Lo studio delle interazioni di<em> Staphylococcus aureus</em> Con neutrofili mediante citometria a flusso e Time Lapse Microscopy

Neutrofili (PMN) sono fagociti professionali che svolgono un ruolo chiave nella risposta immunitaria innata contro Staphylococcus aureus ^1. La costante battaglia tra ospite e microbo ha portato a una corsa agli armamenti di entrambi. Recentemente, comunità-associati (CA) ceppi meticillino resistente S. aureus (MRSA) sono emerse, che sembra essere molto efficiente in elusione delle neutrofili uccisione ^2,3. Fenolo solubile modulin (PSM), eccessiva produzione di CA-MRSA è stato associato con una maggiore virulenza ^4,5. Neutrofili umani possono riconoscere questi PSMs via FPR2 che portano all'attivazione di tale G-proteina recettore accoppiato ^6. Uno dei primi eventi è la mobilitazione dei depositi intracellulari di calcio (Ca ^{2 +).} Ca ^{2 +} agisce come un messaggero secondario per una varietà di funzioni effettrici dei PMN compreso degranulazione e fagocitosi ^7. Pertanto Ca ^{2 +} è un indicatore molto sensibile dellacapacità funzionale del PSM per attivare PMN. Per studiare gli effetti di PSM su neutrofili, neutrofili freschi sono isolati e caricati con un colorante che reagisce su di mobilizzazione del calcio. In un esperimento di citometria a flusso questa rapida mobilitazione può essere misurata. Usando questo metodo, è possibile studiare gli effetti diretti di componenti tossici e di altro neutrofili, e determinare la concentrazione minima a cui essi sono attivi. Per noi, si tratta di uno strumento molto utile per studiare l'effetto di molte proteine ​​prodotte da S. aureus coinvolta in evasione immune, quali FPR2 proteina inibitoria (FLIPR) ^8, FLIPR-come ^7, e chemiotassi proteina inibitoria di Staphylococcus aureus (chips) ^9. Tutte queste proteine ​​hanno dimostrato di inibire la mobilizzazione del calcio in neutrofili legandosi al recettore che riconosce l'agonista.

Recentemente, il nostro gruppo ha descritto che PSM sono funzionalmente inibiti dalle lipoproteine ​​sieriche ^{10 <}/ Sup>. Queste lipoproteine ​​sono abbondantemente presenti nel sangue e tessuti umani, indicando che PSMs esercitano la loro funzione principalmente nell'ambiente intracellulare. La disponibilità del saggio mobilizzazione del calcio permesso di misurare con precisione l'effetto di lipoproteine ​​sieriche sull'attivazione dei neutrofili dai PSMs, indicata dalla notevole inibizione da concentrazioni molto basse di siero.

Poiché le PSMs sono funzionalmente inibiti dal siero, abbiamo ipotizzato che ci sia una funzione importante per PSMs come tossine intracellulari. Abbiamo quindi cercato di determinare il ruolo di PSM dopo la fagocitosi. Per studiare l'espressione dei PSMs nello spazio intercellulare, abbiamo costruito fusioni giornalista del promotore dell'operone psmα di GFP. Quando questi ceppi reporter di S. aureus sono stati fagocitati dai neutrofili, l'induzione dell'espressione era osservabile mediante microscopia a fluorescenza ^10. Ovviamente, questa technique consente di studiare l'espressione di un gran numero di geni in S. aureus o altri patogeni dopo fagocitosi. Poiché per S. aureus sopravvivendo nella nicchia intercellulare è molto importante per superare il sistema immune innato ^{11 10 12,} studiando il ruolo dei geni attivati ​​in questa nicchia è molto importante per comprendere la sua virulenza.