Identifizierung und Anreicherung lebender menschlicher embryonaler Stammzellen (hESC) mit positiver Selektion und auch zur Verwendung negativer Selektion zur Reinigung von hESCs aus einer gemischten Zellpopulation.
Abstract
Menschliche embryonale Stammzellen (hESC) können sich in vitrounbegrenzt selbst erneuern und mit den entsprechenden Hinweisen induziert werden, um sich in potenziell alle somatischen Zelllinien zu differenzieren. Differenzierte hESC-Derivate können möglicherweise in Transplantationstherapien zur Behandlung einer Vielzahl von zelldegenerativen Erkrankungen eingesetzt werden. HESC-Differenzierungsprotokolle ergeben jedoch in der Regel eine Mischung aus differenzierten Ziel- und Off-Target-Zelltypen sowie verbleibenden undifferenzierten Zellen. Für die Übersetzung differenzierter hESC-Derivate aus dem Labor in die Klinik ist es wichtig, zwischen undifferenzierten (pluripotenten) und differenzierten Zellen unterscheiden zu können und Methoden zur Trennung dieser Populationen zu generieren. Die sichere Anwendung von hESC-abgeleiteten somatischen Zelltypen kann nur mit pluripotenten Stammzellfreien Populationen erreicht werden, da Rest-HESCs nach der Transplantation Tumoren induzieren könnten, die als Teratome bekannt sind. Zu diesem Zweck beschreiben wir hier eine Methodik zum Nachweis von pluripotenten TG30 Hi-GCTM-2 Hi hESCs mit positiver Selektion mit pluripotenten TG30Hi-GCTM-2Hi hESCs. Mit Hilfe der negativen Selektion mit unserer TG30/GCTM-2 FACS-Methodik konnten wir undifferenzierte hESCs in Populationen erkennen und säubern, die sehr früh gedifferenzierung erfahren (TG30Neg-GCTM-2Neg). In einer weiteren Studie bildeten pluripotente StammzellfreieProben von differenzierten TG30 Neg-GCTM-2Neg-Zellen, die mit unserem TG30/GCTM-2 FACS-Protokoll ausgewählt wurden, keine Teratome, sobald sie in immungeschwächte Mäuse transplantiert wurden, was die Robustheit unseres Protokolls unterstützt. Auf der anderen Seite, TG30/ GCTM-2 FACS-vermittelte konsekutige Konsekutive TG30Hi-GCTM-2Hi hESCs beeinträchtigte nicht ihre Fähigkeit, sich in vitro selbst zu erneuern oder ihre intrinsische Pluripotenz. Daher bieten die Eigenschaften unserer TG30/GCTM-2 FACS-Methodik einen empfindlichen Test, um hoch angereicherte HPSC-Populationen als Inputs für Differenzierungstests zu erhalten und potenziell tumorigenic (oder Rest-) hESC von abgeleiteten Zellpopulationen zu befreien.
Introduction
HPSC (hPSC) umfassen menschliche embryonale Stammzellen (hESC) und humaninduzierte pluripotente Stammzellen (hIPSC). HPSC kann sich unter geeigneten Kulturbedingungen auf unbestimmte Zeit erneuern, ohne seine Fähigkeit zu verlieren, die als “Pluripotenz” bekannt ist. Pluripotenz ist definiert als das Potenzial für eine Zelle, sich in im Wesentlichen jede somatische Zelllinie zu unterscheiden, einschließlich Zellen, die für jede der drei embryonalen Keimzellschichten repräsentativ sind. Das bemerkenswerte Potenzial von hPSC bietet ein Mittel für eine Vielzahl von zellbasierten Anwendungen, einschließlich therapeutischer Optionen. Zum Beispiel gibt es Erkrankungen mit Zelltod und Degeneration, bei denen die normale Funktionsfähigkeit von Zellen im menschlichen Körper beeinträchtigt ist, wie bei Herzinsuffizienz, Wirbelsäulenverletzungen, Diabetes, Parkinson-Krankheit, einigen Krebsarten und anderen klinischen Pathologien. Patienten, die unter diesen Erkrankungen leiden, könnten möglicherweise durch Transplantation gesunder und funktioneller somatischer Zellen behandelt werden, die aus hPSC im Labor abgeleitet wurden. Die aktuellen hPSC-Differenzierungsprotokolle sind jedoch nicht 100% effizient und ergeben eine Mischung aus differenzierten Ziel- und Off-Target-Zelltypen sowie Rest-hPSCs, die keiner Differenzierung unterzogen wurden, sondern erneuern sich weiterselbst 1-3. Das Vorhandensein einer kleinen Anzahl von hPSC in einer Probe von hPSC-abgeleiteten somatischen Zellen, die für die Transplantation in Patienten bestimmt sind, stellt ein ernstes klinisches Risiko dar, da diese Zellen aufgrund ihrer inhärenten Natur Gewebe aller drei embryonalen Keimschichten bilden könnten, potenziell in vivo eine Art von Tumor bilden könnten, der als Teratom bekannt ist. Daher können nur Zielzellpopulationen, die als frei von pluripotenten Stammzellen bestimmt sind, als sicher für die Transplantation bei Patienten angesehen werden. Es gibt mehrere Ansätze, um möglicherweise die Reinigung von Rest-HPSCs nach Differenzierung zu erreichen (zur Überprüfung siehe Polanco und Laslett4). Wir haben bereits über die Verwendung der monoklonalen Antikörper TG30 (CD9) und GCTM-2 gekoppelt an fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) berichtet, um pluripotente Stammzellen zu identifizieren und sie von Zellen zu unterscheiden, die sich einem frühen Stadium der Differenzierung in Kulturen derhESC-Linien 5-7unterziehen.
Ein Vorteil der Verwendung von Antikörpern zum Nachweis von Zelloberflächenantigenen besteht darin, dass die Zielzellen nach der Antikörperbindung und/oder Etikettierung in der Regel lebensfähig sind. Daher können Zielzellen nach der Antikörperkennzeichnung gesammelt und für Erweiterungen und weitere Anwendungen vor der Transplantation rekultiviert werden. Eine Einschränkung für Zelloberflächenantigene, die auf hPSC exprimiert werden, ist, dass sie nicht ausschließlich für das pluripotente Stadium gelten und in vielen Fällen während der Entwicklung zeitlich neu ausgedrückt werden und daher in einigen differenzierten Zelltypen nachgewiesen werden. Wenn es daher darum geht, Antikörper zu verwenden, um menschliche pluripotente Zellen zu erkennen und sie aus einer Probe von hPSC-abgeleiteten Zellen zu säubern, sollten ausgewählte Antikörper nicht auch mit Antigenen auf die spezifischen differenzierten Zelltypen reagieren, die für die Transplantation bestimmt sind. Leider gibt es eine begrenzte Anzahl von Antikörpern, die Zelloberflächenmarker auf Live-hPSCs 4erkennen, wodurch die Auswahlmöglichkeiten eingeschränkt sind. Darüber hinaus haben einige Studien darauf hingewiesen, dass der Nachweis eines einzelnen Zell-Oberflächen-Markers nicht ausreicht, um alle hPSC zu eliminieren, was darauf hindeutet, dass jeder Versuch, alle pluripotenten Subpopulationen von hPSC zu beseitigen, sich auf Methoden stützen sollte, die zwei oder mehr Antikörper verwenden, die verschiedene Epitope erkennen, die durch hPSCs 9-10ausgedrückt werden. Wie bereits erwähnt, sind nur hPSC-abgeleitete Zellen, die als pluripotente Stammzellfreie Zellpopulationen bestimmt werden könnten, für eine menschliche Transplantation geeignet. Das Erreichen dieses Stringenzniveaus kann nicht mit einem einzigen Durchgang durch eine antikörpervermittelte Zellsortiertechnologie erreicht werden. Eine Rekulturierung der angereicherten Population differenzierter Zielzellen und nachfolgende Zellsortierungsrunden können erforderlich sein, um endgültig pluripotente stammzellfreie Proben zu erhalten.
In unserem Labor haben wir zwei hES-Zell-Oberflächen-Antikörper, TG30 (CD9) und GCTM-2, für den Nachweis lebender pluripotenter Zellen extensiv charakterisiert. Unsere Studien haben gezeigt, dass der kombinierte Nachweis von TG30 und GCTM-2 stark mit der Expression kanonischer Pluripotenzassoziierter Gene in den hESC-Linien 5-7korreliert. TG30/GCTM-2 FACS Immunprofiling hat immer wieder gezeigt, dass hESC-Kulturen einen quantitativen kontinuierlichen Gradienten des TG30/GCTM-2-Expressions 5-7darstellen. Wir haben willkürlich vier Populationen (P) von Zellen innerhalb dieses TG30/GCTM-2 Gradienten etabliert: P4 (TG30Neg-GCTM-2Neg), P5 (TG30Low-GCTM-2Low), P6 (TG30Mid-GCTM-2Mid) und P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) 5-7. Unsere Charakterisierung dieser P4-, P5-, P6- und P7-Zellpopulationen hat gezeigt, dass die P6- und P7-Unterfraktionen eine große Anzahl von pluripotenzassoziierten Genen ausdrücken und effizient stammähnliche Kolonien bilden, wenn sie nach FACS 2-3rekultiviert werden. Andererseits exprimieren P4-Zellen (TG30Neg-GCTM-2Neg) eine große Anzahl von Differenzierungsmarkern und bilden die spontan differenzierten Zelltypen, die typischerweise in expandierenden Kulturen der hESC-Linien 5-6vorkommen. Wir haben beschlossen, die Potenzialität unserer TG30/GCTM-2 FACS für die selektive Eliminierung von ResthPSC nach früherdischer Differenzierung und auch für die Anreicherung pluripotenter Stammzellpopulationen zu testen. Das unten beschriebene Protokoll zeigt, wie man differenzierte P4 -Zellen (TG30Neg-GCTM-2Neg) nach FACS sammelt und rekultiviert, um die Reinigung von pluripotentem P7 (TG30Hi-GCTM-2Hi) zu erreichen. Darüber hinaus erklären wir auch die Sammlung und Rekultur von pluripotenten P7-Zellen (TG30Hi-GCTM-2Hi), um eine angereicherte Kultur pluripotenter Zellen zu erhalten, die anschließend als definierte Inputpopulation verwendet werden könnten, um die Effizienz und Konsistenz von Differenzierungstests potenziell zu erhöhen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Im klinischen Kontext sind differenzierte somatische Zelltypen das endgewünschte Produkt für Transplantations- und Therapieanwendungen, und hPSC ist eine sich selbst erneuernde und skalierbare Quelle, um diese somatischen Zellen oder ihre Vorfahren im Labor zu erzeugen. Das Vorhandensein von verbleibenden undifferenzierten hESCs mit einem inhärenten Potenzial für die Teratombildung stellt ein Sicherheitsrisiko dar, wenn man hESC-abgeleitete somatische Zellen für die Transplantation bei Patienten in Betracht zieht. Eine Überprüfung dieser und anderer Risiken im Zusammenhang mit der Zelltherapie finden Sie unter Sharpe et al. 16 Um solche Anwendungen zu realisieren, ist es daher unerlässlich, dass die Forscher Zielzellpopulationen erzeugen wollen, die auch pluripotente Stammzellfrei sind. Zu diesem Zweck zeigen wir hier, dass es mit unserer TG30/GCTM-2 FACS-Methodik möglich ist, das Vorhandensein von pluripotenten Zellen (TG30Hi-GCTM-2Hi) in einer differenzierenden Zellpopulation zu überwachen und tragfähige hESC-differenzierte Derivate zu erhalten, die nach FACS angereichert und rekultiviert werden können. Obwohl es nicht möglich ist, 100% pluripotente Stammzellfreie Proben mit einem einzigen Durchlauf unseres Protokolls zu erhalten, können angereicherte hESC-Derivate rekultiviert werden und nach aufeinanderfolgender Passierung wird 100% somatische Zellreinheit erreicht. Die nachgewiesene Lebensfähigkeit somatischer Zellen für die Expansion nach FACS ermöglicht möglicherweise auch die Produktion einer ausreichenden Anzahl von Zellen, die für potenzielle Transplantationstherapien geeignet sind.
Die ermutigenden Ergebnisse dieser Pilotstudie veranlassten uns, eine umfassendere Untersuchung mit unserem TG30/GCTM-2-Protokoll in einer vergleichenden Studie mit mehreren humaninduzierten pluripotenten Stammzelllinien (hiPSC)15durchzuführen. In dieser Studie fanden wir heraus, dass pluripotente Stammzellfreie Proben, die mit unserem TG30/GCTM-2 FACS-Protokoll gewonnen wurden, bei der Transplantation in immunbenachteiligte Mäuse keine Teratome erzeugten. Daher können wir getrost feststellen, dass mit der Verwendung dieses In-vitro-Protokolls, Frühstadium Differenzierung Zellkulturen bestimmt frei von pluripotenten TG30Hi-GCTM-2Hi-Zellen entwickeln teratomas in vivo. Dies unterstützt nachdrücklich die Robustheit unseres Assays und bietet einen potenziellen Ansatz, um das Risiko einer Teratombildung vor der Verwendung von hPSC-abgeleiteten Zellen in klinischen Anwendungen zu eliminieren.
Umgekehrt zeigen wir auch, dass der TG30/GCTM-2 FACS-Assay verwendet werden kann, um eine pluripotente Zellpopulation mit hohem Expressioniergrad dieser beiden Oberflächenantigene (TG30Hi-GCTM-2Hi) abzurufen. Frühere Studien haben gezeigt, dass TG30Hi-GCTM-2Hi-Zellen die höchste Korrelation mit OCT4hi Expression aufweisen und die höchste Anzahl von hESC-ähnlichen Kolonien5,6,13,15bilden. Wir gehen daher davon aus, dass das Pluripotenznetzwerk in TG30Hi-GCTM-2 Hi-Exemittenzellen auf seinen Höchstwerten aktiviert ist. Wir sind der Ansicht, dass die Verwendung unserer TG30/GCTM-2 FACS-Protokolle und das Abrufen von P7-Zellen (TG30Hi-GCTM-2Hi) eine großflächige Reinigung von angereicherten lebenden hESC-Kulturen als Inputs für Differenzierungstests ermöglichen könnte.
Zusammenfassend zeigen wir hier die Potenzialität unserer FACS-Assays basierend auf der kombinierten Expression der Oberflächenantigene TG30 und GCTM-2 sowohl für die Reinigung als auch für die Anreicherung von hESCs. Zukünftige Studien mit Protokollen zur gezielten Differenzierung von hPSCs dürften auch in Bezug auf diese Potenzialität informativ sein. Wir sind uns bewusst, dass in einigen Assays, in denen differenzierte hESC-Derivate vorübergehend TG30 (CD9) oder GCTM-2 ausdrücken, diese beiden Antikörper möglicherweise nicht geeignet oder ausreichend sind, um pluripotente Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt im Test6aus einer differenzierten Population zu säubern. Daher besteht die ständige Notwendigkeit, neuartige Antikörper zu finden, die lebende hESCs spezifisch erkennen, um die mögliche Begrenzung der Kreuzreaktion mit einigen differenzierten Zelltypen zu überwinden.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der StemCore-Einrichtung an der Monash University für die Bereitstellung von hESC-Linien und der FlowCore-Anlage an der Monash University für FACS-Dienstleistungen. Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien des Australian Stem Cell Centre, des New South Wales and Victorian Government Stem Cell Research Grant Program to ALL unterstützt. ALL ist Partner Investigator der Australian Research Council (ARC) Special Research Initiative in Stem Cell Science, Stem Cells Australia.
Materials
| Short Name | Company | Catalog Number | Long Name |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Long Name: Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | Long Name: GlutaMAX supplement |
| Nonessential Amino Acids | Life Technologies | 11140050 | Long Name: MEM Nonessential Amino Acids Solution |
| Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | Long Name: 2-Mercaptoethanol |
| DPBS | Life Technologies | 14190250 | Long Name: Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, no calcium, no magnesium |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604039 | Long Name: TrypLE Express (1x), no Phenol Red |
| AF-488 | Life Technologies | A21131 | Long Name: Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a |
| AF-647 | Life Technologies | A21238 | Long Name: Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgM |
| PE-anti IgG2a | Life Technologies | P21139 | Long Name: R-Phycoerythrin Goat Anti-Mouse IgG2a (γ2a) Conjugate |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | Long Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Long Name: Penicillin-Streptomycin, Liquid |
| Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Long Name: Sterile Distilled Water |
| PI | SIGMA | P4864 | Long Name: Propidium iodide solution |
| FBS | SIGMA | 12203C | Long Name: Fetal Bovine Serum |
| Gelatin | SIGMA | G-1890 | Long Name: Gelatin from porcine skin |
| Human FGF-2 | Millipore | GF003AF-100UG | Long Name: Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Long Name: Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized |
| 70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Long Name: Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
| 35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
| 5 ml Polystyrene round bottom test tube | Becton Dickinson | 352054 | Long Name: 5 ml polystyrene round bottom test tube, sterile |
| IgG2a Isotype Control | Becton Dickinson | 554126 | Long Name: Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control |
| IgM Isotype Control | Becton Dickinson | 553472 | Long Name: Purified Mouse IgM, κ Isotype Control |
| PE-CD90.2 | Becton Dickinson | 553014 | Long Name: PE Rat Anti-Mouse CD90.2 |
| 8-peaks calibration | Becton Dickinson | 559123 | Long Name: Rainbow Calibration Particles (8 peaks) |
| 50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | Long Name: 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | Long Name: CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
| TG30 | Merck Millipore | MAB4427 | Long Name: TG30 Antibody, clone TG30 |
| GCTM-2 | Merck Millipore | MAB4346 | Long Name: GCTM-2 is not commercially available but TG343 and equivalent monoclonal antibody is |
| Table 4. List of materials and reagent | |||
| [header] | |||
| FACS machine | Becton Dickinson | FACSVantage SE with FACSDiva option | |
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Table 5. List of equipment. |
References
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