El estudio de las interacciones de<em> Staphylococcus aureus</em> Con neutrófilos mediante citometría de flujo y microscopía Tiempo Lapso

Los neutrófilos (PMNs) son fagocitos profesionales que juegan un papel clave en la respuesta inmune innata contra Staphylococcus aureus ^1. La batalla constante entre el huésped y microbio ha llevado a una carrera de armamentos de ambos. Recientemente, cepas relacionadas con la comunidad (CA) de la meticilina resistente S. aureus (MRSA) se han comprobado que parece ser muy eficiente en la elusión de los neutrófilos muerte ^2,3. Modulina (MEP) soluble en fenol producción excesiva de CA-MRSA se ha asociado con una mayor virulencia ^4,5. Los neutrófilos humanos pueden reconocer estos MEP a través de FPR2 que conducen a la activación de esta proteína G-receptor acoplado a ^6. Uno de los acontecimientos más tempranos es la movilización de las reservas intracelulares de calcio ^{(Ca2 +).} Ca ^{2 +} actúa como un segundo mensajero para una variedad de funciones efectoras de los PMN incluyendo la desgranulación y la fagocitosis ^7. Por lo tanto Ca ^{2 +} es un indicador muy sensible de lacapacidad funcional de las MEP para activar PMNs. Para estudiar los efectos de las MEP sobre los neutrófilos, los neutrófilos frescas se aíslan y se cargan con un medio de contraste que emite fluorescencia en la movilización del calcio. En un experimento de citometría de flujo de esta rápida movilización se puede medir. El uso de este método, es posible estudiar los efectos directos de los componentes tóxicos y otro sobre los neutrófilos, y determinar la concentración más baja a la que éstos están activos. Para nosotros, es una herramienta muy útil para estudiar el efecto de muchas proteínas producidas por S. aureus implicado en la evasión inmune, como FPR2 proteína inhibidora (FLIPR) ^8, FLIPR-like ⁷ y quimiotaxis proteína inhibidora de Staphylococcus aureus (CHIPS) ^9. Todas estas proteínas se ha demostrado que inhiben la movilización de calcio en los neutrófilos por la unión al receptor que reconoce el agonista.

Recientemente, nuestro grupo ha descrito que las MEP son funcionalmente inhibidos por las lipoproteínas séricas de ^{10 <}/ Sup>. Estas lipoproteínas son abundantemente presente dentro de la sangre y el tejido humano, lo que indica que las MEP ejercen su función principalmente en el medio ambiente intracelular. La disponibilidad del ensayo de movilización de calcio nos permitió medir precisamente el efecto de las lipoproteínas séricas en la activación de neutrófilos por los MEP, indicado por la considerable inhibición por concentraciones muy bajas de suero.

Dado que los MEP están funcionalmente inhibidos por el suero, la hipótesis de que hay una función importante para las MEP como las toxinas intracelulares. Por lo tanto, trató de determinar el papel de las MEP después de la fagocitosis. Para investigar la expresión de los PSM en el espacio intercelular, hemos construido fusiones reportero del promotor del operón psmα a GFP. Cuando estos reportero cepas de S. aureus fueron fagocitadas por los neutrófilos, la inducción de la expresión se observa mediante microscopía de fluorescencia ^10. Obviamente, esta technique permite el estudio de la expresión de un gran número de genes en S. aureus u otros patógenos después de la fagocitosis. Dado que para S. aureus sobrevivir en el nicho intercelular es muy importante para superar el sistema inmune innato ^{11 10 12,} el estudio del papel de los genes activados en este nicho es altamente relevante para la comprensión de su virulencia.