Estudo das interacções de<em> Staphylococcus aureus</em> Com neutrófilos por citometria de fluxo e Time Lapse Microscopy
Summary
Nós apresentamos métodos para estudar o efeito de PSMs e outras toxinas segregadas por<em> Staphylococcus aureus</em> Em neutrófilos utilizando citometria de fluxo e microscopia de fluorescência.
Abstract
Nós apresentamos métodos para estudar o efeito de modulins solúveis fenol (PSMs) e outras toxinas produzidas e secretadas por Staphylococcus aureus, nos neutrófilos. Para estudar os efeitos dos PSMs de neutrófilos nos isolar neutrófilos frescos utilizando centrifugação em gradiente de densidade. Estes neutrófilos são carregadas com um corante que fluoresce na mobilização do cálcio. A activação dos neutrófilos por PSMs inicia um aumento rápido e transitório na concentração de cálcio intracelular livre. Numa experiência de citometria de fluxo, este rápido mobilização pode ser medida por monitorização da fluorescência de um corante pré-carregada, que reage com o aumento da concentração de Ca2 + livre. Usando esse método, podemos determinar a concentração PSM necessário para ativar os neutrófilos, e medir os efeitos de inibidores específicos e gerais da ativação de neutrófilos.
Para investigar a expressão dos PSMs no espaço intracelular, we foram construídas fusões repórter do promotor do operão PSMα para GFP. Quando essas cepas repórter de S. aureus são fagocitados pelos neutrófilos, a indução da expressão pode ser observada por meio de microscopia de fluorescência.
Introduction
Os neutrófilos (PMN) são fagócitos profissionais que desempenham um papel chave na resposta imune inata contra Staphylococcus aureus 1. A constante batalha entre o anfitrião eo micróbio levou a uma corrida armamentista de ambos. Recentemente, comunidade-associado (CA) das cepas de S. meticilina resistente aureus (MRSA) surgiram que parecem ser muito eficiente na neutralização de neutrófilos assassinato 2,3. Modulin produção excessiva solúvel fenol (PSMs) de MRSA-CA foi associada a uma maior virulência 4,5. Os neutrófilos humanos pode reconhecer estas PSMs através FPR2 que levam à activação deste acoplado à proteína G do receptor 6. Um dos primeiros eventos é a mobilização das reservas intracelulares de cálcio (Ca2 +). Ca 2 + actua como um mensageiro secundário para uma variedade de funções efectoras incluindo desgranulação de PMN e fagocitose 7. Portanto Ca2 + é um indicador muito sensível dacapacidade funcional dos PSMs para ativar PMNs. Para estudar os efeitos dos PSMs para os neutrófilos, os neutrófilos são isolados frescos e carregado com um corante que fluoresce na mobilização do cálcio. Numa experiência de citometria de fluxo, este rápido mobilização pode ser medido. Usando este método, é possível estudar os efeitos directos de componentes tóxicos e de outros para os neutrófilos, e determinar a concentração mais baixa à qual estes estão activas. Para nós, é uma ferramenta muito útil para estudar o efeito de muitas proteínas produzidas por S. aureus envolvidos na evasão imune, como FPR2 proteína inibidora (FLIPR) 8, FLIPR-like 7 e Quimiotaxia proteína inibidora de Staphylococcus aureus (CHIPS) 9. Todas estas proteínas foram mostradas para inibir a mobilização de cálcio no número de neutrófilos por ligação ao receptor que reconhece o agonista.
Recentemente, o nosso grupo descrito que os PSMs estão funcionalmente inibida por lipoproteínas séricas 10 </ Sup>. Estas lipoproteínas estão abundantemente presentes no sangue e no tecido humano, o que indica que os PSMs exercer a sua função, principalmente no meio intracelular. A disponibilidade do ensaio de mobilização do cálcio nos permitiu medir com precisão o efeito de lipoproteínas do soro sobre a activação dos neutrófilos por os PSMs, indicado pela inibição considerável por concentrações muito baixas de soro.
Uma vez que os PSMs estão funcionalmente inibida por soro, a hipótese de que existe uma função importante para os PSMs como toxinas intracelulares. Por isso, procuraram determinar o papel de PSMs após a fagocitose. Para investigar a expressão dos PSMs no espaço intercelular, construímos fusões repórter do promotor do operão psmα para GFP. Quando essas cepas repórter de S. aureus foram fagocitados pelos neutrófilos, indução de expressão foi observado por microscopia de fluorescência de 10. Obviamente, esta technique permite o estudo da expressão de um grande número de genes em S. aureus ou outros agentes patogénicos depois de fagocitose. Uma vez que para S. aureus sobreviver no nicho intercelular é muito importante para superar o sistema imune inato 11 10 12, estudando o papel dos genes ativados neste nicho é altamente relevante para a compreensão de sua virulência.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nos métodos aqui descritos alguns passos são muito crítico. Vamos destacar estes aqui.
Para o isolamento dos neutrófilos, por centrifugação em gradiente de densidade é importante para não perturbar as camadas, durante ou após os passos de centrifugação. Quando a aspiração dos neutrófilos utilizando uma pipeta de plástico, certifique-se de não apertar o balão, enquanto na camada de células, tal como ejectar líquido irá perturbar as camadas. Além disso, inspecione visualme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Fluo-3, AM | Molecular Probes / Life Technologies | F-1241 | |
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | density 1.077 g/ml |
| Histopaque | Sigma | 11191 | density 1.119 g/ml |
| RPMI 1640 | Gibco, Life Technologies | 52400-025 | contains 25 mM HEPES and L-glutamine |
| Leica TCS SP5 microscope | Leica Microsystems, The Netherlands | TCS SP5 | objective: HCX PL APO 40X/0.85 |
| FACSCalibur | BD Biosciences | FACSCalibur | Very important that the tube can be removed and replaced during the measurement process |
References
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